一種屎腸球菌製劑及其生產工藝的製作方法

2023-10-05 01:43:39

專利名稱：一種屎腸球菌製劑及其生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種屎腸球菌製劑及其生產工藝。
背景技術：
飼料中添加抗生素對集約化畜牧業發展做出重大貢獻的同時，其產生的副作用如內源性感染和二重感染、耐藥性的產生、腸道正常菌群的破壞和畜產品及環境中的殘留等對養殖業、動物以及人類食品安全帶來嚴重威脅。益生素就是以活的微生物為主，動物攝入一定量後，在胃腸道特定部位有一定數量的菌株能夠粘附、定植和生長，主要通過調節腸道微生物菌群結構和平衡，對動物生長和健康起到有益作用的製劑，是一種良好的的替代抗生素的新型綠色安全添加劑。屎腸球菌(Enterococcus Faecium)廣泛存在於自然界和畜禽胃腸道內，是一種有益微生物，普通的屎腸球菌因其耐酸、耐高溫等特性較差，未能在飼料添加劑中廣泛應用。 因此，根據目前畜牧業的需求，篩選一株耐酸耐高溫具有益生特性的屎腸球菌具有廣闊的發展前景。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種屎腸球菌製劑。本發明提供的製劑，其活性成分為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058。本發明的另一個目的是提供一種製備上述製劑的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)發酵屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康 80 CGMCC No. 5058，離心收集沉澱， 得到菌泥；2)將步驟1)得到的菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、無菌水混勻乳化，即得到屎腸球菌製劑。在上述方法中，步驟1)中，所述發酵的溫度為所述發酵的溫度為15°C -45°c，所述發酵的時間為10小時-18小時，所述發酵所需的PH值為4. 5-8. 6，所述發酵的壓力為 0.OlMpa-O. 03Mpa ；上述發酵的溫度具體為15°C、37°C或45°C，所述發酵的時間為10小時、12小時或 18小時，所述發酵所需的pH值具體為6. 4-6. 6 ；上述發酵的攪拌速度為80rpm/min-120rpm/min，具體可為 80rpm/min、IOOrpm/ min 或 120rpm/min ；在上述方法中，步驟2)中，所述菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水的配比為 3X10ncfu-8X10ncfu 0. 5g_2. 5g 0. Ig-Ig 0. Ig-Ig IOg ；上述菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水的配比具體為3 X IO11Cfu, 5X IO11Cfu 或 8X IO11Cfu 0.58、18或2.58 0. lg、0.5g 或 Ig 0. lg、0.3g 或 Ig IOgo
在上述方法中，步驟1)中，所述發酵採用的培養基按照如下方法製備將蔗糖、蛋白腖、酵母粉、K2HPO4, KH2PO4 · 3H20、MnSO4, MgSO4 · 7H20和水混勻，得到培養基，所述蔗糖在所述發酵培養基中的濃度為35g/L-45g/L，所述蛋白腖在所述發酵培養基中的濃度為5g/ L-15g/L，所述酵母粉在所述發酵培養基中的濃度為15g/L-25g/L，所述K2HPO4在所述發酵培養基中的濃度為lg/L-5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述發酵培養基中的濃度為0. 5g/ L-1. 5g/L，所述MnSO4在所述發酵培養基中的濃度為0. 01g/L-0. 03g/L，所述MgSO4 ·7Η20在所述發酵培養基中的濃度為0. lg/L-0. 6g/L。在本發明的實施例中，上述蔗糖在所述發酵培養基中的濃度具體為35g/L、40g/L 或45g/L，所述蛋白腖在所述發酵培養基中的濃度具體為5g/L、10g/L或15g/L，所述酵母粉在所述發酵培養基中的濃度具體為15g/L、20g/L或25g/L，所述K2HPO4在所述發酵培養基中的濃度具體為lg/L、4g/L或5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述發酵培養基中的濃度具體為 0. 