松材線蟲的冷凍保存及解凍方法

2023-10-05 02:25:29 1

專利名稱：松材線蟲的冷凍保存及解凍方法
技術領域：
本發明 涉及線蟲的冷凍保存方法，尤其涉及松材線蟲的程序化冷凍保存及解凍方法，屬於松材線蟲的冷凍保存領域。
背景技術：
松材線蟲(Bursaphelenchus xyfolus)是松材線蟲病的病原物，屬於側尾腺口綱， 墊刃目，滑刃超科，滑刃科，傘滑刃線蟲屬。松材線蟲病又名松材線蟲萎蔫病、松樹萎蔫病、 松樹枯萎病，是松屬樹種的一種毀滅性的病害，因其危害嚴重且防治非常困難而被世界上許多國家列為檢疫對象。松材線蟲危害黑松(Pinusthunbergii)、赤松(Pdensiflosa)、馬尾松(Rmasso苗ana)、溼地松(P. elliottii)等多種松樹，被稱為松樹的「癌症」。目前該病已分布於美國、加拿大、墨西哥、日本、中國、韓國、朝鮮、法國、奈及利亞和葡萄牙等多個國家，其中，在日本、中國、韓國的危害尤為嚴重。中國自1982年在南京中山陵風景區首次發現松材線蟲病以來，至今已在江蘇、安徽、浙江、山東、廣東、上海、雲南、湖北、湖南、江西、 貴州、重慶、臺灣和香港等地發生。松樹是中國的主要造林樹種且其中許多種類是感病的，全中國一半以上省份的氣候適合松材線蟲病的發生，在中國大部分地區具備成災和流行的基本條件，是中國林業和生態環境建設的心腹大患。自發現松材線蟲病以來，國內外就展開了大量研究，一直在不斷地探索其防治措施。松材線蟲的低溫冷凍保存能夠充分利用並收集各種來源的松材線蟲， 可為松材線蟲的致病機理和生物防治技術的研究和應用提供大量實驗材料，並且不受時間和空間的限制。線蟲種質資源的提供與保存作為整個研究中最為基礎的一個環節，將受到人們越來越多的重視。對於松材線蟲，實驗室傳統的保存方法是通過在真菌上的連續接種繁殖得以實現，缺點很多，保存時間短，操作起來不僅費時、費力、佔空間，而且人為因素的影響很容易造成線蟲間的交叉汙染，影響實驗研究。因此，對松材線蟲有效長期保存的研究已是迫在眉睫。上個世紀初，科學家基本上肯定了生物成分(如精子和一些生物化學物質)能夠在零下溫度貯存的事實。隨著科學的發展，低溫冷凍保存的方法逐漸走進人們的視線。隨著松材線蟲病的危害逐步擴大，亟需更加深入的研究其致病機理和防治措施，為此，病原物松材線蟲的採集與保存作為研究的基礎也越來越受到重視。實驗室傳統保存方法是將松材線蟲連同培養基置於(4_8°C )冰箱中保存，雖然比較有效，但因受到溫度和溼度的限制，不能滿足商業化製劑的要求和需要，很難進入商品化生產階段，也由於人力和物力上的巨大消耗，難於在實驗室作為種質資源長期保存的方法。 受細胞凍存的啟發，低溫凍存也開始應用於線蟲學方面。為了尋找線蟲低溫保存技術，各國學者從十九世紀二十年代就開始進行低溫保存技術的研究。九十年代以後，科學家們更注重冷凍技術的研究，根據冷凍保護液在凍結後是否形成冰晶，凍存方法可分為玻璃化和非玻璃化兩種。玻璃化冷凍應用高濃度的冷凍保護劑溶液在超速冷凍過程中形成一種極其粘稠的固化狀態，從而避免細胞內冰晶形成。重要的是，玻璃化過程完全避免了冷凍細胞的在解凍直至恢復細胞生物活性中冰晶的形成。Nakagata用玻璃化冷凍法冷凍小鼠成熟卵母細胞並取得成功後，玻璃化冷凍法被廣泛的用於各種生物材料的冷凍保存研究。宋錦章等以食蚊羅索線蟲(Romanomermis culicicorax)為材料研究了感染期幼蟲的液氮保存，該項研究分別以不同濃度的二甲基亞礬(MDOS)、經乙基澱粉、聚乙烯吡咯烷酮等為冷凍保護劑，結果表明用1%、2.5%或5%的 DMS0，食蚊羅索線蟲感染期幼蟲在液氮保存125天後大部分復甦存活，但存活的幼蟲完全喪失了感染能力(宋錦章，彭玉芳，E.GPlatze ，宋毅，低溫貯存羅索線蟲寄生前期幼蟲效果觀察.