髮夾型核酸螢光探針及其在檢測鉛離子的應用的製作方法

2023-10-17 07:59:24 2

專利名稱：髮夾型核酸螢光探針及其在檢測鉛離子的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分析檢測技術領域，具體涉及基於髮夾核酸螢光探針構型的轉變檢測鉛離子。
背景技術：
重金屬原義是指比重大於5的金屬，包括金、銀、銅、鐵、鉛等，重金屬在人體中累積達到一定程度，會造成慢性中毒。對環境汙染和人體毒害最大的有5種鉛、汞、鉻、砷、鎘。這些重金屬在水中不能被分解，人飲用後毒性放大，與水中的其他毒素結合生成毒性更大的有機物或無機物。鉛，是重金屬汙染中毒性較大的一種，一但進入人體很難 排除。直接傷害人的腦細胞，特別是胎兒的神經板，可造成先天大腦溝回淺，智力低下；對老年人造成痴呆、腦死亡等。英國科學家研究表明，鉛可以縮短人的壽命，如果人類飲食鉛的含量為零，那麼人的壽命將過140歲。因此，鉛離子的快速靈敏檢測對人類健康和環境監測都有著十分重要的意義。傳統的檢測鉛離子的方法有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體法等，都可以有效地檢測鉛離子，但這些方法需要大型儀器，操作複雜，樣品的使用量大，無法進行痕量檢測，因此限制了其廣泛的應用。近幾十年來發展的檢測鉛離子的方法有比色法、電化學分析法、螢光分析法，這種方法靈敏度低，重現性差，一般很少採用；電化學分析法，雖然靈敏度較高，但耗時耗力，選擇性差，不利於快速檢測樣品；螢光分析法，靈敏度高，選擇性好，時間短，可以進行痕量檢測，因此得到廣泛應用。檢測鉛離子的螢光核酸探針越來越多，像8-17核酸酶，由H.Wang，Y. Kim,
H.P.Liu, Z.Zhu, S. Bamrungsap and ff. H.Tan, Engineering a UnimolecularDNA-Catalytic Probe for Single Lead Ion Monitoring, J. Am. Chem.Soc. ,2009,131 (23),8221-8226 公開；納米粒子由 F.Chai，C. Wang, T. Wang, L. Li, and Z. Su,Colorimetric Detection of Pb2+Using Glutathione Functionalized GoldNanoparticles, ACS AppI. Mater. Interfaces,2010,2 (5),1466-1470 公開；G4 核酸酶由 T.Li, S. Dong and E. Wang, A Lead (II)-Driven DNA Molecular Device for Turn-OnFluorescence Detection of Lead(II) Ion with High Selectivity and Sensitivity.J. Am. Chem. Soc.，2010，132 (38)，13156-13157公開。其中分子信標作為髮夾結構的螢光核酸探針，是一種極好的生物分子傳感器。分子信標技術具有極高的特異性，而且操作簡便、靈敏度高，特別是它可以進行實時定量檢測、甚至可以用於活體分析在臨床診斷、基因檢測等領域，分子信標也越來越顯示出它的優勢。但是一般的分子信標是雙標記的核酸探針，造成其成本高，應用受限。

發明內容
本發明所要解決的一個技術問題在於克服已有技術的缺點，提供一種識別性能好、特異性高、選擇性好、靈敏高的髮夾型核酸螢光探針。本發明所要解決的另一個技術問題在於為髮夾型核酸螢光探針提供一種新用途。解決上述技術問題所採用的技術方案是髮夾型核酸螢光探針的序列為5』 -FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3，。上述髮夾型核酸螢光探針的合成方法由下述步驟組成脫保護將預先連接在固相載體控制微孔玻璃上的活性基團被保護的核苷酸與12. IgmL三氯乙酸反應，脫去其5，-羥基的保護基團二甲氧基三苯甲基，獲得游離的5'-羥基。縮合合成DNA的原料-單體，與2. 9mL活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被二甲氧基三苯甲基保護，與溶液中游離的5'-羥基發生縮合反應。帶帽反應用乙酸酐和I-甲基咪唑終止其後繼續發生反應。氧化在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為磷酸三酯。
