新的肌肉生長調節物的製作方法

2023-09-25 03:28:45

專利名稱：新的肌肉生長調節物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種與調節肌肉生長有關的新的蛋白以及該新蛋白在調節或促進肌肉生長和治療與肌肉生長或肌肉萎縮(muscle wasting)相關的疾病中的用途。
背景技術：
肌肉組織包括大的、多核細胞。這些細胞中的大部分，大約三分之二，是肌原纖維(myofiril)或可收縮性單元(contractile unit)。肌原纖維由肌球蛋白粗肌絲(myosin th)和肌動蛋白細肌絲(actin thin filament)組成。
肌細胞的發育開始於成肌細胞或前體細胞。成肌細胞經過分化和融合過程形成肌管，其隨後進一步分化成為肌纖維。
蛋白肌肉抑制素(myostatin)(或生長分化因子8)被認為是一種調節肌肉生長和發育的主要因子。肌肉抑制素表現出對肌肉生長的負調節(Kambadur等1997)。已顯示肌肉抑制素中11bp的缺失在牛中導致Belgian Blue(比利時藍)(或雙肌(double-muscled))表型。Belgian Blue牛在肌肉重量上增加了20％到30％。
肌肉抑制素延緩肌肉生長的準確機理仍然有待闡明。
在長時間的停止使用(如臥床休息、太空飛行)的過程中，或者在肌肉萎縮疾病(如肌肉營養不良)的情況下，骨骼肌發生萎縮，其主要是由於肌蛋白的降解增強以及蛋白合成的減少。杜興肌營養不良(Duchenne musculardystrophy)是肌肉營養不良的最常見的形式之一。肌纖維發生壞死(necrosis)並且喪失了再生的能力。最近在mdx小鼠中顯示，一種杜興肌營養不良模型，肌肉無法再生是由於衛星細胞的衰竭，更確切的說是纖維化所導致的。肌肉減少症(sarcopenia)是與正常的年齡增長相關的肌肉重量和性能的降低。骨骼肌仍然能夠自我再生但是顯示老年肌肉中的環境對肌肉衛星細胞的活化、增殖和分化的支持較差。
許多生長因子涉及調節新生兒的骨骼肌生長和發育，例如IGF、HGF和FGF。沒有已知的生長因子對骨骼肌的發育具有比肌肉抑制素(GDF-8)更強的負效果。肌肉抑制素或生長和分化因子8(GDF-8)首先在小鼠中被表徵。無肌肉抑制素小鼠顯示顯著增加的肌肉發育，比野生型小鼠重2到3倍。顯示肌肉重量的增加是由於肌肉增生(hyperplasia)和肥大(hypertrophy)。這些數據表明肌肉抑制素在控制肌肉重量中具有重要的作用以及肌肉抑制素是肌肉生長的強的負調節劑。
因此，識別其它涉及調節肌肉生長的因子，包括能夠促進肌肉生長的因子是有益的。至今，沒有鑑定出更多的能夠調節肌肉生長的因子。
發明概述本發明是基於與促進肌肉生長有關的多肽的識別。該肌肉生長促進物被稱為「mighty」。術語mighty在整個說明書中使用以表示本發明所述的新的肌肉生長促進物。
本發明還基於編碼mighty蛋白的DNA和相應的mighty基因啟動子的鑑定。
本發明提供含有選自SeQ ID No2或SEQ ID No4的序列的多肽。
本發明還提供多核苷酸序列，其編碼含有選自SeQ ID No2或SEQ ID No4的序列的多肽。該多核苷酸序列包括選自SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的序列。
本發明還提供多核苷酸，其含有選自下列的核苷酸序列a)SEQ ID No1或SEQ ID No3的互補序列，b)SEQ ID No1或SEQ ID No3的反向互補序列，和c)SEQ ID No1或SEQ ID No3的反向序列。
本發明的多核苷酸包含由於沉默取代或導致所產生胺基酸中保守取代的取代，而與SEQ ID No1或3不同的核苷酸序列。
本發明的多肽包括由本發明所述多核苷酸編碼的多肽。還提供含有至少一個多肽或其片段的融合蛋白。
本發明還提供一種或多種含有本發明序列的載體，以及一種或多種含有該載體的宿主細胞。該載體沿5』-3』方向含有a)基因啟動子序列；b)本發明所述的多核苷酸序列；和c)基因終止序列。該多核苷酸可以處於有義或反義方向。
本發明還提供調節肌肉生長的組合物。
一方面，該組合物包含下述任意一個a)包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸，b)(a)的片段或變體，c)與(a)有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，d)(a)到(c)中任意一個的互補序列，e)(a)到(c)中任意一個的反向互補序列，f)(a)到(c)中任意一個的反義多核苷酸，g)由(a)到(c)中任意一個編碼的多肽，h)包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽，i)(g)或(h)的片段或變體，和j)相對(g)或(h)有至少95％，90％或70％序列同一性的多肽。
在另一方面，組合物可以包含mighty基因啟動子，其包括SEQ ID No.5的序列、與SEQ ID No.5有至少95％、90％或70％同一性的多核苷酸、或其片段或變體。
在又一方面，組合物可以包含mighty基因表達或mighty蛋白活性的調節物。
mighty基因表達或mighty蛋白活性的調節物可以特異地結合於選自下列任意一個的多核苷酸a)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5，b)編碼SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸，c)與(a)或(b)有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，d)(a)到(c)中任意一個的互補序列，e)(a)到(c)中任意一個的反向互補序列，和f)(a)到(e)中任意一個的片段或變體。
mighty基因表達的調節物可以是反義多核苷酸。mighty基因表達的調節物也可以是幹擾RNA分子。具體地，mighty基因表達的調節物可以是RNAi或siRNA分子。
調節物也可以是肌肉抑制素或肌肉抑制素的模擬物(mimetic)。該模擬物可以是C-末端在胺基酸位置330和350或兩者之間截斷的肌肉抑制素肽。該截斷可以在330、335或350的任意一個位置。
在另一方面，本發明的組合物可以用於治療或預防與肌肉生長相關的疾病。該疾病可以是導致肌肉萎縮(muscle atrophy)的疾病。該疾病可以選自肌營養不良(muscular dystrophy)、肌肉惡病(muscle cachexia)、萎縮、肥大、與癌症或HIV有關的肌肉萎縮、肌萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis)(ALS)或與心肌生長相關的疾病，包括梗死(infarct)。該組合物還可以用於在肌肉損傷後促進肌肉再生。
本發明還提供使用本發明所述的組合物調節或促進肌肉生長、治療或預防與肌肉生長或損傷後肌肉再生相關的疾病的方法。該方法可用於生產具有增加的肌肉重量的動物。
本發明的組合物還可以被用於生產調節肌肉生長、治療或預防與肌肉生長或損傷後肌肉再生相關的疾病的藥物。
本發明還提供用本發明所述的組合物轉染的轉基因動物。該轉基因動物可以導致具有增加的肌肉重量的動物。該轉基因動物可以選自綿羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠、魚或人。
本發明還提供預測動物肌肉重量的方法，其包括如下步驟i)從動物中獲得樣品，ii)測定具有序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸、與SEQ IDNo.1或SEQ ID No.3有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體的基因表達水平；或測定具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽、或其片段或變體的量。
iii)將基因表達水平或多肽的量與平均值進行比較；和iv)預測所述動物的肌肉重量。
基因表達水平可以使用RTPCR或northern分析進行測定。多肽可以使用ELISA或Western印跡分析進行測定。
在另一方面，本發明提供了檢測mighty變體的方法，其包括使用選自下列的核苷酸序列a)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5，b)編碼SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸，c)與(a)或(b)有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，d)(a)到(c)中任意一個的互補序列，
e)(a)到(c)中任意一個的反向互補序列，和f)(a)到(e)中任意一個的片段或變體，以從來自生物體的樣品中篩選mighty的變體。
mighty的變體可以是多態性(polymorphism)的，尤其可以是單核苷酸多態性的。mighty變體也可以與改變的肌肉表型相關。
本發明還提供改善動物肌肉重量的方法，其包括如下步驟i)選擇一個或多個根據本發明預測具有增加的肌肉重量的動物，和ii)繁殖一個或多個預測具有增加的肌肉重量的動物以產生具有改善的肌肉重量的動物。
本發明所述的動物可以選自綿羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠、魚或人。
本發明還提供抗體，其優先結合具有序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的多肽或與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽。
本發明還提供具有序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的多肽的抗原性片段在生產抗體中的應用，所述抗體優先結合具有序列SEQ ID NO.2或SEQID NO.4的多肽或與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽。
本發明還提供含有序列SEQ ID No5的分離的多核苷酸，其含有鼠類mighty基因的啟動子區域，與SEQ ID No5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，或其片段或變體。
片段可以包含mighty起始位點上遊至少200個核苷酸，可以包含mighty起始位點上遊209、287、315、400、600、1000和2100個核苷酸中任意一個。
本發明還提供一種或多種載體，其含有SEQ ID No.5的多核苷酸、與SEQID No.5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體，以及一種或多種含有該載體的宿主細胞。
本發明還提供篩選一種或多種在抑制或促進肌肉生長中潛在有效的化合物的方法，其包括如下步驟i)將具有序列SEQ ID No5的多核苷酸、與SEQ ID No.5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體插入到連接有合適的標記基因的合適的載體中；
ii)用該載體轉化合適的宿主細胞；iii)對該宿主細胞施用感興趣的化合物；和iv)測定標記基因表達水平的任何差異。