中國生物防治.1997，13(1) :14-16)。Annemie等用15%甘油，35%甲醇並添加0. 5M 的葡萄糖作為玻璃化液來冷凍保存香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)，獲得了 11.5% 的存活率(AnlIemieE. , Salvador FV Tom Vff. , etal. , CryoPreservation of Radopholus similis, a tropical Plant-parasitic nematode. Cryobiology55(2007) 148-15)。非玻璃化法即緩凍法，又可以稱為程序化冷凍法或程序降溫法，就一個嚴格的程序化冷凍降溫程序而言，它包括從室溫降溫至植冰溫度的速率、植冰溫度、植冰後平衡時間、下降到投液氮時的溫度及降溫速率等環節，任何一個環節改變，其降溫程序就不同了。 程序化降溫法分為慢速冷凍法和快速冷凍法。慢(快)速冷凍法是通過冷凍程序儀來控制其降溫速率，一般以l°c /min左右的速率降至-7°c左右時，進行人工誘導結晶，再以 0. 1-1. O0C /min的速率降至-30—40°C (快速冷凍)或者_80°C (慢速冷凍)時，投入液氮中保存。關於線蟲的冷凍保存研究中，緩凍法目前多採用的是「兩步(或三步)降溫法」，它是指將置有生物材料的水溶液，分兩個步驟由室溫降至液氮溫度，第一步是先慢速冷卻至中間的某一溫度；第二步是將其直接置入液氮，其相應的冷卻速率較高些。其機理為第一步冷卻的目的是在保證不形成胞內冰、不產生共析現象、不使未凍水份額過低的前提下，逐漸降溫，提高未凍溶液中保護劑的濃度，使此步驟中保護劑的濃度能達到玻璃化溶液的要求；第二步冷卻的目的是利用較高的冷卻速率，使高濃度保護劑實現非晶態固化，達到低溫保存的目的。程序化冷凍因為所需保護劑濃度較低，毒性傷害小，對保護劑的要求較低，其決定效果主要就在於冷凍處理的程序。除此之外，其它與冷凍有關的預處理時間、被冷凍線蟲條件以及稀釋液等也是冷凍效果好壞的影響因素。程序降溫凍存法因為不必使用高濃度的保護劑，減少了保護劑的毒性傷害，從而提高了存活率；同時，精確的控溫程序可大量減少人工操作造成的失誤。程序降溫法是一種慢速降溫冷凍模式，不可避免的會產生細胞內冰晶，使生物材料受到損傷。程序化冷凍時，如果操作不當，很容易造成溶液溫度在短時間內的升降，損傷生物細胞。合適的降溫程序，不形成對細胞足以造成傷害的大冰晶，細胞將不會受到致死性損害，存活率的降低也會得到控制。因此，程序化冷凍法的研究重點是設計一種完全符合生物材料特性的降溫程序，使其最大限度的避免大冰晶的形成，提高生物材料的存活率。隨著松材線蟲病的危害逐步擴大，亟需更加深入的研究其致病機理和防治措施， 為此，病原物松材線蟲的採集與保存作為研究的基礎也越來越受到重視。目前，國內外關於松材線蟲致病機理、防治途徑以及傳播方式等方面的研究很多，但是在種質資源的長期保存方面還未見報導，國外也僅有零星報導，但由於處理方法與實驗條件各不相同，不同文獻資料上的結果存在很大差異，即使是相同的處理方法，也得到不同的結論，所以，對松材線蟲的冷凍保存需要更為系統的研究以提高冷凍保存後的松材線蟲的存活率和繁殖能力

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種松材線蟲的程序化冷凍保存方法，該冷凍保存方法所保存的松材線蟲解凍復甦後存活率高、繁殖能力強。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種松材線蟲的程序化冷凍保存及解凍方法，包括預處理松材線蟲懸液；將預處理後的松材線蟲懸液中加入冷凍保護劑，平衡；平衡處理後的松材線蟲懸液程序化降溫後冷凍保存；解凍復甦。