具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物的製作方法
2023-10-05 02:52:14
專利名稱：具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，特別是涉及表1二醇I組與其餘六組低極性人參皂甙中任何一組或多組低極性人參皂甙的混合物。所述的組合物具有誘導腫瘤細胞分化、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長、逆轉腫瘤多藥耐藥性、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的浸潤和轉移、增強機體免疫力和降低化療藥物毒副作用等抗腫瘤活性。
背景技術：
人參具有多種生理和藥理作用，如抗腫瘤、增強免疫、改善微循環、平穩血壓、調節血糖、降血脂、安神、抗衰老、抗緊張、調節消化機能、預防消化道潰瘍、提高生命質量、增強記憶及學習能力等。在抗腫瘤方面，人參具有1、調控腫瘤細胞的基因表達和促分化；2、抑制腫瘤的浸潤和轉移；3、抑制腫瘤誘導的新生血管生成；4、降低化療藥物的毒副作用；5、逆轉腫瘤耐藥性、提高化療藥靈敏度、增強化療療效等。
人參的藥用形式有鮮參、白參和紅參，三者的關係是鮮參經常溫乾燥獲白參，而經蒸製後乾燥為紅參。使用經驗和藥學研究表明紅參的藥效高於白參和鮮參。現代研究進一步證明紅參的獨特藥效得益於其中含特有的Rg2、Rg3、Rh類、Rk類和多炔類化合物如人參炔醇等天然微量或稀有成分。其中C-K的特點是抑制腫瘤誘導的新生血管形成、抗擊腫瘤的浸襲和轉移；Rg3為抑制腫的浸襲、轉移；Rh2為誘導腫瘤分化。人和低極性人參皂甙的組合物將充分發揮各種低極性人參皂甙的特點，使抗癌活性顯著增強。
中國專利CN1187132A公開了一種藥理活性增強的人參皂甙組合物，該組合物的主要成分是人參皂甙20-(S，R)-Rg3、Rg5、Rk1，另外還含有相當量的非苷類人參皂甙衍生物、少量天然人參皂甙和微量的人參皂甙20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4、20-(S，R)-Rh1、Rh4、Rk3。在專利CN1187132A條件下，大部分三醇組天然人參皂甙分解為非苷類衍生物，而轉化為低極性人參皂甙20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4、20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3的量甚微；並且，專利CN1187132A中天然人參皂甙轉化為低極性皂甙的唯一可控因素是轉化溫度，因此，該專利所述的組合物中各低極性人參皂甙的含量不可控。
發明的技術內容本發明旨在提供多種質量可控的低極性人參皂苷組合物，以充分發揮各種低極性人參皂甙的特點，使抗癌活性顯著增強。該組合物具有多種抗腫瘤活性，如誘導腫瘤細胞分化、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長、逆轉腫瘤多藥耐藥性、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的浸潤和轉移、增強機體免疫力和降低化療藥物毒副作用等。
本發明提供組合物為表1中低極性人參皂甙多組低極性人參皂甙的混合物。
表1 低極性人參皂甙分組分組 低極性人參皂甙生產方法I CompundK、Mx 酶解法(二醇組天然皂甙)II Rg5、Rk1高溫分解(二醇組天然皂甙)二醇組III20-(S)-Rg3、Rh2、PPD 高溫鹼解(二醇組天然皂甙)IV 20-(S，R)-Rg3、Rg5、Rk1酸性熱解(二醇組天然皂甙)I 20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4酸性熱解(人參皂甙Re)三醇組II 20-(S，R)-Rh1、Rh4、Rk3酸性熱解(人參皂甙Rg1)III20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4、 酸性熱解(三醇組天然皂甙)20-(S，R)-Rh1、Rh4、Rk3
其化學結構式為
Glcβ-D-glucopyranosyl；Arapα-L-arabinopyranosyl；Xylβ-D-xylopyranosyl；Arafα-D-arabinofuranosyl；Rha-L-rhamnopyranosyl；Ac6』-O-Acetyl.
