利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法及其專用表達載體的製作方法
2023-10-05 02:34:54 3
專利名稱：利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法及其專用表達載體的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術產品應用領域中蛋白幹涉的方法，特別是涉及一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法及其專用表達載體。
背景技術：
蛋白質是機體生命活動的重要體現者，其缺失或過量表達都將導致嚴重的缺陷病症，通過直接手段研究蛋白質的功能將為其相關疾病的治療提供重要手段。目前常用於研究蛋白質功能的模式生物主要有秀麗線蟲，小鼠和真核生物細胞等。其中，秀麗線蟲因其細胞數量明確、遺傳背景清楚、基因組小及易於操作等優點已廣泛應用於遺傳學、發育生物學、神經生物學和分子生物學等多個研究領域(Greer et al. Members of the H3K4 trimethylation complex regulate lifespan in a germline-dependent manner in C. elegans. Nature. 2010 Jul 15,466(7304) :383-7)。基於秀麗線蟲平臺規模化篩選其體內功能性蛋白的作用已成為目前研究的熱點。傳統基因水平上的顯微注射和RNA幹涉雖能到達研究秀麗線蟲體內功能蛋白的作用，但由於其存在操作繁瑣、成本高、周期長及破壞性大等缺點，更甚至於會出現功能蛋白不表達的現象，使秀麗線蟲體內重要功能蛋白的研究及相應表型的篩選受到了極大限制(Rieckher et al. Transgenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol.2009,561 :21-39 ；Shyu et al. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 2008,3(4) :588-96.)。通常情況下，很多蛋白質是通過與其相互作用的蛋白質發生作用即所謂的蛋白質——蛋白質相互作用 (protein-protein interaction，PPI)從而實現其特定功能。基於此，向秀麗線蟲體內引入一種能夠與秀麗線蟲體內已有的蛋白質發生相互作用導致原有蛋白調控網絡異常從而形成功能干涉，或者直接向秀麗線蟲體內引入兩種或兩種以上可在秀麗線蟲體內通過蛋白質相互作用導致原有蛋白調控網絡異常從而形成功能干涉的蛋白質，有可能對於揭示蛋白質之間的相互作用以及確定重要蛋白的功能具有重要意義。這一思路尚未見諸於已有文獻。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的專用表達載體。本發明所提供的專用表達載體，是含有一個或多個相同或不同蛋白轉導肽的原核表達載體。所述蛋白轉導肽可為TAT、Antp, VP22、Poly(Arg)和/或Poly (Lys)等，優選為 TAT。用於構建所述原核表達載體的出發載體可為任意一種外源基因的原核表達載體，
4如 pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT_T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等，優選為 pET28。本發明的第二個目的是提供一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法。本發明所提供的利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法，是將待鑑定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入前述專用表達載體中，將得到的原核表達載體轉化入大腸桿菌並誘導表達，得到的重組大腸桿菌餵飼正常株系秀麗線蟲，根據秀麗線蟲生物及生化指標檢測結果評估相互作用蛋白發生幹涉的能力和強度。具體可包括以下步驟1)確定至少一對具有相互作用的功能蛋白(包括誘餌蛋白和獵物蛋白)為靶蛋白並分別克隆其編碼基因；2)將靶蛋白編碼基因分別插入上述專用表達載體中，得到含有蛋白轉導肽編碼區和靶蛋白編碼基因相融合的原核表達載體；3)將步驟2)構建的原核表達載體分別轉化入大腸桿菌原核表達系統；4)原核表達載體的誘導表達及蛋白表達水平檢測；5)將體外表達各靶蛋白的重組大腸桿菌單獨或混合餵飼正常株系秀麗線蟲；6)秀麗線蟲生物及生化指標檢測並評估靶蛋白之間發生幹涉的能力和強度。