本發明根據過冷現象的原理，採用程序化冷凍法對松材線蟲進行冷凍，設計了多組程序化降溫程序(包括快速冷凍和慢速冷凍的相關降溫程序)，以篩選最合適的降溫程序。試驗結果表明，採用以下步驟進行程序化降溫能夠有效提高凍後線蟲的存活率和繁殖率(1)以1°C /min的降溫速率將松材線蟲懸液從4°C降溫至_6°C ； (2)再以20°C /min的降溫速率降溫至-40°C; (3)以10°C /min的升溫速率升溫至-20°C; (4)以1-0. 5°C /min的速率將松材線蟲懸液降溫至_45°C後迅速投入液氮中進行保存；其中，在上述步驟(4)中將松材線蟲懸液以1°C /min的速率從_20°C降溫至_45°C 然後迅速投入液氮更有利於提高凍後線蟲活率，解凍復甦後線蟲存活率顯著高於其它降溫程序的存活率(P < 0. 05)。在程序化冷凍時，過冷現象很容易發生，如果溫度設計不當，就會造成溶液溫度在短時間內的升降，損傷線蟲細胞，造成死亡。目前，為了避免過冷現象的發生，通常是在-3°C _7°C下對保護液誘髮結晶，即撒入晶核或進行震蕩。但是傳統的程序降溫儀植冰過程十分複雜，很難達到大規模製作的目的。在大多數情況下，細胞的過冷程度比周圍溶液更深，這就使細胞外溶液先結冰，細胞外液未凍結部分的溶液濃度升高，細胞外液的滲透壓增力口，從而使細胞內水分滲出。如果降溫足夠慢的話，可以通過脫水來維持細胞內外環境滲透壓平衡，使胞質內更多的水分有足夠的時間滲出，在細胞外凍結但是如果降溫過慢，細胞長時間處於高滲環境中，就會對細胞產生滲透休克；如果降溫過快，細胞內水分又來不及滲出而在細胞內形成冰晶，胞漿內結冰過多會破壞細胞器，導致細胞死亡，而且冰晶使細胞質濃縮，導致蛋白質脫水變性破壞了蛋白質的結構，使其發生不可逆的變化而導致細胞的死亡。 實際上，在程序化冷凍過程中，細胞內形成冰晶是不可避免的，關鍵是所形成冰晶的大小和數量。只要不形成對細胞足以造成傷害的大冰晶，而是維持在微晶狀態，細胞將不會受到致死性損害。因此，根據生物材料的具體情況，盡力調和滲透壓損傷和冰晶損傷這一矛盾，選擇最佳的降溫速率、適當的凍前預處理和合適的冷凍保護劑組合是利用程序冷凍法獲得生物材料冷凍保存最佳效果的關鍵。預處理方式對松材線蟲的存活率影響很大，本發明為了摸索到最適宜的預處理方式以提高松材線蟲的存活率，本發明通過試驗對預處理方式(包括)進行了摸索和優化。試驗結果表明，經過預處理能夠提高線蟲的冷凍存活率，其中，採用以下預處理措施能夠有效提高線蟲的存活率向松材線蟲懸液中加入甘油至甘油在松材線蟲懸液的終濃度為 5-10% (ν/ν)，放置1-3天；更優選的，向松材線蟲懸液中加入甘油至甘油在松材線蟲懸液的終濃度為5% (ν/ν)，室溫(20-25°C )放置1天。冷凍保護劑的組成及其濃度是決定松材線蟲冷凍效果的關鍵因素之一。本發明以乙二醇(EG)和甘油(GL)作為冷凍保護劑的成分以考察它們作為冷凍保護劑的效果。根據試驗結果可見，隨著保護劑濃度的提高，單一 GL的冷凍效果始終顯著優於EG以及由EG+GL 組成的混合液，其中，濃度為10% (ν/ν)的GL冷凍效果最佳，冷凍保存後的存活率達到 50. 9士3. 2%，略高於15% GL組的冷凍存活率(49. 6士3. 4% )，但二者多重比較無顯著性差異。總濃度為5% (ν/ν)的由EG+GL組成的混合液的冷凍效果最差，其線蟲凍後存活率僅為 20 1 士5. 4%。根據試驗可見採用10% -15% GL(ν/ν)再添加0. 25Μ蔗糖作為程序化冷凍保護劑的效果為最好。松材線蟲冷凍前經過一個平衡處理的過程可使蟲體脫水以防止冷凍過程中冰晶的形成，減少冰晶損傷。在平衡處理過程中也要防止高滲透壓造成過度脫水而產生的溶液損傷。因此，線蟲凍前平衡時間的選擇既要保證脫水程度不至於形成冰晶，又不能長時間平衡造成溶液損傷和毒性傷害。