載體可以包括任何合適的載體，而且可以包括原核質粒、真核質粒或病毒載體。標記基因可以包括任何合適的標記基因，而且可以包括編碼綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、螢光素酶或β-半乳糖苷酶的多核苷酸。
本發明還提供在肌細胞中表達所需蛋白的方法，其包括如下步驟i)分離編碼待表達的基因的多核苷酸序列；ii)將具有序列SEQ ID No5的多核苷酸、或與SEQ ID No.5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體插入到載體中，其沿5』-3』的方向與待表達的蛋白的多核苷酸序列可操作地相連，和iii)將載體導入肌肉宿主細胞。
載體可以包括真核載體、病毒載體或任何適於基因治療的載體。
宿主細胞可以包括原代成肌細胞系、轉化的成肌細胞系或mighty啟動子在其中有活性的任何細胞系。宿主細胞還可以包括宿主動物的體內骨骼肌或心肌細胞。
宿主動物可以包括綿羊、母牛、鹿、公牛、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠、魚或人。
定義術語「多核苷酸」是應當理解為脫氧核糖核酸或核糖核酸的聚合物，包括單鏈和雙鏈聚合物，包括DNA、RNA、cDNA、基因組DNA、重組DNA和多核苷酸的所有其它已知形式。多核苷酸可以是從天然來源中分離的、使用重組或分子生物學技術產生的、或者合成產生的。多核苷酸可以包括整個基因或其任意部分，並且不是必須具有開放讀碼框。
本發明的所有多核苷酸的使用都包括任意或所有的開放讀碼框。開放讀碼框可以使用本領域已知的技術構建。這些技術包括分析序列以鑑定已知的起始和終止密碼子。許多能夠實現該功能的計算機軟體程序在本領域是公知的。
術語「多肽」應當理解為共價連接的胺基酸的聚合物。多肽包括從天然來源中分離的多肽、使用重組技術生產的多肽、或合成生產的多肽。可意識到的是含有在體外被切除的前導序列或前序列的多肽、或含有連接物或任何其它序列的多肽、或經過翻譯後修飾的多肽被確定涵蓋在多肽的定義中。
術語「片段或變體」應當理解為任何部分序列或通過取代、插入或缺失一個或多個核苷酸或一個或多個胺基酸殘基而修飾的序列，但是其具有基本相同的活性。
多核苷酸片段還包括足夠長並且其在嚴格條件下特異性地與SEQ ID No1或SEQ ID No3的序列雜交的多核苷酸片段。「嚴格條件」的例子包括用5XSSC，0.2％SDS在65℃預雜交；在65℃於5X SSC，0.2％SDS中雜交過夜；用1X SSC，0.1％SDS在65℃洗滌兩次，每次30分鐘；而後進一步用0.2X SSC，0.1％SDS在65℃洗滌兩次，仍然是每次30分鐘。
多肽片段還包括保留有mighty蛋白活性的片段。該片段可以具有增強的活性並且因此，當導入或在細胞中表達時，導致mighty蛋白活性的增加。可選地，片段可以具有顯著的負效果。
「Mighty基因」被定義為SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的多核苷酸，或與SEQ ID No.1或SEQ ID No.3有95％、90％或70％同一性的多核苷酸或其片段。
「基因表達」被定義為轉錄的起始、mighty基因轉錄為mRNA以及mRNA翻譯為多肽。「mighty基因表達的調節物」被定義為任何能夠導致mighty基因表達增加或減少的化合物。
「Mighty蛋白」被定義為具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有95％、90％或70％同一性的多肽、或其片段或變體。
「Mighty蛋白活性」被定義為mighty蛋白刺激肌肉生長的能力。
「肌肉生長」被定義為肌細胞的分裂和/或分化並且包括任何肌肉前體細胞的分裂和/或分化。
「mighty蛋白活性的調節物」被定義為能夠增加或降低mighty蛋白活性的化合物。
「mighty基因啟動子」被定義為SEQ ID No.5的多核苷酸，與SEQ ID No.5有95％、90％或70％同一性的多核苷酸、或其片段或變體。
通過如下僅作為實例給出的附圖及說明，本發明的其它方面將顯而易見。


本發明現在通過例示的方式僅參考下列附圖進行說明圖1顯示來自雙肌牛和正常肌肉的牛的mighty的PCR擴增結果。
圖2(A)顯示來自正常肌肉的牛(wt，泳道1)和雙肌表型(BB，泳道2)的心臟組織的mighty的PCR擴增結果。(B)顯示來自羊骨骼肌(泳道4)的mighty的PCR擴增結果。
圖3(A)和(B)顯示mighty啟動子序列和鑑定的轉錄因子結合位點。
圖4顯示成肌細胞C2C12細胞增殖中mighty的表達結果。
圖5顯示以MHC抗體對對照和mighty過表達肌管的免疫染色。
圖6顯示活躍生長的C2C12克隆7和11和lacZ對照的測量結果，測量是通過(A)細胞面積的定量顯像分析。(B)FACScan流式細胞術測量前向角光散射(forward angle light scatter)(FALS)(在克隆7和克隆11中觀察到的右移表明了細胞尺寸的增大)以及通過定量顯像分析測量的含3個核的肌管的長度(C)、寬度(D)和面積(E)。
圖7顯示(A)將mighty過表達的C2C12克隆7和11、和對照的C2C12成肌細胞在分化培養基(DMEM 2％HS)中培養48、60和72小時。固定成肌細胞並用抗MHC抗體免疫染色，用Gills蘇木精(Gills haematoxylin)輕微復染。(B)mighty過表達的C2C12克隆7和11、和對照C2C12的Western印跡分析。成肌細胞在分化培養基(DMEM 2％HS)中培養0、24、48和72小時。從細胞中提取的總蛋白(15μg)用4-12％的SDS-PAGE分析，轉移到硝化纖維素濾膜，並用小鼠單克隆抗p21、兔多克隆抗MyoD或小鼠單克隆抗MHC抗體為探針探測。濾膜還用小鼠單克隆抗-α-微管蛋白抗體為探針探測以表明相等的加載(equal loading)。
圖8顯示在靜止(quiescent)和活性衛星細胞中mighty蛋白的檢測。來自靜止和活性衛星細胞的蛋白用SDS-PAGE分析並轉移到硝化纖維素濾膜。通過兔抗mighty抗體檢測mighty蛋白。在活性衛星細胞中可檢測到mighty蛋白，但是在靜止衛星細胞沒有檢測到。
圖9顯示在骨骼肌再生的過程中mighty的表達。將虎蛇毒素(Notexin)注射到TA肌肉中以誘導肌肉損傷並且收集在損傷後第0、1、5、14和28天的TA肌肉以進行mighty的免疫組織化學檢測。(A)在第0天的無損傷對照TA肌肉。(B)損傷後第1天。(C)損傷後第5天。(D)損傷後第7天。(G)損傷後第28天。綠色，Mighty；藍色，DNA。
圖10顯示在梗死形成後(post-infarction)的心臟組織中mighty的表達。進行在未梗死(第0天)和梗死形成後(第2天和第6天)的心臟組織中mighty的免疫組織化學檢測。(A)未梗死對照心臟組織。B)梗死形成後第2天。(C)梗塞形成後第6天。
圖11顯示在mighty和對照轉染的人成肌細胞中MHC陽性肌管的數量。人成肌細胞用mighty-pcDNA3或僅用pcDNA3(對照)轉染，在分化條件下培養12個小時。然後進行肌管中肌球蛋白重鏈(MHC)表達的免疫組織化學(ICC)。以穿過整孔的間隔拍攝連續無重疊的照片，並且計數MHC陽性肌管/孔的數目。
圖12顯示(A)每個肌管的肌核(myonuclei)頻率和(B)含有5，6，7，8和9個肌核的肌管寬度。用mighty-pcDNA3或僅用pcDNA3(對照)轉染人成肌細胞，在分化條件下培養12h，並進行用於MHC表達的ICC。測量含有5，6，7，8和9個肌核(n＝53)的MHC陽性肌管的最大寬度。
圖13顯示在條件培養基處理的人成肌細胞中肌核/MHC陽性肌管的數量。用來自mighty穩定轉染的C2C12細胞或LacZ(對照)轉染的C2C12細胞的條件培養基處理人成肌細胞。細胞用條件培養基培養48h，然後進行MHC表達的ICC。在每顯微區域(n＝245個肌管)的5個肌管中計數肌核/MHC陽性肌管的數量。(A)具有1-3，4-6，和7-9個肌核的肌管的數量。(B)肌核/肌管的平均數。
圖14顯示條件培養基處理的含有8個肌核的肌管的寬度。用來自mighty穩定轉染的C2C12細胞或LacZ(對照)轉染的C2C12細胞的條件培養基處理人成肌細胞。細胞用條件培養基培養48h，然後進行用於MHC表達的ICC。測量含有8個肌核的MHC陽性肌管的最大寬度。
圖15顯示在條件培養基處理的人橫紋肌肉瘤(RD)細胞中MHC陽性肌管的數量。用來自mighty穩定轉染的C2C12細胞或LacZ(對照)轉染的C2C12細胞的條件培養基處理人RD細胞。細胞用條件培養基培養72h，然後進行用於MHC表達的ICC。計數MHC陽性肌管/孔的數目。
圖16顯示鼠類mighty啟動子在各種細胞系中具有活性。將(A)C2C12成肌細胞、原代羊成肌細胞、NIH3T3成纖維細胞、中華倉鼠卵巢(CHO)和(B)人RD(橫紋肌肉瘤)細胞用1kb mighty啟動子/報導基因構建體瞬間轉染24小時。然後在生長或分化培養基中進一步培養24個小時。測定螢光素酶活性並根據來自共轉染的pCH110的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性進行標準化。
圖17顯示mighty啟動子被肌肉抑制素劑量依賴性地抑制。C2C12成肌細胞被用方法中所述的1kb啟動子瞬間轉染。轉染後24小時，細胞在生長培養基中用4和8μg/ml的重組肌肉抑制素處理。處理24小時後收穫細胞。根據β-半乳糖苷酶活性標準化螢光素酶活性。
圖18顯示肌肉抑制素模擬物(myostatin mimetics)能回復(rescue)肌肉抑制素介導的mighty啟動子抑制。X-軸是根據β-半乳糖苷酶活性標準化的mighty啟動子的相對螢光素酶活性。Ctrl條表示對照羊成肌細胞；wt條表示用野生型肌肉抑制素(3μg)處理的羊成肌細胞；335條表示用15μg肌肉抑制素模擬物335處理的羊成肌細胞；335+wt表示用3μg肌肉抑制素和15μg肌肉抑制素模擬物處理的羊成肌細胞。
圖19.顯示mighty基因上遊片段的啟動子活性。C2C12成肌細胞用方法中所述的啟動子片段報導基因構建體瞬間轉染。然後在生長或分化培養基中進一步培養24小時。測定螢光素酶活性並根據來自共轉染的pCH110的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性進行標準化。
圖20顯示抗mighty蛋白抗體的應用。泳道表示M，標記；1，由肽特異性的mighty抗體識別的純化的重組小鼠mighty蛋白；2，由牛蛋白抗體識別的純化的重組牛mighty蛋白；3，從誘導mighty表達的含有mighty表達質粒的大腸桿菌細胞中提取的蛋白(使用牛蛋白抗體)；和4，從含有mighty表達質粒(未誘導)的大腸桿菌細胞中提取的蛋白(使用牛蛋白抗體)。
發明詳述本發明基於涉及肌肉發育和再生的新蛋白。該蛋白稱為「mighty」。
已從羊(SEQ ID No1)和牛(SEQ ID No3)中鑑定並克隆了Mighty基因。在一個方面，本發明提供了從牛和綿羊中分離的mighty多核苷酸。具體地，本發明提供來自羊，SEQ ID No.1，和牛的SEQ ID No.3的多核苷酸序列，其包括反義多核苷酸和可操作的反義片段。
本發明還提供從牛和羊分離的多肽序列。具體地，本發明提供來自羊，SEQ ID No.2和牛SEQ ID No.4的多肽，以及編碼SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸。
可以理解，多核苷酸由於遺傳編碼的冗餘可以包含沉默取代或在所得的胺基酸中導致保守取代的取代。此外，還預期基本上沒改變蛋白活性的本發明的多核苷酸和多肽的片段和變體。