5g/L、lg/L或1. 5g/L，所述MnSO4在所述發酵培養基中的濃度具體為0. 01g/L、0. 02g/L或 0. 03g/L，所述MgSO4 · 7H20在所述發酵培養基中的濃度具體為0. Ig/L、0. 4g/L或0. 6g/L ；上述方法中，所述離心力為1800g_2200g，所述離心力具體為1800g、2000g或 2200g ；所述離心的時間為5min-10min，所述離心的時間具體為5min、8min或IOmin ；在上述方法中，步驟2)中，所述乳化的溫度為25°C 48°C，所述乳化的時間為 25min_45min ；在上述方法中，所述乳化的溫度具體為251、271或觀1，所述乳化的時間為 25min、30min 或 45min。在上述方法中，在所述步驟2~)後，在所述乳化後還包括將乳化產物乾燥得到屎腸球菌製劑的步驟，其中乾燥採用低溫真空乾燥箱在低溫溫度27-50°C，真空度-0. 096Mpa條件下進行。由上述的方法製備的屎腸球菌製劑也是本發明保護的範圍。上述的屎腸球菌製劑在作為動物飼料添加物中的應用也是本發明保護的範圍。上述的屎腸球菌製劑在製備動物飼料中的應用也是本發明保護的範圍。上述的屎腸球菌製劑在促進動物生長中的應用也是本發明保護的範圍。在上述應用中，所述促進動物生長為如下1)或2)1)提高豬平均日增重、提高豬平均日採食量、提高豬皮毛指數、降低豬料肉比和/ 或降低豬腹瀉率；2)提高雞平均日增重和/或提高平均日採食量；在上述應用中，所述動物為豬或雞。本發明的實驗證明，本發明通過分離、鑑定、篩選，得到屎腸球菌康80，其抗逆性強、抗雜菌能力強、具有益生特性，本發明將其進行乳化製備得到屎腸球菌製劑，可以作為添加劑用於製備動物飼料，其中的動物包括但不限於豬、牛、羊、雞等各種動物。該飼料具有與抗生素飼料類似的功能，但無抗生素飼料的副作用。本發明的屎腸球菌主要作為動物飼料的添加劑，可替代現有動物日糧中的抗生素，調節動物腸內微生態平衡，從而具有增強非特異性免疫功能來預防疾病的作用，同時還可以提供營養因子、促進營養物的消化吸收、降低腹瀉、促進動物生長和提高飼料轉化率、提高斷奶仔豬以及生長育肥豬的生產性能。本發明的屎腸球菌對防治動物消化系統疾病起到保健作用，同時對幼年動物可刺激其胃腸道發育，所以將之作為飼料添加劑應用在飼料中能起到抗病促生長的作用。同時， 本發明的屎腸球菌無耐藥性和藥物在動物產品中殘留，不會對人類的健康產生潛在的危害，是一種有前途的綠色飼料添加劑。上述提到的菌株康80於2011年7月14日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 5058，其分類命名為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)。


圖1為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80的生長曲線圖2為飼料樣品中乳酸菌16S rRNA基因序列系統發育樹圖3為屎腸球菌發酵生產流程圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中所用的培養基如無特殊說明配方如下1、MRS肉湯培養基蛋白腖10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐溫80 1ml，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三氨2g，七水硫酸鎂0. 2g，四水硫酸錳0. 05g,酵母粉4g，用蒸餾水定容至1L。2、MRS瓊脂培養基IL MRS肉湯培養基中加瓊脂15g。3、麥康凱培養基月示腖3g，豬膽鹽5g，中性紅0. 025g，蛋白腖17g，乳糖10g，結晶紫0. OOlg，氯化鈉5g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1L。4、Ml7 培養基大豆蛋白腖5. Og,酵母提取物5. Og,酪蛋白腖5g，抗壞血酸0. 5g，牛肉浸膏2. 5g， β -甘油磷酸二鈉19g，MgS04 · 7H20 0. 