本發明通過大量試驗發現，在對預處理後的松材線蟲懸液採用程序化降溫冷凍前，經過不同時間來平衡的線蟲存活率差異顯著。其中，松材線蟲懸液在冷凍保護劑中4°C平衡l_3h後，尤其是平衡2-3h後再進行程序化降溫冷凍，解凍復甦後的線蟲存活效果為最好。松材線蟲的冷凍保存的關鍵因素除了程序化冷凍速率和冷凍保護劑外，解凍方式和解凍溫度也直接影響著復甦後的存活率。在許多情況下，細胞能在最佳冷卻速率降至一 196°C長期保存，但卻極可能在升溫過程中遭受損傷而死亡，能夠迅速越過危險溫區的解凍速率是影響線蟲存活的一個重要因素。解凍的過程就是冷凍材料和外界環境進行熱交換的過程，當冷凍管內材料吸收熱量達到冰點以上時，即由固相變為液相，在這個過程，蟲體細胞內外伴隨有冰晶重新排列與再結晶。因此最大限度的縮短這段時間(危險溫區-10-60°C )，可以把冰晶大小降低到最小，從而減少冰晶對蟲體的機械損傷，提高存活率。為了摸索出最適宜的解凍方式以最大程度的提高存活率和繁殖能力，本發明研究了溼解凍和幹解凍兩種方法，並選用了 20°C、30°C、4(TC、5(rC和60°C五種解凍溫度。結果表明， 兩種方法解凍後的線蟲存活率差異極顯著。幹解凍後的線蟲存活率明顯極低，且不受解凍溫度變化的影響。而通過水浴解凍，線蟲存活率受解凍溫度的影響較大，解凍溫度為40°C 水浴時，線蟲的存活率最高，達到42. 2士7. 3% ;50°C水浴解凍的線蟲存活率低於40°C組，為 27. 2士8. 3%，二者多重比較不在同一水平；20°C和60°C之間差異不顯著，在水浴解凍中存活率最低，僅為10. 5士5. 2%和9. 8士2.7%，但仍然明顯高於幹解凍方式。結果表明，幹解凍法不適於松材線蟲低溫保存的解凍方法；採用40°C -50°C的溫度進行水浴解凍的效果較好，其中，採用40°C水浴解凍對松材線蟲的冷凍效果影響最好。松材線蟲經過冷凍後能否再繁殖是檢驗冷凍成功的標準之一。本試驗中經過冷凍的線蟲大部份都能再繁殖生長，從試驗結果可以看出，再繁殖培養的線蟲冷凍效果沒有變化，與最初收集的線蟲差異不顯著，不同株系之間的冷凍效果也沒有顯著差異。不同種屬的松材線蟲採用本發明的冷凍保存方法均獲得了良好的存活率和繁殖率。本發明松材線蟲的程序化冷凍保存及解凍方法能顯著提高松材線蟲的存活率和繁殖能力，能適用於不同株系松材線蟲的冷凍保存。


圖1預處理方式對松材線蟲存活率的影響試驗結果。圖2平衡時間對松材線蟲冷凍效果的影響試驗結果。圖3不同降溫程序對松材線蟲冷凍效果的影響試驗結果。圖4不同保護劑對松材線蟲程序化冷凍效果的影響試驗結果。圖5解凍方式對松材線蟲存活率的影響。圖6玻璃化冷凍松材線蟲不同株系的冷凍效果。圖7程序化冷凍次數對松材線蟲冷凍效果的影響。圖8線蟲的凍後繁殖情況；a.線蟲懸液接種於長滿盤多毛孢的PDA平板，放入 25°C培養箱中(左為凍存後收集的線蟲，右為未經冷凍的線蟲)；b. 3天後的繁殖情況； c. 一周後的繁殖情況；d. 10天後的繁殖情況；e.兩周後的繁殖情況。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。1、主要溶液的配製1. 1冷凍保護液GL, EG, DMSO用無菌水分別配製成40%濃度的溶液；再按1 1的比例兩兩混合配製成總濃度為40%的混合溶液；0. 5M和0. 25M的蔗糖與海藻糖溶液。各種溶液經過滅菌後置於4°C冰箱保存備用。1. 2稀釋液林格氏液(氯化鈉8g/L，氯化鉀0. 2g/L，氯化鈣0. 2g/L，碳酸氫鈉0. 2g/L)，無菌水和0. IM蔗糖。高壓滅菌，4°C冰箱保存備用。1. 3預處理液GL和EG用無菌水分別配製成濃度為10%、20%和30 %的溶液，高壓滅菌保存備用。1. 