紫杉醇在製備治療egfr-tki獲得性耐藥性藥物中的應用的製作方法
2023-10-17 16:09:29 2
專利名稱：紫杉醇在製備治療egfr-tki獲得性耐藥性藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及紫杉醇在製備治療非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥性藥物中的應用。
背景技術：
目前在腫瘤藥物治療過程中獲得性耐藥性成為世界難題，同時也是治療腫瘤無效的原因。EGFR-TKI藥物(厄洛替尼或吉非替尼)是晚期非小細胞肺癌治療中非常重要的靶向藥物，但其獲得性耐藥的出現限制了臨床的應用，因此需要積極探索獲得性耐藥的形成機制。EGFR-TKI藥物獲得性耐藥的機制目前仍未完全明確。已有的研究顯示，EGFR-TKI獲得性耐藥的產生可能主要與以下兩種機制有關繼發性外顯子T790M突變和MET繼發性擴增。目前I790M突變耐藥研究已取得較好的結果，而對MET擴增所導致耐藥的研究仍在探索中。MET癌基因信號擴增可致PI3K/AKT信號持續激活，活化的AKT可磷酸化它的下遊分子，從而促進細胞增殖、細胞運動和侵襲、抑制細胞凋亡和導致EGFR-TKI耐藥的產生。到目前為止，沒有特別有效的辦法解決EGFR-TKI獲得性耐藥性難題。本發明通過多年研究發現紫杉醇可以治療EGFR-TKI獲得性耐藥性發揮作用。
發明內容
發明目的
本發明提供了紫杉醇治療EGFR-TKI獲得性耐藥性方面提供新的治療方案或選擇，為將來治療提供新的思路和方法。
技術方案
紫杉醇在製備治療EGFR-TKI獲得性耐藥性藥物中的應用 有益效果
I、肺癌居全球腫瘤發病和癌症死亡率的第一位。吉非替尼和厄洛替尼在NSCLC中的療效經常受到獲得性耐藥的限制，而目前已知的獲得性耐藥的主要機制為第二代EGFRT790M突變和MET基因獲得性擴增。本發明表明，當出現EGFR-TKI獲得性耐藥後，紫杉醇可能逆轉其耐藥。也就是說對於那些已從厄洛替尼/吉非替尼治療中產生獲得獲得性耐藥性的非小細胞肺癌病人，經紫杉醇化療後，可以再次考慮使用厄洛替尼/吉非替尼治療，使得厄洛替尼/吉非替尼繼續發揮功能，同時紫杉醇也可以對腫瘤進行抑制，從而發揮迴轉耐藥性和協同作用。具體來說通過CCK-8和流式結果發現，紫杉醇可以抑制肺癌EGFR-TKI耐藥細胞株H1975、H820和A549增殖,並促進其凋亡。相關分析發現，腫瘤組織survivin表達與P-Akt表達成正相關。我們的Western blot結果提示紫杉醇作用後，H1975、PC-9和H820細胞MET、p-Akt, survivin蛋白的表達下調,而A549細胞未見三種蛋白表達,上述結果提示，H1975、PC-9和H820細胞凋亡與紫杉醇下調MET、p_Akt，survivin蛋白表達有關，A549細胞細胞耐藥有其他機制參與。我們用Real-time PCR的方法檢測了 4種肺癌細胞紫杉醇作用前後miR-1的表達，結果發現，紫杉醇作用後miR-1在H1975、PC-9和H820細胞中的表達均較前明顯升高，A549細胞中表達無明顯變化，提示EGFR-TKI獲得性耐藥細胞株出現凋亡與microRNA-1 (miR-1)表達上調有關。其中所述的microRNA-1 (miR-1)存在於大多數動物種系，特異性表達於心肌和骨骼肌細胞，通過作用於組蛋白去乙醯化酶4而促進成肌細胞分化，抑制細胞擴增。新近研究發現在支氣管上皮細胞中表達miR-1，在肺癌腫瘤組織及細胞中其表達較低，轉染miR-1後能夠逆轉肺癌細胞A549 and H1299的致瘤特性(包括生長、複製、遷移及腫瘤形成等)，伴隨誘導阿黴素對A549細胞誘發的凋亡；相反miR-1缺失會導致腫瘤細胞生長,提示miR-1在肺癌的發生、發展過程中發揮重要的抑癌基因的作用。
綜上所述，細胞實驗表明，紫杉醇對兩種對EGFR-TKI獲得性耐藥的肺癌細胞敏感，而對EGFR-TKI原發性耐藥的肺癌細胞無明顯作用，對臨床治療TKI耐藥的病人有指導意義，擴大了 EGFR-TKI的應用範圍。
圖I 為 IC50 濃度紫杉醇對H1975、PC-9、H820 和 A549 細胞MET、p_Akt, survivin蛋白表達的影響；
圖2. H1975、PC-9、H820和A549細胞中miR-1在IC50濃度紫杉醇作用前後的變化。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例I
I.細胞培養H1975細胞為EGFR L858R-I790M突變型，對EGFR-TKI耐藥；H820細胞具有MET擴增，對EGFR-TKI耐藥；A549細胞表達野生型EGFR基因，EGFR-TKI耐藥；PC_9系EGFR-TKI高度敏感細胞，上述H1975、H820、PC-9細胞購自ATCC (美國)，A549細胞由本實驗室保存。細胞培養應用RPMI-1640培養基(內含10% FBS、穀氨醯胺和青鏈黴索)傳代培養細胞株H1975、H820、A549、PC-9。在37°C、含5% C02的孵箱中進行細胞培養，每I 2天更換培養液I次。該四種細胞為貼壁細胞，當細胞生長到融合度為90%左右時，使用胰酶消化，並用吸管反覆吹打使其離開培養瓶底壁，然後離心收集。收集到的細胞一半用於提取RNA, —半用於提取蛋白。2、CCK-8法測細胞增殖抑制選擇對數生長期H1975、H820、A549和PC-9細胞，調整細胞數為2 X IO4個/mL接種於96孔培養板，每孔100 ill。24h後加入藥物(0，1，2，4，8，16，32nmol/L)。同時設陰性對照組(培養液中不加藥物)，空白對照組(加細胞不加培養液)。每組設5個復孔，在37°C、5% C02培養箱中培養48h。檢測時每孔加入CCK-8