本發明還提供含有本發明多核苷酸的載體。使用載體儲存(store)、複製和表達多核苷酸序列是本領域公知的。一般載體包括，以5』-3』方向基因啟動子序列、本發明的多核苷酸序列、和基因終止序列。載體意指包括將本發明的序列併入質粒和/或病毒中以幫助在宿主細胞中導入和/或保持序列。宿主細胞可以包括原核或真核細胞。真核細胞可以是體內的，或可以是原代或轉化的細胞系。
本發明人已顯示mighty蛋白在雙肌的牛中高表達(參見圖1和圖2)，其表明mighty在促進肌肉生長中發揮作用。還顯示Mighty上調成肌細胞C2C12細胞的生長，其確定了mighty在促進肌肉生長中的作用(圖4)。對過表達mighty的C2C12細胞的進一步研究顯示mighty誘導肌細胞的肥大。這通過過表達mighty的細胞中核數量的增加(圖5)和細胞尺寸的增大(圖6)表明。此外，如圖7所示，過表達mighty的C2C12細胞比對照細胞更早分化。原代成肌細胞(活性衛星細胞)也顯示出比衛星細胞(靜止細胞)具有更高水平的mighty。
這些結果證實了mighty在肌肉生長和發育中的作用，並且表明mighty可以用於調節或促進肌肉生長和發育。Mighty提供了用於生產具有增加的肌肉重量的動物的有用工具，其具有農業效益。另外，mighty提供了用於治療與肌肉生長和尤其是與肌肉萎縮相關的疾病的組合物開發。所述疾病包括，但不限於肌營養不良、肌肉惡病、萎縮、肥大、與癌症或HIV有關的肌肉萎縮、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)或與心肌生長相關的疾病，包括梗死。
因此包括用於調節肌肉生長的組合物。「調節肌肉生長」意指包括肌肉生長和/或發育速度的任何改變並且包括任何肌前體細胞的生長和/或分化。這包括前體肌細胞分裂速度的任何改變，和/或前體肌細胞分化速度的任何改變。這種改變可以是增加或者降低。
該組合物是基於mighty基因序列，其包括來自羊SEQ ID No.1或牛SEQID No.3的序列，與SEQ ID No.1或SEQ ID No.5有至少95％、90％或75％序列同一性的多肽，或其片段或變體。可以通過併入啟動子，mighty啟動子(SEQ ID No5)或其它合適的啟動子調控下的合適載體將序列導入細胞。啟動子可用於導致mighty蛋白的表達，從而增加細胞中基因的表達和mighty蛋白的活性。
組合物還可以包含與本發明多核苷酸序列有至少95％、90％或70％序列同一性的序列。序列同一性可以通過比對序列並檢測相同核苷酸的數目進行測定。已知許多計算機算法用於測定序列同一性，例如BLASTN算法。
組合物還可以包含本發明所述多核苷酸的互補、反向互補或反義多核苷酸。
組合物還可以包含本發明的mighty多肽。多肽可以來自羊SEQ ID No.2或牛SEQ ID No.4、與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽、或其片段或變體。
組合物還可以包含與本發明多肽序列有至少95％、90％或70％序列同一性的序列。序列同一性可以通過比對序列並檢測相同殘基的數目進行測定。本領域已知有許多計算機算法用於測定序列同一性，例如BLASTP算法。
調節肌肉生長的組合物還可以包含mighty基因表達的調節物。
調節肌肉生長的組合物還可以包含mighty蛋白活性的調節物。
Mighty基因表達的調節物可以是能夠特異性結合於本發明所述多核苷酸的化合物。具體地，所述mighty基因表達的調節物可以與mighty基因啟動子結合，從而影響轉錄起始或維持的速度。可替換地，啟動子或其片段可用於將特殊的改變引入細胞的天然啟動子中以增強或者抑制野生型mighty基因的表達。改變可以包括一個或多個核苷酸的取代、插入或缺失。
Mighty基因表達的另一種調節物也可以結合mighty基因，從而直接影響基因表達的速度。
Mighty基因表達的另一種調節物也可以通過結合到mighty基因並向序列中引入改變，例如通過同源重組來起作用，其可以影響基因表達的速度或者改變mighty蛋白的活性。序列的改變包括核苷酸的改變、插入或缺失，其能夠或者不能導致產生的多肽中胺基酸的改變、插入或缺失。改變的例子可以包括插入終止密碼子從而產生截短的多肽，或者改變一個或多個密碼子從而改變一個或多個胺基酸殘基。可替換地，變異可以是刪除野生型mighty基因的一部分或者是插入一部分到mighty野生型基因中。產生這些改變的技術是本領域公知的。另外，將這些改變導入mighty基因中以及隨後測定mighty活性的改變都屬於本領域技術人員的常規技術，例如使用實施例4中所述的成肌細胞增殖試驗。
還可以通過導入幹擾轉錄和/或翻譯的多核苷酸改變mighty基因的表達。例如可以導入反義多核苷酸，其可以包括反義表達載體、反義寡脫氧核糖核苷酸、反義硫代磷酸寡脫氧核糖核苷酸、反義寡核糖核苷酸、反義硫代磷酸寡核苷酸，或任何其它本領域已知的方法，其包括使用化學修飾以增強反義多核苷酸的效率。
可以理解，任何反義多肽不需要與所述多核苷酸100％互補，而只需要具有足夠的同一性以使得反義多核苷酸與基因或mRNA結合從而幹擾基因表達，並且基本不幹擾其它基因的表達。還可以理解的是與基因互補的多核苷酸，包括5』非翻譯區域也可以用來幹擾mighty蛋白的翻譯。同樣的，這些互補多核苷酸不需要100％互補，而是足以結合mRNA和幹擾翻譯，並且基本不幹擾其它基因的翻譯即可。
基因表達的調節也可以包含使用本領域已知的幹擾RNA分子，並包括RNA幹擾(RNAi)和小分子幹擾RNA(siRNA)。
基因表達的調節也可以通過使用催化性RNA分子或核酶獲得。本領域已知所述核酶可以被設計用於與特異靶向的RNA分子配對。核酶結合併裂解該靶向的RNA。
任何其它本領域已知的調節基因表達的技術也可以用於調節mighty基因表達。
組合物還可以包含mighty活性的調節物。Mighty的調節物包括mighty蛋白的優勢負突變體(dominant negative mutant)。當突變體產生妨礙野生型蛋白生理學活性的效果時，即表現出優勢負效果。這可以通過優勢負蛋白與受體結合但不激活受體，同時也阻止野生型蛋白結合而發生。可替換地，優勢負效果可以通過直接結合野生型蛋白並且使其失活而發生作用。
因此本發明的多核苷酸可用於製備合適的組合物，或用於設計合適的組合物，其調節mighty基因的表達，從而調節肌肉生長。該技術可用於調節細胞內，例如原代或轉化細胞系中mighty基因的表達，或者調節動物的肌肉生長。
本發明組合物的一種可能的應用是促進或抑制肌細胞的生長和/或分化。肌細胞可以是原代或轉化的細胞系，或者細胞可以是宿主動物的體內細胞。合適的宿主動物可以包括羊、母牛、公牛、鹿、家禽、豬、魚、馬、小鼠、大鼠或人。
本發明的組合物也可用於治療與肌肉組織相關的疾病。所述疾病或損傷包括肌營養不良、肌肉共濟失調(muscle ataxia)或與心肌生長相關的疾病。類似的，組合物也可以用於在肌肉損傷後促進肌肉再生。
如圖9所示，肌肉受損後在肌肉再生過程中細胞內的mighty表達增加。而且，顯示在梗死後羊心臟組織中的mighty表達增加(圖10)。這些結果表明mighty也參與肌肉再生。因此，組合物不僅可以用於治療與肌肉生長相關的疾病，還可以用於治療受傷後的肌肉損傷。
圖11到15的結果表明本發明的組合物也可用於刺激人類肌肉的生長和分化，進一步證明了本發明在人類醫藥應用中的潛力。
類似地，組合物可用於產生轉基因動物。組合物可用於生產肌肉重量增加的轉基因動物。合適的動物可以包括羊、母牛、公牛、鹿、家禽、豬、魚、馬、小鼠、大鼠或人。可以使用本領域已知的許多用於產生轉基因動物的技術，和任何合適的方法。
本發明的另一應用是預測動物的肌肉重量。為此從動物中獲得樣品。然後分析樣品的mighty基因表達或mighty蛋白的水平。本領域已知許多用於測量基因表達或蛋白量的技術。例如，基因表達可以使用定量RTPCR或northern分析進行測定。蛋白含量可以使用ELISA(酶聯免疫吸附試驗)或Western印跡分析進行測定。
然後將mighty基因表達的水平、或mighty蛋白的量與平均值比較。Mighty基因表達的平均水平是從平均肌肉重量的動物樣本中獲得的平均水平。類似地，mighty蛋白的平均量是在平均肌肉重量的動物樣本中觀測到的蛋白量。
與平均值相比，增高水平的mighty基因表達或mighty蛋白是指動物的肌肉重量將被預測為高於平均的肌肉重量。與平均值相比，降低水平的mighty基因表達或mighty蛋白是指動物的肌肉重量將被預測為低於平均值。
可以理解，天然發生的mighty基因的變體可以存在。該變體可以包括多態性，例如單核苷酸多態性(SNPs)。本領域技術人員將能夠使用本發明的序列篩選該變體。例如，序列可用於設計在聚合酶鏈式反應(PCR)中使用的合適引物以擴增mighty基因或mighty基因的片段從而在各種不同的生物體中篩選該變體。篩選可能包括，例如直接測序或單鏈構像多態性分析(SSCP)的方法。還可理解的是mighty的變體可與生物體改變的肌肉重量相關。
上述測定mighty表達水平或檢測與改變的肌肉重量相關的mighty變體的方法可用於挑選參與繁殖程序的動物，從而產生具有增加或減少的肌肉重量的後代。
發明還提供抗mighty蛋白的抗體。使用本說明書公開的序列，本領域技術人員將能夠產生抗mighty蛋白的抗體。如何產生抗體的實例，其中包括雜交瘤的生產，可以在Eryl Liddell and Cryer(1996)或Javois(1999)中找到。還可理解的是抗體的結合區被認為屬於抗體的定義。
如實施例16所描述以及圖20所示，可以在合適的動物中產生抗整個mighty蛋白的多克隆抗體。可替換地，抗原性片段可以用於產生特異的肽。這表明了本發明的抗體如何能夠使用本領域已知的技術產生。
該抗體可以被用於檢測、和/或在樣本中定量mighty蛋白。可替換地，本發明的抗體可用於結合和調節mighty活性。
可理解的是可產生其它類型的抗體和結合蛋白並預期為本發明的一部分。這些包括，但不限於，非哺乳動物抗體，例如來自鯊魚的IgNAR類抗體；細菌免疫蛋白(bacterial immunity protein)，例如來自大腸桿菌的IMM7免疫蛋白，或本領域已知的其它類型的結合蛋白。使用本說明書公開的序列，本領域技術人員將能夠產生該多肽或者篩選已知結合多肽的文庫以獲得優選與本發明多肽結合的多肽。
也分離和克隆了小鼠mighty啟動子(SEQ ID No5)，並且也構成本發明的一部分。本發明還提供一種或多種含有小鼠mighty啟動子的多核苷酸。mighty啟動子是SEQ ID No5的多核苷酸、與SEQ ID No5有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或衍生物。
啟動子序列的分析，圖3，顯示了已知的轉錄因子結合位點。
含有mighty基因啟動子的載體可以使用已知的技術產生。載體意指包括將多核苷酸併入質粒和/或病毒中以幫助將多核苷酸導入和/或保持在宿主細胞中。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞、體內或原代或轉化的細胞系。
如圖16所示，mighty啟動子可用於驅動基因在包括人的各種細胞系中表達。而且，如圖19所示，小至mighty起始位點上遊200個核苷酸的片段能夠驅動基因的表達。
mighty基因啟動子可用於篩選能夠有效調節mighty基因表達，並因而能夠有效調節肌肉生長的化合物。為此，可將mighty啟動子置於帶有合適標記基因的合適表達載體中。「標記基因」是表達產物可被識別和定量的基因。已知許多合適的標記基因，並可包括例如綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、螢光素酶或β-半乳糖苷酶。