25g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至IL0實施例1、屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80的分離及鑑定本發明的屎腸球菌是從飼料樣品中提取、分離、篩選、純化得到的。(一 )屎腸球菌康80 (NFER-5)的分離與純化1. 1菌株的分離培養取Ig健康斷奶仔豬糞便於裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，漩渦器震蕩混勻，即為1 10稀釋液，再取稀釋液進行十倍遞增稀釋，然後選擇3個適宜梯度的稀釋液各ImL塗布於含有IOppm放線菌酮的MRS瓊脂培養基及M17瓊脂培養基，37°C厭氧培養48 72h，觀察並記錄菌落形態，挑取長勢良好的特徵單菌落於MRS液體培養基中，進行劃線分離純化。 觀察肉湯是否變渾濁，有渾濁的放置4°C冰箱貯藏備用。1.2革蘭氏染色用無菌注射器吸取少量MRS肉湯培養物，滴在載玻片上，在酒精燈火焰上輕輕烘
6幹固定。滴加結晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革蘭氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 7)脫色30s，水洗；滴加沙黃染色液復染ImindK 洗，待幹，在普通光學顯微鏡上觀察，菌體呈紅色為陰性，紫色的為陽性。呈革蘭氏陽性形態一致的桿菌，進一步進行接觸酶試驗。1. 3接觸酶試驗做MRS斜面培養基，取培養物約0. 2mL注入裝有MRS瓊脂培養基斜面，5 % C02培養箱，37°C培養Mh，長出菌落後，將3%過氧化氫溶液滴加到菌落上，若沒有氣泡產生說明是陰性，若有氣泡產生說明是陽性。通過MRS培養基厭氧培養的培養物經革蘭氏染色陽性和接觸酶試驗陰性可初步認為是乳酸菌屬(Lactobacillus)。3份飼料樣品經分離純化，結合革蘭氏染色和接觸酶試驗，共分離出5株乳酸菌， 其中桿菌3株，球菌2株，並分別命名為NFER-1、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5。( 二 )、抗逆性選育與生物學特性研究1. 1耐熱性能選育將上述篩選的5 株待測菌株 NFER-I、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5 按 2 % (ν/ ν)的接種量接種到MRS液體培養基中，分別於60°C、70°C、80°C水浴鍋內處理IOmin後測定其活菌數，37°C恆溫培養24h後觀察結果，比較其在各溫度下處理前與處理後的活菌數。存活率的計算公式為S 熱=Ii1Ai0;S熱為分別經過60°C、70°C、8(rC處理後的屎腸球菌存活率；Iitl為加熱處理前每毫升活菌數；叫為加熱處理IOmin後每毫升活菌數。結果如表1所示，從表1中可以看出，NFER-2，NFER-4，NFER-5在70°C熱處理IOmin 後還有一定活菌數，且NFER-5濃度高達1. 72X 105,且NFER-5在80°C處理IOmin後仍有較高活菌數，濃度為1. OOX 104。而NFER-l，NFER-3在70°C處理IOmin之後無活菌，證明該兩株菌株不耐熱。一般仔豬飼料的制粒溫度為70°C 85°C之間，耐高溫之後存活率低也是乳酸菌作為飼料添加劑的主要限制性因素之一。從耐熱存活率看，本試驗選育的發酵乳酸桿菌可以耐受制粒時的高溫，作為飼料添加劑將會有較好的前途。選取NFER-2，NFER-4，NFER-5 進行下一步篩選。表1耐熱試驗結果
權利要求
1.一種屎腸球菌製劑，其活性成分為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058。