通過上述步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再重複以上步驟，直到所有要求合成的鹼基被連接上去。合成過程中可以觀察三氯乙酸處理階段的顏色判定合成效率。氨解通過氨水55°C處理，連接在控制微孔玻璃上的引物被切下來。純化切下來的寡核苷酸粗品用高效液相色譜純化手段進行純化，0D260定量及抽乾後對寡核苷酸進行分裝，即合成了該髮夾型核酸螢光探針。所合成的髮夾型核酸螢光探針在檢測鉛離子中的用途。其使用方法如下I、配製髮夾型核酸探針儲備液取33 μ g 序列為 5 』 -FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3，探針，加入 pH 為7. O、物質的量濃度為I. 0X10_2mol/L的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液35 μ L，配製成物質的量濃度為I. OX 10_4mol/L的髮夾型核酸探針儲備液，置於_20°C冰箱中，備用。2、退火髮夾型核酸探針溶液取1.0X10_4mol/L的髮夾型核酸探針溶液2yL，用L0X10_2mol/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液稀釋至I. OX 10-6mol/L作為探針母液，在水浴鍋中加熱到90°C，保持5分鐘進行熱處理，冷卻至室溫，放於4°C冰箱中過夜。3、配製待測樣品溶液a.打開水管放水20分鐘，量取自來水lOOmL，煮沸5分鐘去除氯，備用。b. 37°C，用I. 0X10_2mOl/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液將離體的人血清稀釋100倍。4、測定樣品a.配製鉛離子標準溶液按常規方法分別配製物質的量濃度為I. OX l(T4mol/L、I. 0Xl(T5mol/L、l· 0Xl(T6mol/L、l· 0Xl(T7mol/L 的鉛離子標準溶液。b.製作標準曲線取物質的量濃度為I. OX l(T2mol/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液98 μ L，取步驟2中I X 10_6mol/L的探針母液2 μ L，配製成探針最終濃度為2X10_8mOl/L的混合溶液，室溫靜置15分鐘，用螢光分光光度計檢測溶液的螢光強度Ftl ;在上述的混合溶液中逐級加入O. 5 μ L濃度為I. OX 10_7mol/L、0. 5 μ L濃度為I. 0Xl(T7mol/L、0. 4μ L 濃度為 I. O X l(T6mol/L、0. 5 μ L 濃度為 I. O X l(T6mol/L、0. 4 μ L 濃度為 I. 0Xl(T5mol/L、0. 5μ L 濃度為 I. O X l(T5mol/L、0. 4 μ L 濃度為 I. O X 10_4mol/L 的鉛離子標準溶液，得到最終鉛離子標準溶液的物質的量濃度為5X 10_1(lmOl/L、lX 10_9mol/L、5 X l(T9mol/L、I X l(T8mol/L、5 X l(T8mol/L、I X l(T7mol/L 和 5 X l(T7mol/L，室溫靜置 5 分鐘，用螢光分光光度計檢測溶液的螢光強度F，螢光分光光度計的激發波長為480nm、發射波長為520nm、激發波長和發射波長狹縫寬度均為10nm、負高壓為700V，以Ig濃度為5 X 10, 5X 10_7mol/L鉛離子溶液為橫坐標X，1-F/F0為縱坐標Y，由origin 7. 5軟體作圖，得到標準曲線的線性回歸方程 Y = O. 2005X+1. 8984線性相關係數為O. 9969。c.檢測樣品溶液中的鉛離子取物質的量濃度為I. OX 10_2mol/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液48 μ L和步驟2中I X 10_6mol/L的探針母液2 μ L，加入50 μ L水樣，混合均勻，靜置15分鐘，用螢光分光光度計檢測水樣的螢光強度，採用標準加入法進行鉛離子的回收。將步驟2中I X 10_6mol/L的探針母液2 μ L和I μ L離體的人血清加入到97 μ L物質的量濃度為I. OX 10_2mol/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液中，混合均勻，靜置15分鐘，用螢光分光光度計檢測血清的螢光強度，採用標準加入法進行鉛離子的回收，按下式計算鉛離子的回收率式中m ■是待測樣品中鉛的質量，m $是標準樣品中鉛的質量。本發明的有益效果如下I、本發明髮夾型核酸螢光探針用於檢測鉛離子的方法具有靈敏度高、選擇性好、檢測限低等優點。2、本發明所用試劑廉價，分析成本較低，且操作簡單、方便，有利於實際樣品的檢測，檢測速度快，僅需5分鐘。