10yl，溫育Ih後，于波長450nm酶標儀檢測吸光度(A)值。實驗重複3次並按下列公式計算腫瘤細胞抑制率，抑制率=(I-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)X 100%。實驗結果紫杉醇對H1975、H820、A549和PC-9細胞的生長抑制作用
不同濃度紫杉醇作用於肺癌H1975、H820、A549和PC-9細胞48h後，細胞生長明顯
抑制，呈現濃度依賴性，延長作用時間未見細胞生長抑制率有明顯提高。如表I所示。
濃度(nM)__1_2_4_8_16_32_IC50_
H1975_ 69. 44±3. 75 57. 11±3. 88 36. 12±2. 25 15. 69±1.37 10. 06±0. 902 4. 68±0. 40 3. 63±0. 559
H820_ 89. 58±4. 29 84. 2±4. 88 62. 85±4. 49 18. 29±1.52 8. 81±0. 86 1.98±0. 18 5. 05±0. 217
A549_ 72.89±3. 13 67. 6±4. 19 350. 74±3. 28 36. 37±2. 96 29. 75±2.89 14. 52±1.37 6. 124±0. 291
PC-9_81.84±4. 74 78. 71±5. 06 61. 04±2. 94 30. 68±2. 45 14. 85±1.33 7. 01±0. 65 5. 786±0. 258
表I紫杉醇作用後的細胞生存率及IC50
Fig I The effect of paclitaxel on proliferation of H1975， H820 ，A549 andPC-9 cells. H1975， H820 ，A549 and PC-9 cells were treated for 48 h wit h varyingconcentrations (0，1，2，4，8，16，32 nmol/L) of paclitaxel ；
CCK-8 法文獻依據 Shimamura T，Lowell AM，Engelman JAj et al. . Epidermalgrowth factor receptors harboring kinase domain mutations associatewith theheat shock protein 90 chaperone and are destabilized following exposure togeldanamycins[J] Cancer Res, 2005，65 (14):6401-8.
3、流式細胞術檢測細胞凋亡率將四種細胞分別分組為正常對照組，和紫杉醇處理組。用IC50濃度紫杉醇分別處理四種細胞，各細胞作用於紫杉醇48小時；每組重複3次。用不含EDTA的胰酶消化收集細胞(包括凋亡和壞死的細胞)，收集細胞總數約106個，並迅速加入I 2ml含小牛的血清培養液中和胰酶(購自GIBCO公司，美國)。IOOOrpm離心3min，棄上清，PBS重懸，離心2次。加入500ul的Binding Buffer (購自BIPEC公司，美國)懸浮細胞；加入 5ul Annexin V-FITC(購自 BIPEC 公司，美國)混勻後，加入 5ul Propidium Iodine(購自BIPEC公司，美國)，混勻。室溫避光反應15min。I小時內上流式細胞儀檢測凋亡率。用未經凋亡誘導處理的正常細胞作為螢光補償調節。實驗結果流式細胞術檢測細胞凋亡率
IC50濃度紫杉醇作用於H1975、H820、A549和PC-9細胞48h後的凋亡率結果，如表2所示，紫杉醇可促進H1975、H820、A549和PC-9細胞凋亡。
組別|H1975IH820IA549I PC-9
紫杉醇處理組 34. 99±0. 135 18. 22±2. 517_ 32. 38±3. 165 64. 35±2. 438 '
對照組丨5.29±0.147 丨4.32±0.074 丨4. 74±0.069 丨3. 35±0.083。表2. IC50濃度紫杉醇處理後的細胞凋亡率。Fig 2 Effect of paclitaxel on induction of apoptosis in H1975, PC-9 ,H820 and A549 cells. Cells were treated with paclitaxel at the concentration ofIC50 for up to 48 h.