所述步驟1)中靶蛋白可以是單個的功能蛋白，也可以是兩個或多個具有相互作用的功能蛋白。該蛋白可以是秀麗線蟲自身蛋白，也可以是其他物種中具有潛在相互作用的蛋白。在上述利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法中，所述步驟3)中大腸桿菌原核表達系統的宿主菌可為BL21、DH5 α、HBlOl、JM109、0Ρ50或耐
輻射奇球菌等。上述重組表達載體和重組菌均可按照常規方法構建。所述步驟4)中可採用化學試劑誘導外源基因在大腸桿菌原核表達系統中表達， 其中，化學試劑誘導表達條件可為採用500mL搖瓶發酵(150mL/瓶)；誘導劑IPTG誘導表達(終濃度ImM)；誘導表達的OD6tltl = 0. 6-1. 0 ；誘導表達時間6_8小時。所述步驟4)中還可採用溫度誘導外源基因在大腸桿菌原核表達系統中表達，其中，溫度誘導表達條件可為採用500mL搖瓶30°C發酵(150mL/瓶)；誘導表達的0D_ = 0. 4-0. 6 ；誘導表達溫度42°C -44°C ；誘導表達時間6_8小時。此外，所述步驟4)中的蛋白表達水平檢測可採用SDS-PAGE和/或免疫印跡法。所述步驟5)中餵飼秀麗線蟲的大腸桿菌是步驟4)中鑑定表達靶蛋白的菌株且預先塗布到NGM平皿或LB平皿中；其餵飼方式可以為單獨餵飼或按一定比例如1 5、1 2、 1 1、2 1、5 1的方式混合餵飼。所述步驟6)中秀麗線蟲生物及生化指標檢測，生物指標具體包括形態結構變化和細胞水平變化等，如是否出現體型變小或肥胖、是否出現空泡現象、是否出現運動行為失調等；生化指標具體包括靶蛋白或其調控因子表達水平檢測，如蛋白質，DNA和RNA等。其表達水平檢測可以為免疫印跡，凝膠遷移實驗和聚合酶鏈式反應等。本發明結合蛋白轉導域家族的研究，以及利用秀麗線蟲的主要食物來源大腸桿菌為中介，提供了一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法及其專用表達載體。本發明所述蛋白幹涉(protein interfere)是指通過給秀麗線蟲餵飼能夠表達可與秀麗線蟲體內的靶蛋白相互作用的功能蛋白的微生物如大腸桿菌，從而可導致在秀麗線蟲體內出現該功能蛋白被通過相互作用而發生幹涉作用後產生表型異常的技術， 同時還包括直接將兩種或兩種以上可表達能夠相互作用的功能蛋白的微生物如大腸桿菌直接餵飼秀麗線蟲，通過在秀麗線蟲體內發生兩種蛋白之間的相互作用可導致秀麗線蟲出現特定表型的技術，即基於秀麗線蟲的「雙雜交」反應(C. elegans two-hybridization, C2H)。本發明不僅能夠克服常規基於模式生物秀麗線蟲研究功能蛋白方法的缺陷，而且可以通過微生物如大腸桿菌直接轉導體外高效表達的功能蛋白，避免了功能性基因不表達的現象，進而節約了特異功能蛋白篩查及大規模研究的成本等。同時，迄今為止未見利用蛋白轉導肽的跨膜轉導作用並依賴大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的研究報導。本發明提供的利用大腸桿菌原核表達系統從蛋白質角度幹涉秀麗線蟲體內功能蛋白的方法，具有十分廣泛的應用前景，有望成為重組蛋白類藥物篩選的重要技術手段，同時也將有可能成為蛋白質功能研究的重要技術之一。本發明利用秀麗線蟲平臺及原核表達體系首次提出了蛋白幹涉的作用，為基於蛋白功能的研究及載體篩選提供重要的技術平臺，具有重要的原創性和新穎性。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1 原核表達載體pET28b-Tat_EGFP和pET28b_EGFP的構建示意圖。圖 2 =SDS-PAGE 和 Western blot 檢測 Tat-EGFP 和 EGFP 蛋白的表達。圖3 螢光顯微鏡觀察表達EGFP的菌體細胞的螢光信號。圖4 螢光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP蛋白螢光信號在秀麗線蟲體內分布變化。