然後使用已知的轉染技術將載體置於合適的宿主細胞中。合適的宿主細胞包含細胞，其中mighty基因啟動子被激活，導致標記基因表達，並且能夠檢測標記基因表達產物的水平。然後將目標化合物施用於宿主細胞，檢測標記基因中的任何改變。
與基線(base line)相比，標記基因表達產物量的增加表明所述化合物能夠通過mighty基因啟動子增強基因表達，因而可用於促進肌肉生長。與基線相比，標記基因表達產物量的減少表明所述化合物能夠通過mighty基因啟動子抑制基因表達，因而可用於抑制肌肉生長。
如圖17所示，該方法能用於表明mighty啟動子被肌肉抑制素調節。因為肌肉抑制素是已知的肌肉負調節物，該結果進一步證明了mighty在促進和調節肌肉生長和發育中的活性。肌肉抑制素的優勢負模擬物也是已知的。WO01/53350，C末端截斷(在位置330和350之間)的肌肉抑制素肽產生具有優勢負效果的肌肉抑制素模擬物。如圖18所示，肌肉抑制素模擬物335(在位置335截斷)能夠回復肌肉抑制素介導的mighty啟動子抑制。結合來看，圖17和圖18顯示肌肉抑制素和肌肉抑制素模擬物能夠分別被用於下調或上調mighty表達，並因而能夠在本發明的組合物中使用。
might基因啟動子也可用於表達肌細胞中的指定基因。指定基因可以包含本發明的多核苷酸，或可以是任何其它多核苷酸，例如編碼肌肉抑制素蛋白的多核苷酸。為此，將mighty基因啟動子連同目的基因插入合適的載體。本領域已知許多合適的載體，並可包括真核載體、病毒載體或任何適於基因治療的載體。
然後可使用已知的轉染技術將載體導入合適的宿主細胞。
合適的宿主細胞可為任何肌肉細胞或哺乳動物細胞，其中mighty啟動子被激活。宿主細胞可包括，例如原代或成肌細胞系，或轉化的成肌細胞系，或宿主動物的骨骼肌或心肌細胞。
可使用任何mighty啟動子有活性的宿主動物，而可以包括例如羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、魚、馬、小鼠、大鼠或人。
實施例1分離mighty cDNARNA純化根據製造商的規程使用TRIZOL(Invitrogen)從羊和牛的骨骼肌和心臟組織樣本中純化RNA。
mighty cDNA的擴增mighty cDNA的擴增通過聯合反轉錄PCR進行。根據製造商的指示使用Superscript preamplification試劑盒(Invitrogen)在來自5μg總RNA的20μl反轉錄反應混合物中合成第一鏈cDNA。用於擴增的PCR條件和特異引物如下羊和牛骨骼肌mighty cDNA和牛心臟mighty cDNA的擴增使用如下引物正向引物5』CACCATGGCGTGCGGGGCGACACTG 3』(SEQ ID No.6)反向引物5』GGATACATAGCTTGTTGGCCT 3』(SEQ ID No.7)PCR在存在Q溶液(Qiagen)的情況下進行，並在94℃起始變性1分鐘，然後以下述步驟進行35個循環，94℃ 15秒，60℃ 45秒，72℃ 1分鐘，和最後延伸的1個循環72℃ 5分鐘。
來自Belgian Blue牛和正常肌肉的牛的mighty片段的PCR擴增(圖1)。
使用的引物bcoo3291Fwd 5』TGAAGCGGCCCATGGAGTTC 3』(SEQ ID No.8)bcoo3291Rev2 5』GGTGGGCTGGTCCTTCTTCATC 3』(SEQ ID No.9)PCR在存在Q溶液(Qiagen)和Taq聚合酶的情況下進行，開始94℃變性1秒鐘，然後進行35個循環的94℃ 15秒，62℃ 30秒，72℃ 45秒和最後延伸的1個循環72℃ 5分鐘。
PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，用溴化乙錠染色和顯像。圖1的結果顯示與正常肌肉的動物相比mighty在雙肌牛中過表達。該結果表明mighty在促進肌肉生長中起作用。圖2的A部分顯示在雙肌動物的心臟組織中mighty基因的表達也上調，這表明mighty也能夠調節心肌生長和發育以及骨骼肌生長和發育。圖2的B部分顯示在羊骨骼肌中存在mighty表達。
PCR產物的純化在0.8％低熔點瓊脂糖凝膠上電泳PCR反應物，切下含有目的條帶的凝膠。使用Wizard PCR preps DNA純化系統(Promega)從凝膠中純化DNA。
實施例2mighty cDNA的克隆根據製造商的規程將純化的cDNA連接到pGEM-T easy載體(Promega)中。根據製造商的規程將連接反應物轉化到感受態的大腸桿菌DH 5alpha細菌(Invitrogen)中。將轉化的細菌置於含有氨苄青黴素(50mg/升)、IPTG和X-gal的Lennox L broth(LB)瓊脂平板上。將白色菌落接種到LB加氨苄青黴素培養基中，培養過夜。使用Qiagen mini質粒試劑盒(Qiagen)從培養物中純化質粒DNA。用限制性酶EcoRI消化質粒DNA，並在瓊脂糖凝膠上分析。通過大小正確的片段的存在來鑑定陽性克隆。將陽性克隆進行測序以進一步確認。羊mighty多核苷酸序列在SEQ ID No.1中給出，相應的多肽序列在SEQ ID No.2中給出。牛mighty多核苷酸序列在SEQ ID No.3中給出，相應的多肽序列為SEQ ID No.4。
實施例3產生鼠類mighty穩定細胞系用下列引物PCR擴增鼠類mighty的ORFFwd 5』CACCATGGCGTGCGGGGCGACACTG 3』(SEQ ID No.6)Rev 5』GGATACATAGCTTGTTGGCCT 3』(SEQ ID No.7)根據製造商的建議，將Pwo聚合酶(Roche)、Q溶液(Qiagen)和作為模板的小鼠EST克隆(Resgene)用於PCR反應。PCR條件如下35個循環的94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 1分鐘和一個循環的72℃ 5分鐘。
根據各製造商的規程，通過Wizard PCR preparations DNA純化系統(Promega)純化小鼠mighty基因的cDNA，將其克隆到pcDNA3.1D/V5HisTOPO載體(Invitrogen)的TOPO位點。重組體通過限制性消化進行分析，並將陽性重組體測序。
為了用小鼠mighty構建體穩定轉染C2C12成肌細胞，將C2C12成肌細胞(1×107)在冰冷的1xHBS(140mM NaCl，0.77mM Na2HPO4，25mM Hepes(7.1))中洗滌兩次，重懸於0.5ml冰冷的1xHBS中，並轉移到預冷的0.4cm間隙的小池(cuvette)(BioRad)中。加入10μg線性化的質粒DNA(用Sca I線性化)。置於冰上5分鐘後，通過攪動混合細胞，將小池以0.24kV 960μF電容及設為200Ω的電阻進行脈衝。時間常數是平均36ms。細胞在冰上保溫10分鐘，轉移到10cm皿上的10ml DMEM 10％FBS中，上下研磨以破壞細胞碎片。用遺傳黴素(geneticin)(600μg/ml)選擇細胞，選擇單個克隆。表達轉基因的克隆通過質粒中V5標記的Western印跡進行鑑定。
實施例4成肌細胞增殖試驗在檢測C2C12細胞(Yaffe和Saxel)前，轉染的C2C12克隆在DMEM培養基(Life Technologies，Grand Island，NY.USA)中培養，用NaHCO3(41.9mmol/l，Sigma Cell Culture Ltd，St Louis，MO，USA)和氣態CO2緩衝。酚紅(7.22hmol/l，Sigma)被用作pH指示劑。將青黴素(1×105IU/l)和鏈黴素(100mg/l，Sigma)常規地加入10％胎牛血清培養基(Life Technologies Ltd)。
細胞增殖試驗在無塗層的96孔Nunc微量滴定板中進行。C2C12培養物以3×103細胞/cm2接種到增殖培養基中。24小時的連接階段(attachmentperiod)後，倒出培養基，並將新鮮的增殖培養基重新加回平板。
然後在37℃和5％CO2的氣氛中溫育平皿。在培養基改變後的0、24、48和72個小時固定試驗的平板，並通過Oliver等(1989)的方法測定增殖。簡要地，倒出生長培養基，將細胞用PBS洗一次，然後在10％甲醛鹽水(formolsaline)中固定30分鐘。固定的細胞在0.01M硼酸鹽緩衝液(pH8.5)中用10g/l的亞甲藍染色30分鐘。通過在硼酸鹽緩衝液連續洗滌四次除去多餘的染料。然後通過加入100ml的1∶1(v/v)的乙醇和0.1M的HCl從固定細胞上洗脫亞甲藍。然後輕輕搖動平皿，通過微板光度計(microplate photometer)(BioRadmodel 3550 microplate reader，BioRad，Hercules，CA，USA)測量每個孔在655nm的吸光率。
圖4的結果顯示，用mighty基因轉染的細胞具有更高的吸光度，這表示與正常C2C12細胞相比更快的生長速度。該結果顯示mighty上調成肌細胞的生長。
實施例5Mighty誘導的肥大為評價mighty在促進肌發生中的功能，將穩定表達mighty的成肌細胞在低血清培養基中進行分化。進行MHC的免疫染色以評估肌管的形態學。
mighty過表達的細胞和親代細胞系；將在DMEM 2％馬血清中分化72小時的C2C12在PBS中洗一次，然後用70％的乙醇∶甲醛∶冰醋酸(20∶2∶1)固定30秒，再用PBS漂洗三次。然後將細胞在含有1％正常羊血清(NSS)的TBS中在4℃封閉過夜。將細胞與第一抗體(primary antibody)，1∶100稀釋的抗MHC抗體在TBS/1％NSS中培養1小時。將細胞用TBST洗滌(3×5min)並與第二抗體(secondary antibody)，1∶100稀釋的羊抗小鼠IgG在TBS/1％NSS中培養30分鐘。將細胞像前述一樣洗滌，並與第三抗體(tertiaryantibody)，1∶100稀釋的抗生蛋白鏈菌素-生物素過氧化物酶複合物(RPN1051，Amersham)在TBS/1％NSS中培養30分鐘。將細胞然後像前述一樣再次洗滌。使用3，3-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB；Invitrogen)顯現MHC免疫染色，其用0.0375％CoCl2增強，然後用Gills蘇木精(Gills haematoxylin)復染、固定和拍照。
如圖5所示，mighty的表達導致肌核數量的增加，因而表明mighty也促進肌細胞的肥大。
實施例6mighty誘導肥大的分析方法細胞培養將C2C12細胞或兩個Mighty過表達C2C12克隆；克隆7和克隆11以15,000細胞/cm2置於permanox蓋玻片(Nunc)上DMEM 10％FB S(Invitrogen)中，用於分析活性生長的細胞，並以25,000細胞/cm2用於分化研究。
在5％CO2/37℃的氣氛中的24小時連接階段後，將培養基改變為生長培養基(DMEM/10％FBS)或變為DMEM/2％HS(分化培養基)(Invitrogen)，並使細胞分化60和72小時。為了顯現細胞，將培養物在合適的時間點用20份的70％乙醇/2份的40％甲醛/1份的冰醋酸固定，然後用Gills蘇木精(1∶1)染色5分鐘，用1％曙紅(Eosin)染色1分鐘。然後將蓋玻片在100％乙醇中脫水、清潔並用DPX在載玻片上永久固定。
人成肌細胞培養從Clonetics，Cambrex NJ，USA獲得人骨骼肌成肌細胞。根據各製造商的說明，將細胞常規地在含有rhEGF、地塞米松(Dexamethasone)、FBS、Glutimine和GA-1000的SkGM-2培養基中生長。