4線蟲懸液採用貝爾曼漏鬥法分離實驗室純培養保存的松材線蟲，將獲得的線蟲接種到長滿盤多毛孢的PDA平板上，25°C培養5-6d，線蟲大量繁殖，再用貝爾曼漏鬥法分離線蟲，此時得到的線蟲中，幼蟲佔絕大多數(70% -80% )0將收集到的線蟲懸液箱保存備用。2、試驗方法2. 1線蟲懸液混均計數法將分離收集得到的松材線蟲(分別採自貴州大平子、四川廣安或湖北宜昌)懸液進行濃縮(約5000條/ml)，取裝有IOml線蟲懸液的指形管，蓋緊瓶蓋，上下搖晃均勻，從中吸取IOOul移置在凹玻片上，在解剖鏡下計數液滴中的線蟲數量，重複5次，根據平均值計算出IOOul懸液中的線蟲數量，再乘以10倍即為該線蟲懸液的濃度。2. 2線蟲的冷凍
線蟲混合預處理液在25°C培養箱中培養ld，再放入冷凍管中經過冷凍保護液處理，通過不同的降溫方式，迅速投入液氮罐中，保存24h。2. 3線蟲的解凍與稀釋將冷凍管從液氮罐中迅速取出，移至恆溫水浴鍋中劇烈振蕩50-60S，待管中結冰完全融化立即加入稀釋液。2. 4線蟲的復甦與鏡檢將稀釋後的線蟲懸液放入25°C恆溫箱中培養ld，解凍復甦後的線蟲取50ul於凹玻片上靜置5min，通過解剖鏡的光熱以及挑針的物理刺激觀察線蟲的扭動彎曲情況(活力級別分為強、弱和死亡)，以解凍後線蟲能否活動作為存活與否的標準來計算總體的存活率 (存活率計算公式存活率=存活後具活力的線蟲數/線蟲總數X 100% )。再通過觀察計算出幼蟲存活率，挑出全部成蟲於倒置顯微鏡下鑑別雌雄，並計算各自存活率。2. 5冷凍時間對線蟲的影響採用同樣的處理方式在液氮中冷凍保存一批線蟲，分別在ld、7d、30d、60d和90d 後取出樣品進行解凍，分別統計凍後線蟲的存活率，觀察線蟲經過長期冷凍後的存活率變化。2. 6不同株系線蟲的冷凍效果採用同樣的冷凍和解凍方式，以貴州株系作為對照，冷凍保存線蟲的不同株系廣安和宜昌株系，同時將冷凍後繁殖培養的貴州株系再進行冷凍保存，解凍復甦後分別統計線蟲的幼蟲、雌蟲和雄蟲的存活率。2. 7凍後線蟲的繁殖效果將沒有經過冷凍的線蟲與凍後復甦的線蟲接種於長滿盤多毛孢的PDA平板上，隔天進行觀察記錄，對比其繁殖情況。2. 8統計分析所得數據均通過SPSS13.0統計軟體進行方差分析，結果數據以均數士標準差 (X 士 SD)來表示，每組試驗5個重複。試驗例1不同預處理方式對松材線蟲存活率的影響試驗分別採用乙二醇(EG)或甘油(GL)作為冷凍保護劑，用無菌水將其配製成低濃度的預處理液，然後將線蟲懸液與不同濃度的預處理液在指形管中等體積混合，混合後的濃度分別為5%、10%和15%，於25°C恆溫箱中培養Id。將經過預處理和未經處理的線蟲懸液與等體積40%的冷凍保護劑在2ml冷凍管中混合，採用上述試驗的平衡、冷凍、解凍和復甦方式，統計存活率。以無菌水處理的線蟲作為空白對照。從試驗結果可見，預處理對松材線蟲的存活率影響很大(圖1)經5%的EG或GL 處理Id的線蟲，其存活率僅略低於CK組，分別為87. 7士2. 8%和91. 0士 1. 8%，兩者多重比較處於同一水平。隨著預處理液濃度的增高，線蟲的存活率降低，當EG濃度為15%時，線蟲存活率最低，為64. 4士3. 5% ；而在冷凍保護劑中平衡後，線蟲的存活率有明顯下降，經5% GL預處理的線蟲在平衡後存活率最高，達到67. 1 士6. 4%，顯著高於CK組，15% EG組的存活率仍然最低，為54. 4 士 3. 3%，其餘各試驗組之間差異不顯著。經過液氮冷凍保存後，5% GL組的線蟲存活率仍然最高，為36. 5士4. 0%，顯著高於對照組和其它試驗組。試驗結果表明，經過預處理能夠提高線蟲的冷凍存活率，其中，在5% GL中預處理Id的松材線蟲進行冷凍，凍後效果最好。試驗例2不同平衡時間對松材線蟲冷凍效果的影響試驗將5ml線蟲懸液與等體積40%冷凍保護劑GL混合於指形管中，4°C冰箱平衡，分別在lh、2h、3h、4h和5h後取400ul混合液移至2ml冷凍管中，冷凍和解凍復甦步驟同上，統計線蟲存活率。