Ginsenoside R R』 Ginsenoside R R』Rg5O-Glc2-1Glc H Rk1O-Glc2-1Glc HDiol Rh3O-Glc H Rk2O-Glc HType Rs4O-Glc2-1Glc-Ac H Rs5O-Glc2-1Glc-Ac HF4OH O-Glc2-1RhaRg6OH O-Glc2-1RhaTriol Rh4OH O-Glc Rk3OH O-GlcType Rs6OH O-Glc-Ac Rs1OH O-Glc-Ac本發明具體提供了下述組合物，其特徵在於所述組合物為二醇I組(Compund K和Mx)與下列六組低極性人參皂甙中任何一組或多組低極性人參皂甙的混合物二醇II組Rg5、Rk1，二醇III組20-(S)-Rg3、Rh2、PPD，二醇IV組20-(S，R)-Rg3、Rg5、Rk1三醇I組20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4，三醇II組20-(S，R)-Rh1、Rh4、Rk3，三醇III組20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4、20-(S，R)-Rh1、Rh4、Rk3。
本發明所提供的具有抗腫瘤活性的組合物中，二醇I組所佔比例為20％～90％，總劑量以有效成分低極性人參皂甙計為1-50mg/Kg/天。
本發明所提供的具有抗腫瘤活性的組合物可與任何法定藥用配合劑和賦形劑製成各種藥用劑型的製劑。
本發明所提供的具有抗腫瘤活性的組合物製劑可單獨使用，也可與目前市場上的任何化療藥(包括激素類、烷化劑類、鉑類、抗代謝類、拓撲異構酶抑制劑類、抗微絲微管類、誘導分化類及其它)聯合使用，或製備成複方製劑使用。
本發明所提供的具有抗腫瘤活性的組合物製劑劑型可為口服、注射或局部用藥劑型。
本發明所提供的具有抗腫瘤活性的組合物製劑中，口服劑型可為片劑、粉劑、懸濁液、乳濁液、膠囊、顆粒劑、糖衣片、藥丸、液體、醑劑、糖漿或檸檬水劑等。
本發明所提供的具有抗腫瘤活性的組合物製劑中，注射劑型可為水劑、懸濁液或溶液等。
本發明所提供的具有抗腫瘤活性的組合物製劑中，局部用藥劑型可為軟膏、固體、懸濁液、水劑、醑劑、粉劑、糊劑、栓劑、氣溶膠、泥敷劑、塗抹劑、洗劑、灌腸劑或乳劑等。
本發明所提供的具有抗腫瘤活性的組合物製劑中，賦形劑可以是下列中的一種或多種(a)口服劑型的粉狀賦形劑如乳糖、結晶纖維素、澱粉、糊精、磷酸鈣、碳酸鈣、合成或天然的二氧化鋁、乾燥的氫氧化鋁，硬脂酸鎂、碳酸氫鈉和表面活性劑如磷脂、膽酸、Cremorphor、polysorbate(Tween)80、PluronicL64和poloxamor等；(b)局部用藥劑型的粉狀賦形劑如氧化鋅、滑石、澱粉、高陶土、硼酸鹽粉末、硬脂酸鋅、硬脂酸鎂、碳酸鎂、沉澱碳酸鈣、鹼式沒食子酸鉍、硫酸鉀鋁粉末和表面活性劑如磷脂、膽酸、Cremorphor、polysorbate(Tween)80、Pluronic L64和poloxamor等等；(c)液體用賦形劑如水、甘油、丙二醇、甜味糖漿、乙醇、脂肪油、乙烯甘油、聚乙二醇、山梨醇；軟膏用賦形劑，如混合脂肪，脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蠟、日本蠟、石蠟、硫酸石蠟、樹脂、高級醇、塑料、乙二醇、水或表面活性劑(包括脂溶基、水溶基和懸浮基，如和表面活性劑如磷脂、膽酸、Cremorphor、polysorbate(Tween)80、Pluronic L64和poloxamor)等。
具體實施例方式一、低極性人參皂甙的製備實施例1二醇I組Compund K和Mx的製備二醇組三七莖葉皂甙(25g)與蝸牛酶(84mg)酶溶於32mL磷酸-檸檬酸緩衝液(pH4.5，離子強度為0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；離心反應液、收集沉澱，用水將沉澱物製成懸濁液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)懸濁液，合併乙酸乙酯液，減壓除乙酸乙酯後，獲C-K和Mx混合物(12.6g，人參皂甙總含量＞95％)。