為了轉染和條件培養基試驗，將細胞以30,000細胞/cm2的密度鋪平板。24小時連接階段後，將培養物用mighty-pCDNA3和對照載體轉染或者獲得條件培養基。條件培養基由DMEM/2％HS組成，其用mighty克隆11或對照細胞進行48小時條件化。
轉染後24小時，培養基改變為DMEM/2％HS。培養物用20∶2∶1的固定液(fixative)在12、24、36、48小時固定。
C2C12克隆中肥大的定量在設置在Olympus顯微鏡上的SPOT RT相機上，使用為Windows和MAC設計的SPOT RT軟體v 3.5捕獲圖像。對於活性生長的細胞，以40x的放大倍率測量每個細胞系中40個隨機選擇的細胞的面積。對於肌管，也以40x的放大倍率測量每個細胞系40個隨機選擇的分別具有3個和4個核的肌管的面積、寬度和長度。數據表示為平均值+/-標準差(Standard Deviation)。
FACS分析於10cm皿中的DMEM 10％FBS中培養Mighty過表達的C2C12克隆7和11，以及lacZ對照C2C12成肌細胞。使用胰蛋白酶(trypsin)收集細胞，然後離心並在800μl 70％乙醇/PBS中固定。在室溫下將固定的細胞重懸於50μlPBS+500μl DNA提取緩衝液(200mM Na2HPO4；100mM檸檬酸)中10分鐘。將DNA提取緩衝液替換為DNA染色緩衝液(PBS中50μg/ml碘化丙錠(propidium iodide)；50μg/ml無DNase的RNase A)，簡單旋轉以重懸細胞並在黑暗中在室溫培養30分鐘。然後用Becton-Dickinson FACScan流式細胞計數器(Becton-Dickinson)檢測細胞的碘化丙錠螢光，用CellFit軟體(Becton-Dickinson)分析前向角光散射，一種細胞大小的量度，和DNA含量，用於細胞周期分析。
Western印跡在轉到分化培養基(DMEM 2％HS)中培養0、24、48、72和96個小時前，將mighty過表達的C2C12克隆7和11，以及lacZ表達C2C12成肌細胞在10cm皿中在DMEM 10％FBS中培養24小時。通過胰蛋白酶化收集細胞，並且重懸在300μl的裂解緩衝液中(50mM Tris(pH7.5)；250mM NaCl；5mMEDTA；0.1％NP-40；1×蛋白酶抑制劑(Complete；Roche))。細胞提取物通過0.5mm注射器針頭十次，離心(14,000g 10分鐘)沉澱細胞碎片，並將上清用於Western印跡。使用Bio-Rad蛋白分析試劑(Bio-Rad)檢測蛋白濃度，15μg的蛋白在預製的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen)中在45mA下電泳。然後使用Mini-ProteanII轉移系統(Bio-Rad)在50-60V下處理2小時將蛋白凝膠轉移到Trans-blot轉移膜(Bio-Rad)。將該膜在TBST中的5％牛奶中封閉過夜。在TBST中的5％牛奶中稀釋如下第一抗體p21，1∶400稀釋的純化的小鼠單克隆抗p21抗體(SX118；PharMingen)；MyoD，1∶200稀釋的純化的兔多克隆抗MyoD抗體(sc-304；Santa Cruz)；MHC，1∶2000稀釋的純化的小鼠多克隆抗MHC抗體(MF-20；Donald Fischman博士饋贈)；α-微管蛋白，1∶4000稀釋的純化的小鼠單克隆抗α-微管蛋白抗體(DM1A；Sigma)；並在室溫下培養3小時。將膜在TBST中洗滌5次每次5分鐘，進一步在室溫下於TBST中的5％牛奶中培養1小時，其中含有1∶2000稀釋的抗小鼠IgG HRP結合物(P0447；Dako)或抗兔IgG HRP結合物(P0448；Dako)。然後將膜在TBST中洗滌5次每次5分鐘，並使用Western Lightning ChemiluminescenceReagent Plus(Perkin Elmer)檢測HRP活性。
結果Mighty過表達的成肌細胞和肌管顯示比對照細胞肥大活性生長的mighty過表達克隆當與對照細胞比較時顯示出肥大。使用定量圖像分析，活性生長的mighty過表達克隆具有比對照細胞明顯更大的面積(圖6A)。為確認該結果，，通過流式細胞術採用前向角光散射測定成肌細胞肥大，或相對細胞大小。該分析表明克隆11和克隆7的細胞分別具有比對照細胞增加的細胞大小(圖6B)。
分化的mighty過表達克隆與對照細胞相比也顯示肥大。假定肥大的解釋可以是每個肌管融合細胞數量的增加，進行分析比較mighty過表達克隆和對照細胞之間具有同樣數量核的肌管的大小。使用定量圖像分析，在mighty過表達克隆中明顯肌管肥大。比較三和四核肌管的肌管面積、寬度和長度。在三和四核肌管中mighty過表達克隆都顯示出比對照細胞在面積、寬度和長度上的增加(圖6C-6E)。
Mighty過表達克隆分化早於對照細胞使用MHC的免疫細胞化學檢測mighty過表達克隆的分化表型以顯現肌管形成。將mighty過表達克隆轉到分化培養基時，60個小時後在mighty過表達克隆中明顯出現多核肌管，而對照培養物中直到72小時多核肌管也不明顯。72小時後mighty過表達顯示基本完全分化，而對照細胞顯示僅形成初生肌管(nascent myotube)(圖7A)。使用分化標記的Western印跡證實了這些結果。早期、中期和晚期分化標記p21、myoD和MHC分別用於研究肌原性(myogenic)分化基因表達(圖7B)。p21的表達在所有的時間點增加，表明p21表達在mighty過表達克隆中發生較早並且達到較高的程度。MyoD表達在mighty過表達克隆中增加較早，在分化的0、24和48小時，myoD表達超過對照細胞。72小時後在所有細胞系中MyoD水平同樣高。在克隆11中24小時後出現MHC表達，並在48小時其在兩個克隆中都表達到更高的水平。72小時後該表達在所有細胞中相同。肌原性分化標記較早的和增加的表達是與組織化學結果同時發生的。該結果表明過表達mighty導致增強的分化表型。
實施例7肌肉發育中的mighty方法分離衛星細胞(靜止的)通過Percoll密度離心從4周大的野生型小鼠的後肢肌肉中分離衛星細胞(SC)。肌肉被切碎，在0.2％的膠原酶1A中消化90分鐘。通過輕柔的研碎和隨後的過濾(70μm)從基底層下釋放細胞。然後將細胞懸浮液覆蓋在70％/40％的Percoll梯度上，並以1,600rpm離心20分鐘。回收含有衛星細胞的70％和40％Percoll溶液之間的分界面，將細胞在PBS中洗滌。為提取用於Western印跡的蛋白，將細胞重懸於裂解緩衝液中，並通過0.45mm計量注射針(gaugeneedle)以裂解細胞。通過在10,000rpm離心10分鐘去除細胞碎片，並將獲得的蛋白溶液在-80℃保存。
分離原代成肌細胞(活化的衛星細胞)從4周大小鼠上移除後肢肌肉，將其完全切碎，37℃下在DMEM(無血清)中用0.2％的膠原酶1A振蕩(70rpm)消化90分鐘。消化物用10ml吸液管反覆粉碎直至看不見塊狀。然後將懸浮液通過100μm和隨後70μm的濾器過濾。過濾的緩衝液在4,000rpm離心10分鐘，並將沉澱在8ml溫暖的增殖培養基[DMEM，20％胎牛血清(FCS)，10％馬血清(HS)，1％雞胚胎提取物(CEE)]中重懸。將細胞懸浮物在無塗層的10cm的平板上預塗布1.5h，然後轉換到10％基質膠(matrigel)平板，並在37℃培養48h。48h後將培養基換為DMEM+10％FCS。活性生長條件中24h後收集細胞。為提取用於蛋白質印跡的蛋白，將細胞重懸於裂解緩衝液中，並通過0.45mm計量注射針以裂解細胞。通過在10,000rpm離心10分鐘去除細胞碎片，並將獲得的蛋白溶液在-80℃保存。
mighty的Western分析將預製的聚丙烯醯胺凝膠(Invitrogen，NuPage 4-12％Bis-Tris)用於蛋白分離。將15μg的蛋白通過SDS-PAGE(4-12％)分離並通過電印跡(electroblotting)轉換到硝化纖維膜。使用麗春紅S染料檢測硝化纖維膜上存在的蛋白以保證出現同等負載。將膜在RT在0.3％BSA/1％PVP/1％PEG/TBS-T中培養3h以阻斷非特異性抗體的結合。然後將膜與1∶5000稀釋的兔抗mighty抗體在0.3％BSA/1％PVP/1％PEG/TBS-T中在4℃輕微振蕩培養過夜。抗體培養之間將膜在TBS-T中洗滌5次每次5分鐘。然後將硝化纖維膜與1∶2000稀釋的與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔(HRP)(Amersham)在0.3％BSA/1％PVP/1％PEG/TBS-T中培養1h。用ECL試劑(Western LightningChemiluminescense Reagent Plus)測定HRP活性。
結果might在鼠類衛星細胞中的表達為測定mighty蛋白表達的模式，從靜止的衛星細胞、活性生長的成肌細胞中提取總蛋白。通過Western印跡分析mighty蛋白表達水平(圖8)。在靜止的衛星細胞中，沒有檢測到mighty蛋白表達。然而，在活性生長的成肌細胞(活化的衛星細胞)中檢測到mighty蛋白。
實施例8肌肉再生中的Mighty方法虎蛇毒素(Notexin)誘導的再生通過腹膜內注射氯胺酮(ketamine)/甲苯噻嗪(rompun)(鹽酸氯胺酮100mg/ml，鹽酸甲苯噻嗪20mg/m，以0.1ml/6gm體重)麻醉六周大的野生型小鼠。修剪毛皮，露出右脛骨前肌(TA)肌肉區域，並且在肌肉上做一小切口。使用100μl注射器(Hamilton Co.)將10μl的0.1μg虎蛇毒素(Notechis scutatus scutatus)(Venom Supplies Pty.Ltd.，Tanunda，South Aust)注射至右TA。切口用Michelle夾閉合。將小鼠在損傷後不同的天數通過CO2窒息無痛處死，然後脫頸(cervical dislocation)。右側和左側的TA肌肉被仔細剖開，稱重並且進行免疫組織化學分析。
mighty的免疫組織化學將小鼠TA肌肉和羊心臟組織分離，植入OCT中並且冷凍於液氮冷卻的異戊烷中。將冷凍部分(cryosection)在10μm切斷並且將載片在-20℃冷凍直至使用。這些部分在PBS，0.1％Triton X-100中在室溫下滲透30分鐘，並且與1∶100稀釋的第一抗mighty抗體在PBS，10％標準驢血清，1％BSA，0.1％Triton X-100中4℃培養過夜。在PBS中洗滌3x4分鐘後，將載片在PBS、5％標準驢血清，1％BSA，0.1％Triton X-100中溫育1小時以減少與第二抗體的非特異性結合。該部分與1∶300稀釋的生物素化的抗兔第二抗體(Amersham，UK)室溫培養1小時。在PBS中洗滌後，將該部分最後在抗生蛋白鏈菌素結合的Alexa fluor 488-標記的第三抗體(Molecular Probes，USA)中在室溫溫育1小時，在PBS中洗滌，用DAPI(4』，6-二脒基-2-苯基吲哚，二氫氯化物，Molecular Probes，USA)復染，固定在DAKO螢光固定培養基中並且分析migty表達。對照部分與非第一抗體或者兔對照IgG溫育並且隨後如上所述進行。
結果小鼠TA肌肉再生過程中mighty的表達為了調查在野生型大鼠的肌肉再生過程中mighty的表達，通過注射虎蛇毒素至右脛骨前肌(TA)肌肉來誘導損傷。在注射後的各天，將小鼠無痛致死並且收集TA肌肉。為了確定mighty表達的模式，進行免疫組織化學(圖9)。在受傷後的第一天，對肌肉纖維整體有大量的損傷，觀察到mighty表達的水平未發生變化。到第5天mighty表達水平相對於第0天已經大量增加，在受傷後的第7天水平達到峰值。到在第28天mighty表達的水平可與對照的未受傷肌肉相比較。