以無菌水處理的線蟲作為空白對照。試驗結果見圖2。試驗結果顯示了平衡不同時間的松材線蟲存活率。可見，在冷凍前，經過不同時間來平衡的線蟲存活率差異顯著，隨著平衡時間的增加而降低，平衡時間越短，線蟲的活率越高，lh-5h平衡後的線蟲存活率分別為71. 9士3. 0%、68. 5士2. 8%、 62. 0士4. 0%、58. 3士3. 5%和56. 2士2. 5% ；而冷凍後的線蟲存活率以試驗組2h和3h最高， 分別達到32. 1 士7. 9%和32. 6士6. 0%，與其他試驗組相比差異顯著，但二者間多重比較處於同一水平。由此表明，線蟲在平衡2-3h後進行冷凍，凍後效果最好。試驗例3降溫程序的設計與篩選本試驗根據慢速和快速降溫的原理，設計了 7組降溫程序，以低濃度的甘油 (10% ) +0. 25M蔗糖作為冷凍保護劑，按照所設計的7組降溫程序對線蟲進行冷凍保存24h， 解凍復甦後統計線蟲的存活率，對比篩選出最合適的降溫程序。7組降溫程序程序1 在4°C以1°C /min的速率直接降溫至_45°C，迅速投入液氮；程序2 在4°C以0. 5°C /min的速率直接降溫至_45°C，迅速投入液氮；程序3 在4 °C以1 °C /min的速率降溫至_6 °C，再以20 V /min的速率降溫至-30°C，在_30°C保持IOmin後以10°C /min的速率升溫至_20°C，最後以1°C /min的速率降溫至-45 °C，迅速投入液氮；程序4 在4 °C以1 °C /min的速率降溫至_6 °C，再以20 V /min的速率降溫至_40°C，在_40°C保持IOmin後以1°C /min的速率降溫至_45°C，迅速投入液氮；程序5 在4 °C以1 °C /min的速率降溫至_6 °C，再以20 V /min的速率降溫至_40°C，然後10°C /min的速率升溫至_20°C，最後以1°C /min的速率降溫至_45°C，迅速投入液氮；程序6 在4 °C以1 °C /min的速率降溫至_6 °C，再以20 V /min的速率降溫至_40°C，然後以10°C /min的速率升溫至_20°C，最後以0. 5°C /min的速率降溫至_45°C， 迅速投入液氮；程序7:在4°C以1°C /min的速率降溫至_6°C，再以10°C /min的速率降溫至-40°C，最後以1°C /min的速率降溫至_80°C，迅速投入液氮；由圖3可見，程序5的冷凍效果最佳，線蟲凍後活率達到45. 6士4. 7%;程序6的冷凍效果略低於程序5，線蟲凍後活率為39. 4士5. 1%，但與程序5多重比較處於同一水平；程序2的冷凍效果最差，線蟲存活率僅為12. 6士4. 0%，與程序3相比沒有明顯差異，但與其他程序組差異顯著。試驗結果表明，採用降溫程序5(在4°C以1°C /min的速率降溫至_6°C， 再以20°C /min的速率降溫至_40°C，然後以10°C /min的速率升溫至-20°C，最後以1°C / min的速率降溫至_45°C迅速投入液氮)進行程序化降溫的冷凍效果為最佳。試驗例4程序化冷凍保護劑的篩選本試驗選用毒性較弱、冷凍效果較好的GL、EG及二者的組合為冷凍保護劑。根據程序化冷凍的原理，採用較低濃度的保護劑並添加0. 25M的蔗糖對線蟲進行冷凍保存。試驗共10組，三種保護劑分別以5%、10%和15%的濃度進行冷凍，採用試驗例3所優選出的降溫程序(程序5)，解凍復甦後觀察統計線蟲的存活率。再以無菌水處理的線蟲作為空白對照。①EG+0. 25M 蔗糖②GL+0. 25M 蔗糖③EG+GL+0. 25M 蔗糖在篩選玻璃化冷凍保護劑的基礎上，僅用EG和GL作為保護劑進行研究，如圖4 所示，隨著保護劑濃度的提高，單一 GL的冷凍效果始終顯著優於EG與EG+GL混合液，濃度為10%的GL冷凍效果最佳，存活率達到50. 