圖5 原核表達載體pEI^8-Tat-Hif_l和pEI^8_Hif-l構建的菌液PCR鑑定結果。圖6 原核表達載體pET28-Tat-VHL_l和pET28-VHL_l構建的菌液PCR鑑定結果。圖7 =SDS-PAGE檢測Tat-Hif-I和Hif-I蛋白的表達變化，圖中箭頭所示為靶蛋白 Tat-Hif-I和Hif-I所在位置。圖8 =SDS-PAGE檢測Tat-VHL-I和VHL-I蛋白的表達變化，圖中箭頭所示為靶蛋白 Tat-VHL-I和VHL-I所在位置。
具體實施例方式實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1、利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的專用表達載體的構建可採用任何已知的方法構建利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的專用表達載體，該專用表達載體是含有一個或多個相同或不同蛋白轉導肽的原核表達載體，所述蛋白轉導肽為TAT、Antp、VP22、Poly(Arg)和/或Poly(Lys)等，用於構建所述原核表達載體的出發載體可為任意一種外源基因的原核表達載體，如PET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等。本實施例以 pET28b 為出發載體構建含有TAT的重組表達載體為例，介紹了一種構建秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的專用表達載體的方法，含有其它蛋白轉導肽的重組表達載體也可參照此方法構建，具體構建方法為首先通過化學合成的方法合成含有酶切位點為NcoI (上遊)和NdeI (下遊)的雙鏈TAT肽段(GenBank :ADK70247. 1)的核心編碼序列片段，然後採用限制性內切酶NcoI和 NdeI雙酶切該TAT核心片段和空載體pET28b (美國Novagen公司)，分別回收目的片段後， 經T4 DNA連接酶連接經酶切的TAT DNA片段和空載體片段，再將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞BL21 (DE3)中，篩選重組子，按照常規方法提取重組子的質粒DNA並進行NcoI 和NdeI雙酶切鑑定，最後送英駿公司直接測序，確證含有TAT核心片段的原核表達載體構建成功，將該重組載體命名為pET28b-TAT。實施例2、利用大腸桿菌原核表達系統實現綠色螢光蛋白在正常株系秀麗線蟲體內跨膜轉導 1)原核表達載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的構建及誘導表達首先以質粒pEGFP-Nl (購自Clontech公司)為模板並利用引物對(斜體部分分別為 BamHI 和 XhoI 酶切位點pU_5，_CGC GGATCCk TGGTGAGCAAGGGCGAG-3，(序列表中序列 1) ；pD_5，-CCG 67Cfi46CTTGTACAGCTCGTCCAT-3，(序列表中序列 2)進行 PCR 擴增獲得增強型綠色螢光蛋白(EGFP，GenBank號ADQ73885. l)cDNA編碼序列(717bp)，然後採用限制性內切酶BamHIAhoI雙酶切目的基因EGFP和質粒載體ρΕΤ2^3和ρΕΤ2^3-ΤΑΤ ；酶切產物回收後採用Τ4 DNA連接酶於16°C連接過夜；次日，將轉化產物全部轉化入大腸桿菌BL21(DE3) 並採用限制性內切酶酶切和直接測序鑑定。酶切和測序鑑定結果表明獲得了攜帶有蛋白轉導肽TAT核心肽段的綠色螢光蛋白的原核表達載體pET28b-TAT-EGFP和僅攜帶有綠色螢光蛋白的原核表達載體pET28b-EGFP，構建方法示意圖如圖1所示。2)隨後，將轉化有質粒載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的宿主菌 BL2KDE3)塗布到含有卡那黴素(終濃度100yg/ml)的LB固體培養基，37°C恆溫箱孵育 10-12小時待長出克隆。次日，挑取陽性克隆接種到5ml含有卡那黴素(終濃度ΙΟΟμ g/ml) 的LB液體培養基中，37°C、220rpm搖菌過夜使菌體完全復甦；然後按照1 100的比例將菌液接種到150ml新配置的含有卡那黴素(終濃度100 μ g/ml)的LB液體培養基中，37°C、 220rpm搖菌約4_5小時，待0D_為0. 6-1. O時加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside, IPTG)，終濃度 ImM)，迅速置於 30°C、220rpm 搖床誘導表達6小時，並於第2小時，第4小時和第6小時收集菌體細胞，部分菌體細胞待螢光顯微鏡觀察，其餘菌體細胞超聲破碎後直接製備上清蛋白樣品待SDS-PAGE和Western blot檢測。