2.一種製備權利要求1所述的製劑的方法，包括如下步驟1)發酵屎腸球菌(EnterococcusFaecium)康80 CGMCC No. 5058，離心收集沉澱，得到菌泥；2)將步驟1)得到的菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水混勻乳化，即得到屎腸球菌製劑。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述發酵的溫度為15°C _45°C，所述發酵的時間為10小時-18小時，所述發酵所需的PH值為4. 5-8. 6，所述發酵的壓力為0. OlMpa-O. 03Mpa ；所述發酵的溫度具體為15°C、37°C或45°C，所述發酵的時間為10小時、12小時或18小時，所述發酵所需的PH值具體為6. 4-6. 6 ；步驟2)中，所述菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水的配比為SxiO11Cfu-Sx IO11c fu 0. 5g-2. 5g 0. Ig-Ig 0. Ig-Ig IOg ；所述菌泥、麥芽糊精、海藻糖、阿拉伯樹膠、水的配比具體為SxiollCfiuSxio11Cfu或 8 X IO11Cfu 0. 5g、lg 或 2. 5g 0. lg、0. 5g 或 Ig 0. lg、0. 3g 或 Ig 10g。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述發酵採用的培養基按照如下方法製備將蔗糖、蛋白腖、酵母粉、 K2HPO4^KH2PO4 -3H20,MnS04,MgSO4 ·7Η20和水混勻，得到培養基，所述蔗糖在所述發酵培養基中的濃度為35g/L-45g/L，所述蛋白腖在所述發酵培養基中的濃度為5g/L-15g/L，所述酵母粉在所述發酵培養基中的濃度為15g/L-25g/L，所述K2HPO4在所述發酵培養基中的濃度為lg/L-5g/L，所述KH2PO4 ·3Η20在所述發酵培養基中的濃度為0. 5g/L_l. 5g/L，所述MnSO4 在所述發酵培養基中的濃度為0. 01g/L-0. 03g/L，所述MgSO4 · 7H20在所述發酵培養基中的濃度為 0. lg/L-0. 6g/L。所述蔗糖在所述發酵培養基中的濃度具體為35g/L、40g/L或45g/L，所述蛋白腖在所述發酵培養基中的濃度具體為5g/L、10g/L或15g/L，所述酵母粉在所述發酵培養基中的濃度具體為15g/L、20g/L或25g/L，所述K2HPO4在所述發酵培養基中的濃度具體為lg/L、4g/ L或5g/L，所述KH2PO4 ·3Η20在所述發酵培養基中的濃度具體為0. 5g/L、lg/L或1. 5g/L，所述MnSO4在所述發酵培養基中的濃度具體為0. 01g/L、0. 02g/L或0. 03g/L，所述MgSO4 ·7Η20 在所述發酵培養基中的濃度具體為0. Ig/L、0. 4g/L或0. 6g/L ；所述離心力為1800g-2200g，所述離心力具體為1800g、2000g或2200g ；所述離心的時間為5min-10min，所述離心的時間具體為5min、8min或IOmin ；步驟2)中，所述乳化的溫度為25°C 48°C，所述乳化的時間為25min-45min ； 所述乳化的溫度具體為25°C、27°C或^°C，所述乳化的時間為25min、30min或45min。
5.根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特徵在於在所述步驟2、後，在所述乳化後還包括將乳化產物乾燥得到屎腸球菌製劑的步驟。
6.由權利要求2-5中任一所述的方法製備的屎腸球菌製劑。
7.權利要求1屎腸球菌製劑或權利要求6所述的屎腸球菌製劑在作為動物飼料添加物中的應用。
8.權利要求1屎腸球菌製劑或權利要求6所述的屎腸球菌製劑在製備動物飼料中的應用。
9.權利要求1屎腸球菌製劑或權利要求6所述的屎腸球菌製劑在促進動物生長中的應用。
10.根據權利要求7-9中任一所述的應用，其特徵在於 所述動物為豬或雞。
全文摘要
本發明公開了一種屎腸球菌製劑及其生產工藝。本發明提供的製劑，其活性成分為屎腸球菌(Enterococcus Faecium)康80 CGMCC No.5058。本發明的實驗證明，本發明通過分離、鑑定、篩選，得到屎腸球菌康80，其抗逆性強、抗雜菌能力強、具有益生特性，本發明將其進行乳化製備得到屎腸球菌製劑，可以作為添加劑用於製備動物飼料，其中的動物包括但不限於豬、牛、羊、雞等各種動物。
文檔編號A23K1/16GK102391962SQ20111034425
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者丁修良, 宋青龍, 王勁松, 譙仕彥 申請人:北京龍科方舟生物工程技術中心