9士3. 2%，略高於15% GL組的冷凍存活率 49. 6 士 3. 4 %，但二者多重比較無顯著性差異。總濃度為5 %的EG+GL冷凍效果最差，其線蟲凍後存活率僅為20. 1 士5. 4%。試驗結果表明，混合保護劑的冷凍效果並沒有得到提升，最終發現10% -15% GL再添加0. 25M蔗糖作為程序化冷凍保護劑的效果為最好。試驗例5不同株系線蟲的冷凍效果在上述試驗例1-4的基礎上，本試驗以貴州大平子株系松材線蟲為材料，採用程序化法對其進行冷凍保存，復甦統計時分別統計線蟲總體、幼蟲、雌蟲和雄蟲的存活率，對不同蟲齡線蟲的冷凍效果進行比較；再將凍後繁殖培養的線蟲分離收集，繼續通過兩種冷凍法進行冷凍保存，解凍復甦後觀察統計線蟲的存活率，比較初次冷凍與二次冷凍的線蟲存活率；同時，將四川廣安和湖北宜昌株系的線蟲進行玻璃化冷凍，比較不同株系線蟲的冷凍效果。圖6顯示了程序化法對不同蟲齡線蟲的冷凍效果，其存活率的變化趨勢與玻璃化法的冷凍存活率變化相似，幼蟲的存活率最高，達到53. 6士4. 3%，總體的存活率略低，為 49. 7士3. 7%，但二者差異不顯著，雄蟲和雌蟲的存活率則顯著較低，分別為37. 2士4. 6和 38. 8士7. 5;與玻璃化法的冷凍結果相比，程序化冷凍後的幼蟲存活率較高，但多重比較處於同一水平，而雄蟲和雌蟲的存活率則顯著高於玻璃化冷凍結果。圖5和6還顯示了經過初次冷凍後再培養收集的線蟲進行冷凍的效果，可見玻璃化法和程序化法二次冷凍的效果與初次冷凍相比無顯著性差異，幼蟲的存活率分別為 48. 7士 11. 7%、50. 7士7. 6%與52. 7士5. 7%、53. 6士4. 3%。結果表明，程序化冷凍松材線蟲幼蟲的冷凍效果最好，且結果穩定；二次冷凍的效果與初次冷凍相比沒有顯著差異，線蟲凍後能夠進行再繁殖，且不影響後代的冷凍效果。試驗例6不同解凍方式和解凍溫度對松材線蟲冷凍效果的影響試驗在上述試驗例1-4的基礎上，本試驗共分5組，以不同的解凍溫度和方式對冷凍 24h的線蟲進行解凍。分別為20°C ,3040°C，50°C和60°C的水浴解凍和烘箱乾熱解凍。 兩種方式的解凍時間均以冷凍管中的冰晶完全融化為準，解凍復甦後觀察統計線蟲的存活率。從試驗結果來看，解凍方式不同，對線蟲凍後存活率的影響也大有不同，如圖7所示。從圖7中可以看出，幹解凍後的線蟲存活率明顯極低，且不受解凍溫度變化的影響。而通過水浴解凍，線蟲存活率受解凍溫度的影響較大，解凍溫度為40°C水浴時，線蟲的存活率最高，達到42. 2士7. 3% ；50°C水浴解凍的線蟲存活率低於40°C組，為27. 2士8. 3%，二者多重比較不在同一水平；20°C和60°C之間差異不顯著，在水浴解凍中存活率最低，僅為 10. 5士5. 2%和9. 8士2. 7%，但仍然明顯高於幹解凍方式。結果表明，幹解凍法不適於松材線蟲低溫保存的解凍方法；40°C水浴解凍對松材線蟲的冷凍效果影響最好。試驗例7冷凍後的繁殖情況試驗取解凍復甦後的存活的線蟲製成濃度為500條/ml的線蟲懸液，每個多毛孢平板上接種400ul，即每個平板接種200條，取相同濃度的未經冷凍保存的線蟲懸液作為對照。2 周收集分離多毛孢上的線蟲，計數。由於冷凍保存後的線蟲進入新陳代謝降至最低點的休眠狀態，復甦後，生長繁殖速度比未經冷凍的線蟲慢。因此IOd時，對照中的多毛孢已經全部被線蟲吃完，而冷凍處理過的皿中，多毛孢只吃掉1/2，14d後冷凍處理過的皿中多毛孢全部吃完(圖8)。表1線蟲的凍後繁殖情況
權利要求