SDS-PAGE和Wfestern blot檢測方法為A、將上述超聲破碎後直接製備的上清蛋白樣品採用15% SDS-PAGE分離，然後採用考馬斯亮藍R-250染色並脫色，最後採用凝膠成像儀採集圖像；B、隨後，將上述製備的上清蛋白樣品經15% SDS-PAGE分離後按照說明書所述方法轉印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30分鐘；其次採用EGFP(TBST 1 3000 稀釋)和GAPDH(TBST 1 500稀釋)單克隆抗體室溫共孵育1. 5小時，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；然後採用辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 二抗(TBST 1 5000 稀釋)室溫孵育30分鐘，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；最後採用ECL化學發光檢測試劑盒顯影並掃描，以pET28b和pET28b-TAT為空載體對照。結果如圖2所示(圖中箭頭所示分別為內標蛋白GAPDH，TAT-EGFP和EGFP蛋白條帶所在位置)，表明通過體外誘導表達及SDS-PAGE和免疫印跡檢測發現實現了綠色螢光蛋白的高效可溶性表達。3)誘導表達菌體的螢光顯微鏡觀察將上述誘導表達的菌體細胞採用10 μ 1接種環均勻地塗布到乾淨的載玻片上，待其自然風乾後採用螢光顯微鏡觀察菌體細胞螢光信號，分別採集誘導表達不同時間點菌體細胞的螢光圖像及微分幹涉圖像，最後通過圖像合併技術觀察TAT-EGFP和EGFP在大腸桿菌細胞中的表達情況，以pET28b和pET28b-TAT為空載體對照。誘導表達菌體螢光顯微鏡觀察結果如圖3所示(螢光顯微鏡觀察不同誘導時間菌體細胞螢光信號圖中表示針對誘導表達不同時間的菌體細胞進行螢光信號的檢測0h(A) ,2h(B)、4h(C) ,6h(D))，隨著誘導表達時間的增加，菌體細胞中表達的綠色螢光蛋白在增加。4)正常株系秀麗線蟲的餵飼及螢光顯微鏡觀察將誘導表達TAT-EGFP和EGFP融合蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)菌體細胞塗布到 LB平皿中，待其室溫稍幹後置於20°C生化培養箱培養72小時待大量克隆長出，挑取正常株系秀麗線蟲20隻於20°C生化培養箱培養並採用螢光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP螢光信號在秀麗線蟲體內分布，並於餵飼第48小時採集螢光圖像和微分幹涉圖像，最後通過圖像合併技術觀察TAT-EGFP和EGFP融合蛋白在秀麗線蟲體內的分布情況，以pET28b和 pET28b-TAT為空載體對照。螢光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP蛋白螢光信號在秀麗線蟲體內分布變化如圖4所示(圖中箭頭所示為TAT-EGFP和EGFP融合蛋白在秀麗線蟲體內的分布位置)，通過直接餵飼秀麗線蟲表達靶蛋白的大腸桿菌細胞48小時後，TAT-EGFP螢光信號明顯分布於秀麗線蟲腸壁細胞，而EGFP螢光信號則分布在秀麗線蟲腸腔，空載體對照組未見任何螢光信號，說明TAT蛋白轉導肽能夠高效介導外源蛋白在秀麗線蟲體內跨膜轉導。同時，通過比較空載體對照組與實驗組秀麗線蟲微分幹涉圖像未見其出現明顯的細胞形態變化，由此說明TAT蛋白轉導肽具有相對安全的跨膜轉導作用，能夠介導外源蛋白跨膜轉導進入秀麗線蟲腸壁細胞，為後續基於秀麗線蟲平臺及原核表達體系研究秀麗線蟲體內功能蛋白的幹涉提供了技術支持。實施例3、利用大腸桿菌原核表達系統實現正常株系秀麗線蟲體內相互作用蛋白 Hif-I和VHL-I的幹涉1.方法1)秀麗線蟲體內部分蛋白相互作用關係分析生物體相互作用蛋白可以基於生物信息學手段深入挖掘獲得或根據現有生物學資料庫自行構建獲得。本發明針對秀麗線蟲體內部分功能蛋白對其相互作用關係進行了分析，通過分析發現在線蟲體內存在相互作用且已通過實驗驗證的蛋白有Hif-1/VHL-l和 gpd-2/gpd-3，故本發明後續選取Hif-I和VHL-I作為具有相互作用的靶蛋白進行蛋白幹涉的研究。