實施例9在羊的梗死後心臟組織中表達Mighty方法通過Sharma等，1999中所述的公開方法誘導羊心臟中的心肌梗死。在梗死後第0天(無梗死)、第2天和第6天收集心臟組織。為了確定mighty表達的模式，如肌肉再生實施例(實施例8)中所述進行心臟組織部分的免疫組織化學。
結果在無梗死心臟組織中，mighty的表達為均勻的並且限於位於心肌細胞周圍小間隙(interstitium)中的細胞。未顯示心肌細胞表達Mighty。梗死後兩天，mighty的表達與對照的心類似。到梗死後的第6天，浸潤性(infiltrating)細胞的數量主要在梗死區中大量增加。mighty的表達限於位於最接近壞死的心肌區域的浸潤性細胞。在浸潤性細胞鄰近存活心肌之處，表達水平仍保持與對照物相類似。遠離梗死區域的浸潤性細胞不表達mighty(圖10)。
mighty在間隙成纖維細胞中以及壞死心肌區域中浸潤性細胞中的存在證實了mighty參與癒合(healing)的過程。
實施例10Mighty對於人成肌細胞的分化和肥大的影響結果在用mighty轉染的人成肌細胞中的分化增加為確定mighty過表達對於在人成肌細胞中分化的影響，使用mighty-pcDNA3或者單獨使用pcDNA3(對照)轉染人成肌細胞並且在分化培養基中培養12小時。為了確定分化肌管的數量，使用肌球蛋白重鏈(MHC)特異性抗體進行免疫組織化學。在處於分化條件下12個小時後，與對照成肌細胞相比，在mighty轉染的人成肌細胞中MHC陽性肌管的數量更多(圖11)。
用Mighty轉染的人成肌細胞的肥大用Mighty-pcDNA3或單獨用pcDNA3(對照)轉染人成肌細胞並且在分化條件下培養12小時。為了確定肥大，使用肌球蛋白重鏈(MHC)特異性抗體進行免疫組織化學，並且計數每個MHC陽性肌管的肌核數量(圖12A)。結果顯示與對照相比，更少mighty轉染的人肌管只含有1-3個肌核，更多數量的肌管含有4-9個肌核。也通過測定含有5-9個肌核的肌管寬度來評估MHC表達肌管的肥大(圖12B)。mighty轉染的肌管的平均寬度與對照肌管相比更大(圖12B)。
用來自mighty過表達的C2C12細胞的條件培養基處理的人成肌細胞的肥大為了證明由mighty引起的加速分化和肥大的現象，在分化條件下用來自Mighty過度表達C2C12細胞和LacZ(對照)C2C12細胞的條件培養基培養人成肌細胞48小時。如上所述評估肥大的水平。用來自mighty過表達的C2C12細胞的條件培養基培養的人成肌細胞與對照處理的成肌細胞相比含有更少的僅有1-5個肌核的肌管以及更大量帶有16-25個肌核的肌管(圖13A)。用來自mighty過表達的C2C12細胞的條件培養基處理的人成肌細胞中，肌核的平均數與對照相比更多(圖13B)。
MHC表達肌管的肥大還通過測定肌管的寬度再次評估。測量含有8個肌核的MHC表達肌管(圖13)。用來自mighty過度表達的C2C12細胞的條件培養基處理的肌管的平均寬度與對照肌管相比更大。
用來自mighty的條件培養基處理的人橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)(RD)細胞中的增加的分化方法從ATCC(Rockville，MD.)獲得人RD(人橫紋肌肉瘤)細胞。檢測前將RD細胞在Dulbecco改進的Eagle培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM；Invitrogen)中生長，用41.9mM的NaHCO3(Sigma Cell Culture Ltd)和5％氣態CO2緩衝。7.22nM的酚紅(Sigma)作為pH指示劑。在培養基中加入1×105IU/L青黴素(Sigma)，100mg/L鏈黴素(Sigma)和10％胎牛血清(FBS；Invitrogen)。將RD細胞以30,000細胞/cm的密度置於permanox chamber玻片上。24小時後將它們如所述對人成肌細胞一樣用條件培養基處理(mighty克隆11)並將細胞在72小時後固定。進行MHC的免疫組織化學。
結果用mighty條件培養基和對照培養基處理人RD細胞，並且進行72小時的分化。將細胞對於MHC免疫染色以評估分化的程度。處理的細胞中的MHC陽性肌管的數量與對照細胞相比更高，這表明來自mighty過度表達克隆的條件培養基能夠加速分化(圖15)。
實施例11鼠類Mighty啟動子的克隆方法用小鼠基因組DNA和下面的引物擴增2.1kb的5』上遊序列Rev 5』AGA TCT GAT CCA ACT CTT CAG CTA C 3』(SEQ ID No.10)Fwd 5』GCT AGC CCA CAT TCA CTG TGC AAG 3』 (SEQ ID No.11)根據製造商的規程，使用Q溶液(Qiagen)和Expand long DNA聚合酶(Roche)進行PCR。PCR條件為，35個循環的95℃ 15s，52℃ 30s，68℃ 3min和最後延伸的1個循環68℃ 7min。
將PCR產物在0.8％瓊脂糖凝膠上分析並且通過Wizard純化柱(Promega)純化。將純化的DNA片段如上所述克隆到pGEM-T easy載體中。通過限制性消化和測序選擇和分析陽性重組體。通過BglII和NheI酶從pGEM-T easy載體中切下2.1kb片段以克隆至螢光素酶報導載體pGL3B。用BglII和NheI消化pGL3B並且用T4連接酶將2.1kb mighty啟動子片段與其連接。用連接反應物轉化大腸桿菌DH 5α並塗布於LB瓊脂加氨苄青黴素平板。培養物在LB加氨苄青黴素培養基中生長並且如前所述純化質粒DNA。通過限制性消化分析質粒DNA並鑑定陽性重組體。通過測序被確認陽性重組體(2.1構建體)(SEQ ID No.5)。對於轉染實驗，使用Qiagen Maxi Prep試劑盒(Qiagen)純化DNA。
mighty啟動子序列如SEQ ID No.5中所示。也分析了mighty啟動子序列已知的轉錄因子結合位點(圖3)。這些位點顯示啟動子序列的關鍵部分。
實施例12Mighty啟動子活性在包括人的不同細胞系中的實例方法將1kb的mighty上遊序列(2.1kb mighty啟動子的片段)克隆至螢光素酶報導載體pGL3-basic(Promega)。通過限制性消化從2.1kb啟動子序列中獲得1kb mighty啟動子片段。在2.1mighty啟動子構建體上進行Scal，BglII消化以切除該～1kb片段。然後將這個片段以正確方向克隆到pGL3b的多克隆位點中的SmaI和BglII位點從而驅動螢光素酶的表達。
用2μg的該啟動子構建體和用於轉染效率標準化的0.5或1μg的β-半乳糖苷酶(β-gal)表達質粒pCH110(Amersham)進行轉染。根據製造商的規程，使用LipofectAMINE 2000試劑(LF2000，Invitrogen)用上述載體轉染C2C12成肌細胞，NIH3T3，CHO，RD(人橫紋肌肉瘤細胞系)以及原代羊成肌細胞。簡要地，在轉染之前將細胞系以15,000細胞/cm2塗布於6孔細胞培養皿(Nunc)上合適的生長培養基中並且在37℃，在5％CO2中溫育過夜。每孔中將LF2000以5-8ul在250μl不含血清的DMEM中稀釋。然後將稀釋的DNA和LF2000混合併且在室溫溫育20分鐘。然後將DNA/LF2000混合物加入含有2ml適當生長培養基中的細胞的孔中。將細胞系與轉染混合物在37℃，在5％CO2中溫育過夜，之後用生長或者分化培養基替換培養基。然後將細胞以每孔5ml PBS漂洗兩次並且在300-500μl的報導裂解緩衝液(Promega)中裂解。10μl的細胞裂解物用於使用螢光素酶分析系統(Promega)根據每個製造商的規程探測螢光素酶活性。50μl的細胞裂解物用於使用含有報導裂解緩衝液(Promega)的β-半乳糖苷酶分析系統根據每個製造商的規程進行β-gal分析。將螢光素酶值根據β-gal值以對於轉染效率進行標準化。
結果將1kb的鼠類mighty上遊序列轉染至各種細胞系。這些包括C2C12成肌細胞、原代羊成肌細胞、NIH3T3成纖維細胞、以及中華倉鼠卵巢(CHO)細胞(圖16A)和人RD細胞(圖16B)。鼠類mighty啟動子在所有這些細胞系中顯示出強烈活性。因此mighty啟動子在源自不同組織類型和包括人在內的物種的細胞系中顯示出強表達。
實施例13肌肉抑制素對Mighty啟動子的劑量依賴性抑制方法在C2C12成肌細胞中mighty啟動子的轉染方法如上所述，除了用肌肉抑制素蛋白處理轉染細胞。轉染後24小時，在生長培養基中用4和8μg/ml的重組肌肉抑制素處理細胞。處理24小時後收穫細胞。如上所述測定螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性。
結果將1kb鼠類mighty啟動子轉染至C2C12成肌細胞並且用增加濃度的4和8μg/ml的重組肌肉抑制素蛋白處理。1kb mighty啟動子的活性在4和8μg/ml的肌肉抑制素蛋白(分別為39.23+/-0.99％和58.22+/-1.00％)的存在下被抑制。而且增加濃度的肌肉抑制素在更大程度上抑制mighty啟動子(圖17)。因此肌肉抑制素以劑量依賴的方式抑制mighty啟動子。
實施例14肌肉抑制素模擬物(335)回復肌肉抑制素對Mighty啟動子的作用羊衛星細胞的轉染如上所述將羊衛星細胞在DMEM+10％FBS中生長。使用Lipofectamine2000(Invitrogen)根據製造商的說明，在24孔板中用0.4μg 1kb小鼠mighty啟動子構建體和0.1μg的pCH110(SV40β-半乳糖苷酶對照載體，Amersham)轉染細胞。24小時後將培養基變為DMEM+10％FBS+3μg/ml野生型重組肌肉抑制素或335(15mg)，或者肌肉抑制素和335。在更換培養基24小時後，製備細胞提取物並按照確定的規程進行螢光素酶試驗(Promega)。按照規程(Promega)進行β-半乳糖苷酶活性的試驗。將螢光素酶活性根據β-半乳糖苷酶活性進行標準化。
結果用1kb mighty啟動子和β-半乳糖苷酶載體轉染羊成肌細胞，並且用肌肉抑制素或者肌肉抑制素模擬物或者二者共同進行處理。如圖18中所示，對於用野生型肌肉抑制素的處理可以看到mighty啟動子活性的33％的抑制。當細胞用肌肉抑制素和5摩爾過量的優勢負模擬物335處理時，僅觀察到mighty啟動子活性的19％的抑制。因此優勢負肌肉抑制素模擬物335能夠回復mighty啟動子的肌肉抑制素介導的抑制作用。
實施例15Mighty啟動子的截斷分析(Truncation Analysis)方法用含有NheI限制位點的正向引物5』-GCTAGCGTGATCCGATTAATGGCC-3』以及含有BglII限制位點的反向引物5』-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3』擴增Mighty 0.6kb啟動子。用含有NheI限制位點的正向引物5』-GCTAGCCCCTTTAGAATCACCTC-3』和含有BglII限制位點的反向引物5』-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3』擴增Mighty 0.4kb啟動子。用含有NheI限制位點的正向引物5』-GCTAGCCGCAGGTGCGAAAGACCTC-3』和含有BglII限制位點的反向引物5』-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3』擴增Mighty 0.315kb啟動子。用含有NheI限制位點的正向引物5』-GCTAGCTCCGGCAGAGAGCGTGAAG-3』和含有BglII限制位點的反向引物5』-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3』擴增Mighty 0.287kb啟動子。用含有NheI限制位點的正向引物5』-GCTAGCAGACCGGCCTACTTCTTC-3』和含有BglII限制位點的反向引物5』-AGATCTGATCCAACTCTTCAGCTAG-3』擴增Mighty 0.209kb啟動子。將這些截斷片段(truncations)以正確方向克隆至pGL3b的NheI和BglII限制位點以驅動螢光素酶的表達。