1.一種松材線蟲(Bursaphelenchus xyfolus)的程序化冷凍保存及解凍方法，包括以下步驟(1)預處理松材線蟲懸液；(2)預處理後的松材線蟲懸液中加入冷凍保護劑，平衡處理；(3)平衡處理後的松材線蟲懸液程序化降溫後冷凍保存；(4)解凍復甦；其特徵在於， 所述的程序化降溫的程序如下以1°C /min的降溫速率將平衡處理後的松材線蟲懸液從 4°C降溫至_6°C ；再以20°C /min的降溫速率降溫至-40°C ；以10°C /min的升溫速率升溫至-20°C;最後以1-0. 5°C /min的降溫速率將松材線蟲懸液從_20°C降溫至_45°C後迅速投入液氮中進行冷凍保存。
2.按照權利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特徵在於所述的程序化降溫的程序如下以1°C /min的降溫速率將平衡處理後的松材線蟲懸液從4°C降溫至_6°C ； 再以20°C /min的降溫速率降溫至-40°C ；以10°C /min的升溫速率升溫至-20°C ；最後以 I0C /min的降溫速率將松材線蟲懸液從-20°C降溫至_45°C後迅速投入液氮中進行冷凍保存。
3.按照權利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特徵在於按ν/ν計，步驟 (1)中所述的預處理是向松材線蟲懸液中加入甘油至甘油的終濃度為5-10%，放置1-3天。
4.按照權利要求3所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特徵在於，步驟(1)中所述的預處理是向松材線蟲懸液中加入甘油至甘油的終濃度為5%，放置1天。
5.按照權利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特徵在於，步驟(2)中所述冷凍保護劑在松材線蟲懸液中的組成成分及終濃度為按ν/ν計，10%-15%甘油+ 0. 25Μ蔗糖。
6.按照權利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特徵在於步驟(2)中所述的平衡時間為l_3h。
7.按照權利要求6所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特徵在於步驟(2)中所述的平衡時間為2-3h。
8.按照權利要求1所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特徵在於步驟(4)中所述的解凍復甦是在40°C -50°C的溫度進行水浴解凍。
9.按照權利要求8所述的程序化冷凍保存及解凍方法，其特徵在於步驟(4)中所述的解凍復甦是在40°C的溫度進行水浴解凍。
全文摘要
本發明公開了一種松材線蟲的冷凍保存及解凍方法，屬於線蟲的冷凍保存領域。本發明方法包括以下步驟(1)預處理松材線蟲懸液；(2)預處理後的松材線蟲懸液中加入冷凍保護劑，平衡處理；(3)平衡處理後的松材線蟲懸液程序化降溫後冷凍保存；(4)解凍復甦；所述的程序化降溫的程序如下以1℃/min的降溫速率將松材線蟲懸液從4℃降溫至-6℃；再以20℃/min的降溫速率降溫至-40℃;以10℃/min的升溫速率升溫至-20℃；最後以1-0.5℃/min的速率將松材線蟲懸液降溫至-45℃後投入液氮中保存。本發明冷凍保存及解凍方法能顯著提高松材線蟲的存活率和繁殖能力，能適用於不同株系松材線蟲的冷凍保存。
文檔編號A01N1/02GK102428909SQ20111028263
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者朱天輝, 樸春根, 李永, 李沁, 林彩麗, 汪來發, 王曦茁, 田國忠, 郭民偉 申請人:中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所