2)原核表達載體 pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I 和 pEI^8-Tat-VHL-l/VHL_l 的構建及誘導表達參照實施例2的載體構建方法構建攜帶秀麗線蟲Hif-I和VHL-I的cDNA編碼序列及Tat轉導肽序列的原核表達載體，以不含轉導肽的原核表達載體為對照。首先針對正常株系秀麗線蟲提取總RNA並反轉錄，然後以反轉錄產物為模板並結合以下引物對(斜體部分分別為酶切位點)pU_BamHI-Hif-I :5，-CGC GGATCCk TGGAAGACAATCGGAAAAGAAACA-3『(序列表中序列3)pD_XhoI-Hif-I 5' -CCG CTCGAGk GAGAGCATTGGAAATGGGGAAT-3『(序列表中序列
4)pU_BamHI-VHL-I :5，-CGC GGATCCK TGTCAGACGGTTCGATGGATGA-3『(序列表中序列
5)pD_XhoI-VHL-I :5，-CCG CTCGAG\ TGCTGAGGTCTCTGGGGTCC-3『(序列表中序列 6) 進行PCR擴增以獲得Hif-I和VHL-I的cDNA編碼序列，然後將目的基因和載體酶切後構建原核表達載體pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I和pET28-Tat-VHL-l/VHL_l，最後將上述載體酶切及直接測序確證，其中pEI^8-Tat-Hif-l由序列表序列7表示，pEI^8_Hif-l由序列表序列 8表示，pET28-Tat-VHL-l由序列表序列9表示，pET28_VHL_l由序列表序列10表示，菌液 PCR鑑定結果如圖5和圖6所示，隨後，將上述構建正確的原核表達載體pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I和 pET28-Tat-VHL-l/VHL-l分別轉化入宿主菌BL21(DE3)並塗布到含有卡那黴素(終濃度 100yg/ml)的LB固體培養基，37°C恆溫箱孵育10-12小時待長出克隆。次日，挑取陽性克隆接種到5ml含有卡那黴素(終濃度ΙΟΟμ g/ml)的LB液體培養基中，37°C、220rpm搖菌過夜使菌體完全復甦；然後按照1 100的比例將菌液接種到150ml新配置的含有卡那黴素(終濃度ΙΟΟμ g/ml)的LB液體培養基中，37°C、220rpm搖菌約4_5小時，待0D_為 0. 6-1. 0時加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β -D-I-Thiogalactopyra noside, IPTG)，終濃度ImM)，迅速置於30°C、220rpm搖床誘導表達6小時，並於第2小時， 第4小時和第6小時收集菌體細胞並超聲破碎後直接製備總蛋白，上清蛋白和沉澱蛋白樣品待SDS-PAGE和Western blot檢測。SDS-PAGE和Western blot檢測方法為Α、將上述超聲破碎後直接製備的蛋白樣品採用15% SDS-PAGE分離，然後採用考馬斯亮藍R-250染色並脫色，最後採用凝膠成像儀採集圖像；B、將上述製備的上清蛋白樣品經15% SDS-PAGE 分離後按照說明書所述方法轉印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30分鐘；其次採用 6XHis(TBST 1 3000稀釋)單克隆抗體室溫共孵育1.5小時，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；然後採用辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 二抗(TBST 1 5000稀釋)室溫孵育30分鐘，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；最後採用ECL化學發光檢測試劑盒顯影並掃描，以pET28b和pET28b-TAT為空載體對照。SDS-PAGE檢測結果如圖7 (圖中箭頭所示為靶蛋白Tat-Hif-I和Hif-I所在位置)和圖8(圖中箭頭所示為靶蛋白Tat-VHL-I和 VHL-I所在位置)所示，顯示體外可溶性表達製備了 Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-I/VHL-I 蛋白，特別是Tat-Hif-I和Tat-VHL-Ι，為後續基於二者進行蛋白幹涉功能的研究奠定了重要·石出。