實施例2二醇II組Rg5和Rk1的製備25g人參二醇型皂苷，溶於100ml正相丁醇中(含過氧化苯甲醯0.5g)，在溫度180℃(約0.15MPa)、氮氣保護條件下，攪拌降解5h；反應液經中和(2mol/LHCl)、水洗(100mL×5)、無水硫酸鈉乾燥、減壓蒸出正丁醇後，獲Rg5和Rk1混合物(13.4g，人參皂甙總含量＞95％)。
實施例3二醇III組20-(S)-Rg3、Rh2和PPD的製備25g人參二醇型皂苷，溶於100ml鹼性正相丁醇中(含金屬鈉0.5g，過氧化苯甲醯0.5g)，在溫度180℃(約0.15MPa)、氮氣保護條件下，攪拌降解5h；反應液經中和(2mol/L HCl)、水洗(100mL×5)、無水硫酸鈉乾燥、減壓蒸出正丁醇後，獲20-(S)-Rg3、Rh2和PPD混合物(13.4g，人參皂甙總含量＞95％)。
實施例4二醇IV組20-(S，R)-Rg3、Rg5和Rk1的製備二醇型人參皂苷(25g)與45％的丙二酸水溶液(5ml)浸溼混勻，置於高壓滅菌鍋中，120℃熱解5小時。熱解產物(HPLC分析表明，熱解轉化率≥96％，主產物為20-(R)-Rg3、20-(S)-Rg3、Rg5和Rk1)中，加入100mL水溶液形成懸濁液，用二氯甲烷萃取3次，減壓除去水相中二氯甲烷後，再向其中加入30％的乙醇1000ml，將溶解液進行吸附樹脂柱層析，30％的乙醇洗脫除雜後，用90％的乙醇洗脫回收低極性皂苷。減壓濃縮、蒸乾，獲20-(S，R)-Rg3、Rg5和Rk1混合物(13.3g，人參皂甙總含量＞95％)。
實施例5三醇I組20-(S，R)-Rg2、Rg6和F4的製備人參皂苷Re(25g)與45％沒食子酸水溶液(5ml)浸溼混勻，置於高壓滅菌鍋中，120℃熱解5小時。熱解產物(HPLC分析表明，熱解轉化率≥96％，主產物為20-(S，R)-Rg2、Rg6和F4)中，加入100mL水溶液形成懸濁液，用二氯甲烷萃取3次，減壓除去水相中二氯甲烷後，再向其中加入30％的乙醇1000ml，將溶解液進行吸附樹脂柱層析，30％的乙醇洗脫除雜後，用90％的乙醇洗脫回收低極性皂苷。減壓濃縮、蒸乾，獲20-(S，R)-Rg2、Rg6和F4(13.5g，人參皂甙總含量＞95％)。
實施例6三醇II組20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3的製備人參皂苷Rg1(25g)與45％沒食子酸水溶液(5ml)浸溼混勻，置於高壓滅菌鍋中，120℃熱解5小時。熱解產物(HPLC分析表明，熱解轉化率≥96％，主產物為20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3)中，加入100mL水溶液形成懸濁液，用二氯甲烷萃取3次，減壓除去水相中二氯甲烷後，再向其中加入30％的乙醇1000ml，將溶解液進行吸附樹脂柱層析，30％的乙醇洗脫除雜後，用90％的乙醇洗脫回收低極性皂苷。減壓濃縮、蒸乾，獲20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3(13.1g，人參皂甙總含量＞95％)。
實施例7三醇II組20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3的製備三醇型人參皂苷(25g)與45％丙二酸水溶液(5ml)浸溼混勻，置於高壓滅菌鍋中，120℃熱解5小時。熱解產物(HPLC分析表明，熱解轉化率≥96％，主產物為20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3)中，加入100mL水溶液形成懸濁液，用二氯甲烷萃取3次，減壓除去水相中二氯甲烷後，再向其中加入30％的乙醇1000ml，將溶解液進行吸附樹脂柱層析，30％的乙醇洗脫除雜後，用90％的乙醇洗脫回收低極性皂苷。減壓濃縮、蒸乾，獲20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3(13.2g，人參皂甙總含量＞95％)。