圖I是髮夾型核酸螢光探針的圓二色譜圖。圖2是不同濃度鉛離子與髮夾型核酸螢光探針作用的螢光光譜圖。圖3是髮夾型核酸螢光探針對鉛離子的選擇性。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施例。實施例I髮夾型核酸螢光探針的序列為5』-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGG TGACGGGG-3，。該探針的合成方法如前所述。髮夾型核酸螢光探針在檢測水樣中鉛離子的用途，其使用方法如下I、配製髮夾型核酸探針儲備液取33yg 序列為 5』 -FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3，探針，加入 pH 為7. O、物質的量濃度為I. 0X10_2mol/L的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液35 μ L，配製成物質的量濃度為I. OX 10_4mOl/L的髮夾型核酸探針儲備液，置於-20°C冰箱中，備用；2、退火髮夾型核酸探針溶液取1.0X10_4mol/L的髮夾型核酸探針溶液2yL，用1.0X10_2mol/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液稀釋至I. OX 10-6mol/L作為探針母液，在水浴鍋中加熱到90°C，保持5分鐘進行熱處理，冷卻至室溫，放於4°C冰箱中過夜；3、配製待測樣品溶液打開水管放水20分鐘，量取自來水lOOmL，煮沸5分鐘去除氯，備用；4、測定樣品
a.配製鉛離子標準溶液按常規方法分別配製物質的量濃度為I. OX 10_4mol/L、l. OX 10_5mol/L、
I.OX l(T6mol/L、l. OX l(T7mol/L 的鉛離子標準溶液。b.製作標準曲線取物質的量濃度為1.0X10-2mol/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液98 μ L，取步驟2中I X 10_6mol/L的探針母液2 μ L，配製成探針最終濃度為2 X 10_8mol/L的混合溶液，室溫靜置15分鐘，用螢光分光光度計檢測溶液的螢光強度Ftl ;在上述的混合溶液中逐級加入O. 5 μ L濃度為L OX 10_7mol/L、0. 5 μ L濃度為L OX 10_7mol/L、0. 4 μ L濃度為 I. 0X10_6mol/L、0. 5μ L 濃度為 I. O X 10_6mol/L、0. 4 μ L 濃度為 I. 0X10_5mol/L、0. 5yL濃度為1.0X10_5mol/L、0. 4yL濃度為I. OX 10_4mol/L的鉛離子標準溶液，得到最終鉛離子標準溶液的物質的量濃度為5 X I Ο,πιο I /L、I X 10_9mO I /L、5 X 10_9mO I /L、IX l(T8mol/L、5X l(T8mol/L、lX l(T7mol/L 和 5 X l(T7mol/L，室溫靜置 5 分鐘，用螢光分光光度計檢測溶液的螢光強度F，螢光分光光度計的激發波長為480nm、發射波長為520nm、激發波長和發射波長狹縫寬度均為10nm、負高壓為700V，以Ig濃度為5 X 10, 5X liTmol/L鉛離子溶液為橫坐標X，1-F/F0為縱坐標Y,由origin 7. 5軟體作圖,得到標準曲線的線性回歸方程Υ = 0. 2005X+1. 8984線性相關係數為0. 9969。c.檢測水樣品溶液中的鉛離子取物質的量濃度為1.0X10_2mol/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液48 μ L和步驟2中I X 10_6mol/L的探針母液2 μ L，加入50 μ L水樣，混合均勻，靜置15分鐘，用螢光分光光度計檢測水樣的螢光強度，採用標準加入法進行鉛離子的回收。檢測和計算結果見表I。表I用髮夾型核酸探針檢測自來水中Pb2+含量
權利要求
1.一種髮夾型核酸螢光探針，其特徵在於該髮夾型核酸螢光探針的序列為5』-FAM-￡GTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3，。
2.權利要求I所述的髮夾型核酸螢光探針在檢測鉛離子中的用途。