3)正常株系秀麗線蟲的餵飼及其生物和生化指標檢測a)單獨餵飼正常株系秀麗線蟲表達Tat-Hif-I和Hif-I融合蛋白的菌體細胞將誘導表達Tat-Hif-I和Hif-I融合蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)菌體細胞塗布到 LB或NGM平皿中，待其室溫稍幹後置於20°C生化培養箱培養72小時待大量克隆長出，挑取正常株系秀麗線蟲20隻於20°C生化培養箱培養48小時。然後挑取秀麗線蟲至不同濃度的亞硫酸鈉溶液(lg/L、2g/L和5g/L)進行低氧應激測試並統計其死亡率，進而評估其抗低氧能力。通過系統檢測及統計分析發現，與對照組pET28b-Tat和pET28b相比，餵飼表達 Tat-Hif-I大腸桿菌的線蟲表現出明顯的抗低氧作用，主要表現在咽部肌肉和神經元的腫脹程度降低、運動性增強，而餵飼表達Hif-I大腸桿菌的線蟲只有微弱的抗低氧作用，表現出對低氧損傷敏感的表型。b)單獨餵飼正常株系秀麗線蟲表達Tat-VHL-I和VHL-I融合蛋白的菌體細胞將誘導表達Tat-VHL-I和VHL-I融合蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)菌體細胞塗布到LB或NGM平皿中，待其室溫稍幹後置於20°C生化培養箱培養72小時待大量克隆長出， 挑取正常株系秀麗線蟲20隻於20°C生化培養箱培養48小時。然後挑取秀麗線蟲至不同濃度的亞硫酸鈉溶液(lg/L、2g/L和5g/L)低氧應激測試並統計其死亡率，進而評估其低低氧能力。通過系統檢測及統計分析發現，與對照組pET28b-Tat和pET28b相比，餵飼表達Tat-VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲表現出明顯的對缺氧敏感，死亡率較高，而餵飼表達 VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲表現為對缺氧不敏感，死亡率沒有明顯變化，同時，對照組亦無明顯變化。c)混合餵飼正常株系秀麗線蟲表達Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-1/VHL-1融合蛋白的菌體細胞將誘導表達Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-1/VHL-1融合蛋白的大腸桿菌 BL21(DE3)菌體細胞按照1 1比例混勻後塗布到LB或NGM平皿中，待其室溫稍幹後置於 20°C生化培養箱培養72小時待大量克隆長出，挑取正常株系秀麗線蟲20隻於20°C生化培養箱培養48小時。然後挑取秀麗線蟲至不同濃度的亞硫酸鈉溶液(lg/L、2g/L和5g/L)進行低氧應激損傷並統計其死亡率，進而評估其抗缺氧能力。通過系統檢測及統計分析發現， 與對照組pET28b-Tat和pET28b相比，混合餵飼表達Tat-Hif-I和Tat-VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲未見明顯的變化，說明高表達的Tat-Hif-I與高表達的Tat-VHL-I通過相互作用即蛋白幹涉而抵消其功能；混合餵飼表達Tat-Hif-I和VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲出現抗缺氧活性，說明高表達的Tat-Hif-I仍可發揮其功能；混合餵飼表達Tat-VHL-I和Hif-I 蛋白的大腸桿菌的線蟲表現為對缺氧敏感，說明高表達的Tat-VHL-I仍可發揮其功能；而混合餵飼表達Hif-I和VHL-I蛋白的大腸桿菌的線蟲未見明顯的變化，說明均為低表達的 Hif-I和VHL-I未形成有效的蛋白相互作用從而未發揮蛋白幹涉作用。上述結果說明在大腸桿菌中通過蛋白轉導肽促進高表達的Tat-Hif-I和 Tat-VHL-I可在秀麗線蟲體內發生功能性相互作用即蛋白質幹涉現象，從而可反過來說明本發明的技術可用於在秀麗線蟲中通過十分便捷的餵飼方法研究蛋白質相互作用，為蛋白質——蛋白質相互作用(PPI)的研究提供了一種新技術。
權利要求
1.一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的專用表達載體， 是含有一個或多個相同或不同蛋白轉導肽的原核表達載體。
2.根據權利要求1所述的專用表達載體，其特徵在於所述蛋白轉導肽為TAT、Antp, VP22、Poly (Arg)和 / 或 Poly (Lys)，優選為 TAT。