結果將mighty啟動子片段(從0.2kb至2.1kb)轉染至C2C12成肌細胞並檢測螢光素酶活性。將螢光素酶活性根據β-半乳糖苷酶的活性進行標準化。結果如圖19(A和B)中所示，其表明從300bp至1kb的mighty啟動子的啟動子活性最大。顯示出在1kb和2.1kb之間的啟動子活性有輕微降低。
實施例16Mighty抗體的生產方法在兔子中產生抗全長牛mighty蛋白的多克隆抗體。首先，將牛mightycDNA克隆至pRSET B載體(Invitrogen)中，並且最終按照製造商的規程轉化入大腸桿菌BL21 star(Invitrogen)。通過加入0.5mM IPTG誘導重組蛋白的表達並且連續培養兩個半小時。通過離心收集細菌，重懸於40ml裂解緩衝液(6M鹽酸胍(guanidine HCl)，20mM Tris pH8.1，5mM 2-巰基乙醇)中，然後進行聲處理。將裂解產物在10,000g離心30分鐘，使用Ni-瓊脂糖親和操作(Qiagen，Valencia，CA)從上清液中純化重組蛋白。收集級分並且對兩個改變的含有200mM NaCl和5％甘油的50mM Tris pH8.0在4℃透析90分鐘。用Freund『s佐劑乳化純化的mighty蛋白並注射至每個兔子(341□g/兔子)。隨後給予每隻兔子含有170□g mighty蛋白/注射液的兩份加強劑量(booster dose)。
從接種兔子中採集血並且在4℃在2000rpm離心15分鐘。從凝血(clot)中分離血清。用2.5ml的蛋白-A瓊脂糖(Protein-AAgarose)裝填柱以純化抗體的IgG級分。用25ml 100mM Tris pH8.0洗滌柱子。用1/10體積的1.0M Tris(pH8.0)調節血清的pH，並且將5.5ml的血清流過柱子。將回收的級分再次流過柱子。接下來，用25ml的100mM Tris(pH8.0)洗滌柱子。用25ml的10mM Tris(pH8.0)第二次洗滌。用100mM甘氨酸(pH3.0)洗脫抗體。在含有50μl的1M Tris(pH8.0)的管中收集洗脫液並輕輕混合。通過使用Bradford方法鑑定含有免疫球蛋白的級分以用於蛋白評估。
肽特異性mighty抗體在我們的說明書中，通過QED Bioscience，Inc.，CA，USA產生抗18mermighty肽(173-190AA)的抗體。
Western印跡進行Western印跡分析以驗證產生的抗全長牛mighty蛋白和18mermighty肽(173-190)的抗體。具體地，將來自表達牛重組mighty蛋白的大腸桿菌細胞的蛋白提取物或純化的重組mighty蛋白按照製造商的說明在4-12％的NuPAGE(Invitrogen)凝膠上分析。mighty蛋白抗體以1∶10,000用於Western印跡，而1∶5000的稀釋用於肽抗體。
結果肽和mighty蛋白抗體在Western印跡中都特異性識別預期的35kd大小的蛋白條帶，這表明這些抗體對於mighty蛋白是特異的(圖20)。
其中，前述說明參考文獻已經成為具有公知等同物的整體或者組成部分，並且將所述等同物在此併入如同單獨列出。
儘管本發明已通過實施例並參考其可能的實施方案進行了描述，但是可以理解，在不背離其範圍的前提下可以對其進行改進和修飾。
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序列表110奧維塔有限公司(Ovita Limited)120新的肌肉生長調節物130JC218744-142150NZ5298601512003-11-2716011170PatentIn version 3.12101211576212DNA213羊(ovine)4001atggcgtgcg gggcgacact gaagcggccc atggagttcg aggcggcgct gctgagccct60ggctctccga agcggcggcg ctgcgcccct ctgtccggcc ccactccggg cctcaggccc120ccggacgccg aaccgccgcc gctgcttcag acgcagaccc caccgccgac tctgcagcag180cccgccccgc ccggcagcga gcggcgcctt ccaactccgg agcaaatttt tcagaacata240aaacaagaat atagtcgtta tcagaggtgg agacatttag aagttgttct taatcagagt300gaagcttgta cttcggaaag tcagcctcac tcctcagcac tcacagcacc tagttctcca360ggttcctcct ggatgaaaaa ggaccagccc acctttaccc tccgacaagt tggaataata420tgtgagcgtc tcttaaaaga ctatgaagat aaaattcggg aggaatatga gcaaatcctc480aatactaaac tagcagaaca atatgaatct tttgtgaaat tcacacatga tcagattatg540cgacgatatg ggacaaggcc aacaagctat gtatcc 5762102211192212PRT213羊(ovine)4002Met Ala Cys Gly Ala Thr Leu Lys Arg Pro Met Glu Phe Glu Ala Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Pro Gly Ser Pro Lys Arg Arg Arg Cys Ala Pro Leu Ser20 25 30Gly Pro Thr Pro Gly Leu Arg Pro Pro Asp Ala Glu Pro Pro Pro Leu35 40 45Leu Gln Thr Gln Thr Pro Pro Pro Thr Leu Gln Gln Pro Ala Pro Pro50 55 60Gly Ser Glu Arg Arg Leu Pro Thr Pro Glu Gln Ile Phe Gln Asn Ile65 70 75 80Lys Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Gln Arg Trp Arg His Leu Glu Val Val85 90 95Leu Asn Gln Ser Glu Ala Cys Thr Ser Glu Ser Gln Pro His Ser Ser100 105 110
Ala Leu Thr Ala Pro Ser Ser Pro Gly Ser Ser Trp Met Lys Lys Asp115 120 125Gln Pro Thr Phe Thr Leu Arg Gln Val Gly Ile Ile Cys Glu Arg Leu130 135 140Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Glu Gln Ile Leu145 150 155 160Asn Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Glu Ser Phe Val Lys Phe Thr His165 170 175Asp Gln Ile Met Arg Arg Tyr Gly Thr Arg Pro Thr Ser Tyr Val Ser180 185 1902103211576212DNA213牛(bovine)4003atggcgtgcg gggcgacact gaagcggccc atggagttcg aggcggcgct gctgagccct60ggctctccga agcgacggcg ctgcgcccct ctgtccggcc ccactccggg cctcaggccc120ccggacgccg aaccgccacc gctgcttcag acgcagatcc caccgccgac tctgcagcag180cccgccccgc ccggcagcga ccggcgcctt ccaactccgg agcaaatttt tcagaacata240aaacaagaat atagtcgtta tcagaggtgg agacatttag aagttgttct taatcagagt300gaagcttgta cttcggaaag tcagcctcac tcctcaacac tcacagcacc tagttctcca360ggttcctcct ggatgaaaaa ggaccagccc acctttacgc tccgacaagt tggaataata420tgtgagcgtc tcttaaaaga ctatgaagat aaaattcggg aggaatatga gcaaatcctc480aatactaaac tagcagaaca atatgaatct tttgtgaaat tcacacatga tcagattatg540cgacgatatg ggacaaggcc aacaagctat gtatcc 5762104211192212PRT213牛(boyine)4004Met Ala Cys Gly Ala Thr Leu Lys Arg Pro Met Glu Phe Glu Ala Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Pro Gly Ser Pro Lys Arg Arg Arg Cys Ala Pro Leu Ser20 25 30Gly Pro Thr Pro Gly Leu Arg Pro Pro Asp Ala Glu Pro Pro Pro Leu35 40 45Leu Gln Thr Gln Ile Pro Pro Pro Thr Leu Gln Gln Pro Ala Pro Pro50 55 60Gly Ser Asp Arg Arg Leu Pro Thr Pro Glu Gln Ile Phe Gln Asn Ile65 70 75 80Lys Gln Glu Tyr Ser Arg Tyr Gln Arg Trp Arg His Leu Glu Val Val85 90 95Leu Asn Gln Ser Glu Ala Cys Thr Ser Glu Ser Gln Pro His Ser Ser100 105 110Thr Leu Thr Ala Pro Ser Ser Pro Gly Ser Ser Trp Met Lys Lys Asp115 120 125
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1.含有選自SEQ ID No.2或者SEQ ID No.4的序列的多肽。