3.按照權利要求2所述的髮夾型核酸螢光探針在檢測鉛離子中的用途，其特徵在於使用方法如下 (1)配製髮夾型核酸探針儲備液取 33 ii g 序列為 5』 -FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3，探針，加入 pH 為 7. O、物質的量濃度為I. OX 10_2mol/L的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液35 u L，配製成物質的量濃度為I. OX 10_4mol/L的髮夾型核酸探針儲備液，置於_20°C冰箱中，備用； (2)退火髮夾型核酸探針溶液 取I. 0 X lO-W/L的髮夾型核酸探針溶液2 ii L，用I. O X lO—W/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液稀釋至I. OX 10_6mol/L作為探針母液，在水浴鍋中加熱到90°C，保持5分鐘進行熱處理，冷卻至室溫，放於4°C冰箱中過夜； (3)配製待測樣品溶液 a.打開水管放水20分鐘，量取自來水lOOmL，煮沸5分鐘去除氯，備用； b.37°C，用1.0X10_2mol/L pH值為7. 0的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液將離體的人血清稀釋100倍； (4)測定樣品 a.配製鉛離子標準溶液按常規方法分別配製物質的量濃度為1.0Xl(T4mol/L、I. OX l(T5mol/L、l. OX l(T6mol/L、l. OX l(T7mol/L 的鉛離子標準溶液； b.製作標準曲線取物質的量濃度為1.0X10_2mol/LpH值為7.0的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液98 u L，取步驟(2)中I X 10_6mol/L的探針母液2 u L，配製成探針最終濃度為2X10_8mOl/L的混合溶液，室溫靜置15分鐘，用螢光分光光度計檢測溶液的螢光強度Ftl ;在上述的混合溶液中逐級加入0. 5 ii L濃度為I. OX 10_7mol/L、0. 5 u L濃度為I.0Xl(T7mol/L、0. L 濃度為 I. 0 X l(T6mol/L、0. 5 y L 濃度為 I. 0 X l(T6mol/L、0. 4 y L 濃度為 I. 0Xl(T5mol/L、0. L 濃度為 I. 0 X l(T5mol/L、0. 4 y L 濃度為 I. 0 X 10_4mol/L 的鉛離子標準溶液，得到最終鉛離子標準溶液的物質的量濃度為5X 10_1(lmOl/L、lX 10_9mol/L、5 X l(T9mol/L、I X l(T8mol/L、5 X l(T8mol/L、I X l(T7mol/L 和 5 X l(T7mol/L，室溫靜置 5 分鐘，用螢光分光光度計檢測溶液的螢光強度F，螢光分光光度計的激發波長為480nm、發射波長為520nm、激發波長和發射波長狹縫寬度均為10nm、負高壓為700V，以Ig濃度為5 X 10, 5X 10_7mol/L鉛離子溶液為橫坐標X，1-F/F0為縱坐標Y，由origin 7. 5軟體作圖，得到標準曲線的線性回歸方程Y = O. 2005X+1. 8984 線性相關係數為0. 9969。
c.檢測樣品溶液中的鉛離子取物質的量濃度為l.OXKrtiol/LpH值為7.0的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液48 ii L和步驟⑵中lX10_6mol/L的探針母液2iiL，加入50iiL水樣，混合均勻，靜置15分鐘，用螢光分光光度計檢測水樣的螢光強度，採用標準加入法進行鉛離子的回收； 將步驟⑵中I X 10_6mol/L的探針母液2 ii L和I ii L離體的人血清加入到97 y L物質的量濃度為I. OX 10_2mol/L pH值為7. O的三羥甲基氨基甲烷-醋酸緩衝溶液中，混合均勻，靜置15分鐘，用螢光分光光度計檢測血清的螢光強度，採用標準加入法進行鉛離子的回收，按下式計算鉛離子的回收率R%= m測/m實 式中是待測樣品中鉛的質量，是標準樣品中鉛的質量。
全文摘要
一種髮夾型核酸螢光探針，該髮夾型核酸螢光探針的序列為5』-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3』。髮夾型核酸螢光探針在檢測鉛離子中的用途，使用方法由配製髮夾型核酸探針儲備液、配製髮夾型核酸探針儲備液、配製待測樣品溶液、測定樣品步驟組成，通過檢測體系螢光強度的變化，能夠實現鉛離子的檢測。該方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡單、響應速度快、無需複雜儀器等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102703441SQ201210128619
公開日2012年10月3日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者王文紅, 趙毅娜, 金燕 申請人:陝西師範大學