4、蛋白提取和Westernblot H1975、H820、A549和PC_9細胞於IC50濃度紫杉醇處理48後小時，棄去培養液，用冰PBS [IOnmoI/L, PH7. 45 ]清洗兩次。加入冰細胞裂解液[50 mmol /T, Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, I mmol/L EGTA, I mmol/L EDTA, 20 mmol /L NaF,0. 5% NP 40，1% Triton X-100，I mmol/L PMSF，臨用前新鮮加入 sigma 公司的蛋白酶抑制劑I]，置於冰上裂解5分鐘。收集細胞，置於離心管中，4°C下12000 r / min離心20分鐘。收集上清，BCA試劑盒(購自碧雲天公司，中國)測定蛋白含量，加入5X上樣緩衝液(Loading Buffer)使成IX。樣品於_80°C凍存。用於Western blot實驗,取30iig蛋白於7. 5%、10%和12. 3%分離膠上電泳，轉膜至0. 22或0. 45 ii m的PVDF膜。膜上非特異性的位點用封閉液(5%脫脂奶粉或BSA，l%Tween-20的20 mmol/L的TBS溶液)室溫下封閉2h，單克隆一抗(購自Cell Signaling Technology公司，美國)4°C孵育過夜。TBST溶液清洗4次，每次10分鐘，加入辣根過氧化物酶標記的抗小鼠二抗(購自北京中杉公司，中國)室溫下孵育2h。暗室內用ECL試劑盒顯影，待蛋白條帶顯色清晰時，終止反應，曝光洗片。實驗結果紫杉醇對H1975、PC-9、H820 和 A549 細胞 MET、p_Akt、survivin 蛋白表達的調節
用Western blot檢測H1975、PC_9、H820和A549細胞用IC50濃度紫杉醇前後MET、p-Akt、survivin 蛋白的表達，結果顯示(如圖 I) H1975、PC-9 和 H820 細胞 MET、p-Akt、survivin蛋白，經紫杉醇處理後,表達量下降明顯,而A549細胞未見三種蛋白表達。H1975、PC-9、H820三株肺癌細胞中MET、survivin蛋白表達和Akt磷酸化水平呈明顯正相關Cr彡0.997, P < 0. 05) , Akt磷酸化水平愈高，MET、survivin蛋白表達愈高，反之亦然。5、Real-time PCR 應用Trizol提取總RNA0紫外分光光度計測0. D值，計算RNA的濃度。下面所有試劑或試劑盒均為ABI (AppliedBiosystems, USA)公司產品，將RNA用RT試劑盒(P/N 4366596)在ABI Prism 7900HT系統中反轉成cDNA。cDNA在特異的TaqMan 探針 hsa-miR-1 (P/N: 4373090)和內參 U6 (P/N: 4373381)的參與下被進行定量檢測。數據運用公式RQ=2_ AA Ct進行分析，每種樣本均經過3次獨立實驗驗證。統計學方法每次實驗重複三次以上，數據資料用均數土標準差(土s)表示，用SPSS16. 0進行統計學處理，P<0. 05表示差異有統計學意義。
權利要求
1.紫杉醇在製備治療EGFR-TKI獲得性耐藥性藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及本發明涉及紫杉醇在製備治療非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥性藥物中的應用。肺癌居全球腫瘤發病和癌症死亡率的第一位。吉非替尼和厄洛替尼在NSCLC中的療效經常受到獲得性耐藥的限制，而目前已知的獲得性耐藥的主要機制為第二代EGFRT790M突變和MET基因獲得性擴增。本發明表明，當出現EGFR-TKI獲得性耐藥後，紫杉醇可能逆轉其耐藥。也就是說對於那些已從厄洛替尼/吉非替尼治療中產生獲得獲得性耐藥性的非小細胞肺癌病人，經紫杉醇化療後，可以再次考慮使用厄洛替尼/吉非替尼治療，使得厄洛替尼/吉非替尼繼續發揮功能，同時紫杉醇也可以對腫瘤進行抑制，從而發揮迴轉耐藥性和協同作用。
文檔編號A61P35/00GK102626405SQ20121008151
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者束永前, 王萱怡, 郭人花, 金時代 申請人:江蘇省人民醫院