實施例8三醇III組20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4、20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3的製備三醇型人參皂苷(25g)與45％天冬氨酸水溶液(5ml)浸溼混勻，置於高壓滅菌鍋中，120℃熱解5小時。熱解產物(HPLC分析表明，熱解轉化率≥96％，主產物為20(R)-Rg2、20(S)-Rg2、Rg6、F4、20-(R)-Rh1、20-(S)-Rh1、Rh4和Rk3)中，加入100mL水溶液形成懸濁液，用二氯甲烷萃取3次，減壓除去水相中二氯甲烷後，再向其中加入30％的乙醇1000ml，將溶解液進行吸附樹脂柱層析，30％的乙醇洗脫除雜後，用90％的乙醇洗脫回收低極性皂苷。減壓濃縮、蒸乾，獲20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4、20-(S，R)-Rh1、Rh4和Rk3混合物(13.5g，人參皂甙總含量＞95％)。
二、製劑實施例9片劑配方實例低極性人參皂甙二醇I、II、IV和三醇III組(各佔25％)與乳糖、結晶纖維素和1％膽酸鹽的混合物均勻混合，經壓片機製成每片200mg的片劑。
實施例10注射劑配方實例無菌操作下，將低極性人參皂甙二醇I、II、IV和三醇III組(各佔25％)與等量Cremorphor的無水乙醇溶液灌入安瓶，獲200mg/瓶的注射用製劑。
實施例11片劑配方實例低極性人參皂甙二醇I和三醇III組(各佔50％)與乳糖、結晶纖維素和1％膽酸鹽的混合物均勻混合，經壓片機製成每片200mg的片劑。
實施例12片劑配方實例低極性人參皂甙二醇I、II和三醇III組(各佔33％)與乳糖、結晶纖維素和1％膽酸鹽的混合物均勻混合，經壓片機製成每片200mg的片劑。
實施例13片劑配方實例低極性人參皂甙二醇I、IV和三醇III組(各佔33％)與乳糖、結晶纖維素和1％膽酸鹽的混合物均勻混合，經壓片機製成每片200mg的片劑。
三、生物活性實施例14抑制MCF-7和K562細胞生長的活性a)、方法以人乳腺癌MCF-7細胞株和人紅白血病K562細胞株為實驗用細胞株，取對數生長期細胞(2.5×105/mL)接種在96孔板內，由高至低濃度加入藥物溶液，對照組則加入等體積RPM 1640培養液。藥物作用48小時後，按MTT法求生長抑制率和IC50生長抑制率(％)＝[1-實驗組OD值/對照組OD值]×100％IC50是生長抑制率為50％時的藥物濃度。
b)、實驗結果如表1所示。
表1.抑制MCF-7和K562細胞生長活性IC50(μg)MCF-7 K562ADM 1.4±0.1 2.6±0.2二醇I組 13.5±1.7 22.0±1.8二醇II組 15.5±1.9 25.0±2.0二醇III組14.5±1.7 20.0±2.2二醇IV組 15.8±2.7 26.0±2.4三醇I組 26.2±1.2 36.5±1.1三醇II組 29.7±1.4 34.5±1.6三醇III組25.3±1.8 34.2±2.1注低極性人參皂甙的分子量以平均分子量710計。
實施例15抑制Lewis肺癌肺轉移的活性a)、方法將8周齡的C57BL/6無瘤小鼠隨機分組，於接種腫瘤細胞前後2周分別口服給藥人參總皂甙、5-Fu、實施例9片劑和生理鹽水(10mg/Kg/d，5次/d)，腹腔接種Lewis肺癌細胞(0.2ml/只，5×105個細胞/ml)兩周後，處死小鼠，取肺臟作病解，計算肺轉移灶數量，以轉移抑制百分率表示活性高低。
轉移抑制率(％)＝[(對照組肺轉移灶數-實驗組肺轉移灶數)/對照組肺轉移灶數]×100％b)、實驗結果實施例9片劑的肺轉移抑制率為60％，高於5-Fu組(40％)和人參總皂甙組(10％)。
實施例13逆轉腫瘤多藥耐藥性a)、方法以人乳腺癌阿黴素耐藥株MCF-7/ADM及其敏感株MCF-7/S和人紅白血病阿黴素耐藥株K562/A及其敏感株K562/S為實驗用細胞株(以敏感細胞株的IC50為基數，耐藥細胞株對阿黴素的耐藥倍數MCF-7為30倍，K562為62倍)，用MTT法考察化合物在無毒或低毒劑量下化合物對阿黴素IC50(阿黴素耐藥株)影響，根據下列公式計算耐藥倍數。