2.編碼權利要求1所述多肽的多核苷酸。
3.權利要求2所述的多核苷酸，其選自SEQ ID No.1或者SEQ ID No.3。
4.含有選自下列的核苷酸序列的多核苷酸a)SEQ ID No1或SEQ ID No3的互補序列，b)SEQ ID No1或SEQ ID No3的反向互補序列，和c)SEQ ID No1或SEQ ID No3的反向序列。
5.多核苷酸，其包含由於沉默取代或導致所產生胺基酸中保守取代的取代而與SEQ ID No1或3不同的核苷酸序列。
6.權利要求4或5的多核苷酸編碼的多肽。
7.含有至少一種權利要求1或權利要求6所述多肽或其片段的融合蛋白。
8.含有權利要求2至5中任意一個所述多核苷酸的載體。
9.一種載體，以5』-3』方向含有a)基因啟動子序列；b)權利要求2至5任意一個所述的多核苷酸序列；以及c)基因終止序列。
10.權利要求8或者權利要求9所述的載體，其中多核苷酸為有義方向。
11.權利要求8或者權利要求9所述的載體，其中多核苷酸為反義方向。
12.含有權利要求8至11中任一項所述載體的宿主細胞。
13.用於調節肌肉生長的組合物，含有下述任一a)含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸，b)(a)的片段或變體，c)與(a)有至少95％，90％或70％序列同一性的多核苷酸，d)(a)至(c)中任意一個的互補序列，e)(a)至(c)中任意一個的反向互補序列，f)(a)至(c)中任意一個的反義多核苷酸，g)(a)至(c)中任意一個所編碼的多肽，h)含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽，i)(g)或(h)的片段或變體，和j)相對(g)或(h)有至少95％，90％或70％序列同一性的多肽。
14.調節肌肉生長的組合物，含有下述任意一種a)SEQ ID No.5的序列，b)與SEQ ID No.5有至少95％，90％或70％序列同一性的多核苷酸，和c)(a)或(b)的片段或變體。
15.調節mighty基因表達的組合物，含有能夠結合至選自下述任意一種的多核苷酸的化合物a)SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，或SEQ ID No.5，b)編碼SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸，c)與(a)或(b)有至少95％，90％或70％序列同一性的多核苷酸，d)(a)至(c)中任意一種的互補序列，e)(a)至(c)中任意一種的反向互補序列，和f)(a)至(c)中任意一種的片段或變體。
16.按照權利要求15的組合物，其中化合物為反義多核苷酸。
17.按照權利要求15或者權利要求16的組合物，其中化合物為幹擾RNA分子。
18.按照權利要求17的組合物，其中幹擾RNA分子為RNAi或siRNA分子。
19.按照權利要求15的組合物，其中化合物為肌肉抑制素。
20.按照權利要求15的組合物，其中化合物為肌肉抑制素類似物。
21.按照權利要求20的組合物，其中肌肉抑制素類似物為C-末端在胺基酸位置330和350或者在它們之間被截斷的肌肉抑制素肽。
22.按照權利要求20或者權利要求21的組合物，其中肌肉抑制素類似物為C-末端在胺基酸位置330、335和350中的任一位置被截斷的肌肉抑制素肽。
23.按照權利要求15的組合物，其中化合物為抗體。
24.按照權利要求13至23中任一的組合物，用於治療或預防與肌肉生長相關的疾病。
25.按照權利要求24的組合物，其中疾病與肌肉萎縮相關。
26.按照權利要求24或權利要求25的組合物，其中疾病選自肌營養不良、肌肉惡病、萎縮、肥大、與癌症或HIV有關的肌肉萎縮、肌萎縮性側索硬化症(ALS)，或者與心肌生長相關的疾病，包括梗塞。
27.按照權利要求13至23中任意一種的組合物，用於在肌肉損傷後促進肌肉再生。
28.調節生物體肌肉生長的方法，包括給藥至所述生物體權利要求13至權利要求23中任一項所述的組合物。
29.按照權利要求28的方法，用於生產具有增加的肌肉重量的動物
30.按照權利要求28的方法，用於與肌肉增長相關的疾病的治療或預防。
31.按照權利要求30的方法，其中疾病與肌肉萎縮相關。
32.按照權利要求30或31的方法，其中疾病選自肌營養不良、肌肉惡病、萎縮、肥大、與癌症或HIV有關的肌肉萎縮、肌萎縮性側索硬化症(ALS)，或者與心肌增長相關的疾病，包括梗塞。
33.按照權利要求28的方法，用於在肌肉損傷後促進肌肉再生。
34.按照權利要求13至23中任意一種的組合物在製備調節肌肉生長的藥物中的應用。
35.按照權利要求13至23中任一種的組合物在製備用於治療或預防與肌肉生長相關的疾病的藥物中的應用。
36.按照權利要求35的應用，其中疾病與肌肉萎縮相關。
37.按照權利要求35或權利要求36的應用，其中疾病選自肌營養不良、肌肉惡病、萎縮、肥大、與癌症或HIV有關的肌肉萎縮、肌萎縮性側索硬化症(ALS)，或者與心肌增長相關的疾病，包括梗塞。
38.按照權利要求13至23中任一種的組合物在製備用於在肌肉損傷後促進肌肉再生的藥物中的應用。
39.轉基因動物，其含有按照權利要求8至11任一種的載體，或者含有按照權利要求13至18中任一種的組合物。
40.按照權利要求39的轉基因動物，其中所述動物具有增加的肌肉重量。
41.按照權利要求39或權利要求40的轉基因動物，選自羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠或人類。
42.預測動物肌肉重量的方法，包括步驟i)從動物中獲取樣本，iv)測定具有序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的多核苷酸、與SEQ IDNo.1或SEQ ID No.3有至少95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸、或其片段或變體的基因表達水平；或測定具有序列SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽、與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽、或其片段或變體的數量。v)將基因表達水平或多肽的量與平均值進行比較；和vi)預測所述動物的肌肉重量。
43.按照權利要求2的方法，其中用RTPCR或者northern分析測定基因表達的水平。
44.按照權利要求43的方法，其中用ELISA或者蛋白質印跡分析測定多肽的量。
45.檢測mighty的變體的方法，包括使用選自下列的核苷酸序列a)SEQ ID No.1，SEQ ID No.3，或SEQ ID No.5，b)編碼SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的多肽的多核苷酸，c)與(a)或(b)有至少95％，90％或70％序列同一性的多核苷酸，d)(a)至(c)中任意一種的互補序列，e)(a)至(c)中任意一種的反向互補序列，和f)(a)至(c)中任意一種的片段或變體，在從生物體獲得的樣品中篩選mighty的變體。
46.按照權利要求45的方法，其中變體具有多態性。
47.按照權利要求46的方法，其中多態性為單核苷酸多態性。
48.按照權利要求45至47的任意一種的方法，其中mighty的變體與改變的肌肉表型相關。
49.繁殖具有增長的肌肉重量的動物的方法，包括步驟i)選擇採用按照權利要求42至44或48的任意一種方法預測肌肉重量有所增加的一種或多種動物，和ii)繁殖該一個或多個被預測具有增加的肌肉重量的動物以產生具有改善的肌肉重量的動物。
50.按照權利要求49的方法，其中動物選自羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠或人類。
51.優先結合具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的序列的多肽或者與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽的抗體。
52.含有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4的序列的多肽的抗原性片段，其用於製備優先結合SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4序列或者與SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4有至少95％、90％或70％序列同一性的多肽的抗體。
53.分離的多核苷酸，包含如下任一a)SEQ ID No5的序列，b)與SEQ ID No.5具有95％、90％或70％序列同一性的多核苷酸，c)其具有啟動子活性的片段或變體。
55.按照權利要求54的分離的核苷酸，包含mighty起始位點上遊至少200個核苷酸。
56.按照權利要求54或權利要求55的分離的多核苷酸，包含mighty起始位點上遊209，287，315，400，600，1000和2100個核苷酸中任一片段。
57.含有按照權利要求54至56中任一種的多核苷酸的載體。
58.含有按照權利要求57的載體的宿主細胞。
59.篩選一種或多種在抑制或促進肌肉生長中潛在有效的化合物的方法，包括步驟i)插入按照權利要求54至56中任一種的多核苷酸至連接有合適標記基因的合適的載體中，ii)用載體轉化合適的宿主細胞，iii)對該宿主細胞施用感興趣的化合物，和iv)測定標記基因表達水平的任何差異。
60.按照權利要求59的方法，其中載體為原核質粒、真核質粒或病毒載體中的任意一種。
61.按照權利要求59或權利要求60的方法，其中標記基因為編碼綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、螢光素酶，或者β半乳糖苷酶中任意一種的任一多核苷酸。
62.在肌細胞中表達預期的蛋白的方法，包括步驟i)分離編碼要表達的基因的多核苷酸序列；ii)插入按照權利要求54至56中任意一種的多核苷酸到合適的載體，其以5-3的方向可操作地與要表達的蛋白的多核苷酸序列連接，和iii)將載體導入肌肉宿主細胞。
63.按照權利要求62的方法，其中載體為真核載體、病毒載體，或者適用於基因治療的任意載體中的任意一種。
64.按照權利要求62或權利要求63的方法，其中宿主細胞為原代成肌細胞系、轉化的成肌細胞系或mighty啟動子在其中有活性的任何細胞系。
65.按照權利要求62或權利要求63的方法，其中宿主細胞為宿主動物的體內骨骼肌或心肌細胞。
66.按照權利要求65的方法，其中宿主動物為羊、母牛、公牛、鹿、家禽、火雞、豬、馬、小鼠、大鼠或人中的任意一種。
全文摘要
本發明涉及一種新的肌肉生長調節因子，包括多核苷酸和多肽序列，啟動子序列，含有序列的構建體，以及調節肌肉生長和治療與肌肉生長相關的疾病的組合物。本發明還涉及本發明所述序列在識別具有改變的肌肉重量的動物，以及用於選擇性育種程序以獲得具有改變的肌肉重量的動物中的應用。
文檔編號C07H21/04GK1906211SQ200480041030
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月26日 優先權日2003年11月28日
發明者姆裡杜拉·沙馬, 卡羅爾·貝裡, 馬克·託馬斯, 拉維·坎巴德, 羅伯特·S·鮑爾 申請人:奧維塔有限公司