3.根據權利要求1所述的專用表達載體，其特徵在於用於構建所述原核表達載體的出發載體可為任意一種外源基因的原核表達載體，如PET28、pBV220、pET30、pCRT7/ CT-TOPO, pETlOl/D-TOPO 或 pQE30，優選為 pET280
4.一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法，是將待鑑定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入權利要求1-3任一所述專用表達載體中，將得到的原核表達載體轉化入大腸桿菌並誘導表達，得到的重組大腸桿菌餵飼正常株系秀麗線蟲，根據秀麗線蟲生物及生化指標檢測結果評估相互作用蛋白發生幹涉的能力和強度。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於包括以下步驟1)確定可能具有相互作用的靶蛋白並分別克隆其編碼基因；2)將靶蛋白編碼基因分別插入所述專用表達載體中，得到含有蛋白轉導肽編碼區和靶蛋白編碼基因相融合的原核表達載體；3)將步驟2)構建的原核表達載體轉化入大腸桿菌原核表達系統；4)原核表達載體的誘導表達及蛋白表達水平檢測鑑定；5)將步驟幻得到並經步驟4)鑑定的體外表達靶蛋白的重組大腸桿菌單獨或混合餵飼正常株系秀麗線蟲；6)檢測秀麗線蟲生物及生化指標並評估靶蛋白之間發生幹涉的能力和強度。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述靶蛋白可以是單個的功能蛋白， 也可以是兩個或多個具有相互作用的功能蛋白；該蛋白可以是秀麗線蟲自身蛋白，也可以是其他物種中具有潛在相互作用的蛋白。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述步驟3)中大腸桿菌原核表達系統的宿主菌為BL21、DH5a、HBlOl、JM109、0P50或耐輻射奇球菌。
8.根據權利要求4或5或6或7所述的方法，其特徵在於所述誘導表達為採用化學試劑誘導外源基因在大腸桿菌原核表達系統中表達，其中，化學試劑誘導表達條件為誘導劑IPTG誘導表達(終濃度ImM)；誘導表達的OD6tltl = 0. 6-1. O ；誘導表達時間6_8小時；或所述誘導表達為採用溫度誘導外源基因在大腸桿菌原核表達系統中表達，其中，溫度誘導表達條件可為誘導表達的0D_ = 0. 4-0. 6 ；誘導表達溫度42°C -44°C;誘導表達時間 6-8小時。所述步驟4)中的蛋白表達水平檢測可採用SDS-PAGE和/或免疫印跡法。
9.根據權利要求4至8任一所述的方法，其特徵在於所述步驟5)中餵飼秀麗線蟲的大腸桿菌需預先塗布到NGM平皿或LB平皿中；混合餵飼的比例為1 5、1 2、1 1、 2 1 或5 1。
10.根據權利要求4至9任一所述的方法，其特徵在於所述步驟6)中秀麗線蟲的生物及生化指標檢測，生物指標具體包括形態結構變化和細胞水平變化等，如產卵率變化、成蟲率變化、是否出現體型變小或肥胖、是否在咽部出現空泡現象、是否出現運動行為失調等； 表觀指標可通過體視顯微鏡觀察判定；生化指標具體包括靶蛋白或其調控因子表達水平檢測，如蛋白質，DNA和RNA等，其表達水平檢測可以為免疫印跡、凝膠遷移實驗和聚合酶鏈式反應等；而蛋白質幹涉前後秀麗線蟲的行為變化可以通過定量行為學等技術手段進行檢測；根據秀麗線蟲在蛋白幹涉前後的表型差異可分析獲得相互作用蛋白發生幹涉的能力和強度。
全文摘要
本發明公開了一種利用大腸桿菌原核表達系統實現秀麗線蟲體內功能蛋白幹涉的方法及其專用表達載體。該載體是含有一個或多個相同或不同蛋白轉導肽的原核表達載體。該方法是將待鑑定的具有相互作用的靶蛋白各自編碼基因插入權利要求1-3任一所述專用表達載體中，將得到的原核表達載體轉化入大腸桿菌並誘導表達，得到的重組大腸桿菌餵飼正常株系秀麗線蟲，根據秀麗線蟲生物及生化指標檢測結果評估相互作用蛋白發生幹涉的能力和強度。本發明具有十分廣泛的應用前景，有望成為重組蛋白類藥物篩選的重要技術手段，同時也是進行蛋白質功能研究的重要技術之一。
文檔編號G01N33/68GK102311969SQ201110270320
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月13日 優先權日2010年9月13日
發明者葉巧, 吳永紅, 張成崗, 張曉 , 李偉光, 石錦平, 高豔 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所