耐藥倍數＝耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50；b)、實驗結果如表1所示表2.逆轉腫瘤多藥耐藥性活性濃度 細胞生率(％)耐藥倍數(μM) MCF-7/A K562/A MCF-7/A K562/Acontrol 100 98 30.1 62.5Verapamil 10 100 95 7.8 6.9二醇I組5 9084 7.3 0.9二醇II組 5 9495 6.2 4.1二醇III組 5 9485 9.6 6.3二醇IV組 5 9485 7.7 5.5三醇I組5 9085 15.9 10.5三醇II組 5 9085 16.0 11.0三醇III組 5 9085 14.8 9.6注低極性人參皂甙的分子量以平均分子量710計。
權利要求
1.一種具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，其特徵在於所述組合物為二醇I組Compund K和Mx與下列六組低極性人參皂甙中任何一組或多組低極性人參皂甙的混合物二醇II組Rg5、Rk1，二醇III組20-(S)-Rg3、Rh2、PPD，二醇IV組20-(S，R)-Rg3、Rg5、Rk1三醇I組20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4，三醇II組20-(S，R)-Rh1、Rh4、Rk3，三醇III組20-(S，R)-Rg2、Rg6、F4、20-(S，R)-Rh1、Rh4、Rk3。
2.按照權利要求1所述的具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，其特徵在於所述組合物中，二醇I組所佔比例為20％～90％，總劑量以有效成分低極性人參皂甙計為1-50mg/Kg/天。
3.按照權利要求1或2所述的具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，其特徵在於組合物可與任何法定藥用配合劑和賦形劑製成各種藥用劑型的製劑。
4.按照權利要求3所述的具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，其特徵在於組合物可與目前市場上的任何化療藥，包括激素類、烷化劑類、鉑類、抗代謝類、拓撲異構酶抑制劑類、抗微絲微管類、誘導分化類及其它，製備成複方製劑。
5.按照權利要求4所述的具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，其特徵在於所述劑型為口服、注射或局部用藥劑型的任何一種。
6.按照權利要求4所述的具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，其特徵在於所述口服劑型包括片劑、粉劑、懸濁液、乳濁液、膠囊、顆粒劑、糖衣片、藥丸、液體、醑劑、糖漿和檸檬水劑。
7.按照權利要求4所述的具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，其特徵在於所述注射劑型包括水劑、懸濁液、脂質體和溶液。
8.按照權利要求4所述的具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，其特徵在於所述局部用藥劑型包括軟膏、固體、懸濁液、水劑、醑劑、粉劑、糊劑、栓劑、氣溶膠、泥敷劑、塗抹劑、洗劑、灌腸劑和乳劑。
全文摘要
本發明涉及具有抗腫瘤活性的低極性人參皂苷組合物，根據製備方法及其活性特點，將低極性人參皂甙分為七組，本發明特別是涉及二醇I組與其餘六組低極性人參皂甙中任何一組或多組低極性人參皂甙的混合物。所述的組合物充分發揮各種低極性人參皂甙的特點，使抗癌活性顯著增強，組合物具有誘導腫瘤細胞分化、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長、逆轉腫瘤多藥耐藥性、抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤的浸潤和轉移、增強機體免疫力和降低化療藥物毒副作用等抗腫瘤活性，極具開發潛力。
文檔編號A61K9/00GK1600317SQ0313409
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月28日 優先權日2003年9月28日
發明者楊凌, 何克江 申請人:中國科學院大連化學物理研究所