防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株tx-4及製劑的製作方法

2023-10-05 02:25:04

專利名稱：：防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株tx-4及製劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種菌株及其製劑，更具體地說涉及一種防治水稻幹尖線蟲或蔬菜根結線蟲病的菌株TX-4及其製劑，屬於農作物防病治病
技術領域：
，專用農作物的生物防治。
背景技術：
：水稻幹尖線蟲(^^e/ec/wzV^6ewe"'Christie,1942)隸屬於線蟲門一側尾腺綱—滑刃目—滑刃總科—滑刃科—滑刃屬線蟲O^/2e/e"c/zozVfeFuscher，1894)—貝西滑刃線蟲(A6w^y0引起水稻的幹尖線蟲病、穀子不捻線蟲病。近年來，研究證明其也是引起水稻"小穗頭"的病原菌。我國每年因水稻幹尖線蟲病而損失的水稻約達20億公斤。對於水稻幹尖線蟲病的防治目前主要還是用化學殺線劑如巴丹、殺線酯(醋酸乙酯)、呋喃丹、殺螟丹、二硫氰基甲烷和強氯精等浸種處理。國、內外鮮有用微生物防治該病的報導。蔬菜根結線蟲(Me/ozWogywespp.)隸屬於線蟲門一側尾腺綱—墊刃目—墊刃總科—異皮科--根結屬(Me/o/obgywGoeldi，1887)。通常在寄主植物根部形成癭瘤或根結，因此稱為根結線蟲。根結線蟲是世界性分布的威脅農業生產的主要病原物。它不僅使作物產量減少，品質降低，而且可與其他病原物一起造成複合侵染。迄今已記載的根結線蟲約有70種，其中南方根結線蟲(M/"cogmYa)、爪哇根結線蟲(M7'mw7/a7)和花生根結線蟲(Maw"an'a)因其廣分布性和多寄主性，是最重要的植物寄生線蟲種類。在中國，這三種根結線蟲在大多數省(區)均有發生，侵染農作物達百種以上，致使寄主常年減產15-25%，有時達70%以上，嚴重地制約了大棚蔬菜作物的生產和出口創匯。據估計，我國農作物的生產每年因根結線蟲的為害而遭受的經濟損失達數十億元。長期以來，對蔬菜根結蟲病的防治主要採取化學殺線蟲劑、選種抗病品種、實施輪作、建立無病種苗基地和對進出口農作物進行嚴格的檢疫來控制根結線蟲病害的發生和縵延。部分高毒性、滅生性化學殺線蟲劑雖有一定防效，但其選擇性差，極易破壞農作物的生態環境，不易降解，高殘留，對人畜極不安全；破壞土壤結構，造成土壤沙化，抗藥性問題日益突出，這些因素使得化學殺線蟲劑的使用範圍已受到嚴格的限制。目前，燻蒸性殺線蟲劑二溴氯丙烷和二溴乙烷等滷代烴品種因毒性等問題先後禁用。高純度l，3-二氯丙烯以及劇毒農藥涕滅威、克百威等在發達國家已全面禁用。我國也將上述化學藥劑列為限制或控用化學農藥品種。因此，非化學性防治措施目前已成為農作物根結線蟲病害治理的主流研究方向，而微生物防治則為其中最有前途的方法。研製與開發具有殺線蟲活性的微生物及其代謝產物，主要是從細菌、真菌和殺線植物中獲得。國內、外目前報導用於防治蔬菜根結線蟲的真菌屬(種)主要有(1)節叢孢屬(/4w/zra6ofr;^spp)主要禾中有爿.ra6wWaDuddington、爿.zVregw/an'51(Matruchot);(2)不規則節叢孢屬(MeM"evaspp)報導的種有Aco"ozVfesDrechsler、Ao//gos;oraFresenius、」.c/ac(y/ozVfesDrechsler;(3)單頂孢黴屬(Afowflcmspon'w/wspp)J艮道的有Me仏JMospora/w(Grove)CookeetDickinson;(4)小指孢黴屬CD"c(y/e〃aspp)報導的禾中有D.ovz)ams/"cflStirlingetMankau;(5)輪枝黴屬(KWc/〃/wwspp)報導的禾中有Kc加eM"/a/i/w(KamyschkoexBarronetOnions)W.Gams、Kc/z/awj^to57on'w附Goddard(厚垣輪枝抱)、Kw力era^Wang(中國輪枝孢)、/awe///co/"(FEVSmith)W.Gams(菌褶輪枝黴)、/ec朋z7(Zimmermann)Viegas(蠟階輪豐支菌)、K/e/^o6a"n/附W.Gams、K/5t/〃/otoeTreschow(蘑燕輪枝黴)、K/"^cton^j(Petch)W.Gams;(6)掘氏梅裡屬(i>ec/zmm'a)的圓錐掘氏梅裡黴(i>ec/2wen'acom'osjwra);(7)半知菌類偵!j耳屬(/7ewra^y)的糙皮頂!j耳(屍/ei/ra/wsoWwaftw);(8)雅致小克銀漢黴(C謡'wg/2ame〃ae/egaraLendner)。國內、外報導用生防細菌防治蔬菜根結線蟲的有巴氏桿菌(ikfe/c/z"汰q扔、螢光假單胞菌(i^et^/oOTO"osyZworesrewsMigula),球形芽孢禾幹菌(5ac/〃wss//weWciwMeyeretNeide)、枯草芽孢桿菌[5a"7/wssw6"7/51(Ehrenberg)Cohn]、方夂射性土壤桿菌[v4gra6a"er/wwra血6fl"er(BeijerincketvanDelden)Conn]、致金色假單胞菌(/！a,oy^c/eraKluyver)、阿維鏈黴菌(S加/^cwy^esavenrn力'fcKimetGoodfellow)等細菌，其大部分菌株的防治效果超過40%。國內、外報導對蔬菜根結線蟲有殺蟲活性的殺線植物印楝樹04zaJ/rac似a/w&cadeJussieu)、萬壽菊屬(Tage/esZiwjaews)、馬纓丹(camaraLinn.)、曰本(賴卩)杉[Oj/to附en'a/apom'ca(ThunbergexLinnaeusf.)D.Don]、蒜(蔓)04///w附sa"vwwLinn.)、、洋^^(^4///"附y加/os固Linn.)、萵苣(丄a加casa"vaL.var.capitataL.)、毛魚藤(DemJe〃妙'ca(Roxburgh)Bentham]、三尖杉(Cep/m/ototw^b加腦'Hookerf.)莖葉、粗榧[Cep/za/oto:wss/we"^(RehderetWilson)Li]、狼牙朿U(Sop/zoraWc/zyb//aHance)禾中子、紫斑牡丹(屍aeom'asw^-w^coraAndrews)[var.papaveracea(Andrews)Kemer]。迄今為止，國外利用植物防治蔬菜根結線蟲已有幾十年的歷史，但有效地從殺線植物中分離、提純殺線蟲化合物，並鑑定其化學結構，國內外還處在初步探索階段。目前，國外已登記防治蔬菜根結線蟲的商品化的製劑有Biocon、Royal300、Royal350、DiTera和Deny等。而在我國登記的只有"線蟲必克"(Krrid〃wmckw^c/cwpwfww)和"滅線寧"(Paed/owycM///fl"'m^)。到目前為止沒有報導用於同時防治蔬菜根結線蟲和水稻幹尖線蟲病的生防微生物及其製劑。
發明內容本發明的目的在於解決上述現有技術中存在的不足和問題，提供一種兼具治水稻幹尖線蟲病和蔬菜根結線蟲病的菌株TX-4及其製劑，專用於防治水稻幹尖線蟲病(水稻"小穗頭")、辣椒、番茄、茄子等溫室蔬菜根結線蟲病。同時本發明還提供由菌株TX-4製成的菌劑及其製備方法，該菌劑具有貨架期長、防效高、防治譜廣和增產的性能。本發明是通過以下技術方案實現的本發明的防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株TX-4為類芽孢桿菌屬，拉丁文學名為屍fle"/6"d〃wspp.，該菌種已於2009年3月19日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNO:M209038。所述菌種具有如下特徵細胞呈杆狀，中生，有芽孢，孢囊稍膨大，橢圓形，G+，鞭毛周生。菌落淡黃色，圓形，邊緣整齊，菌落隆起。發酵液能產生多種抗菌活性物質，能分泌胞外蛋白酶和纖維素酶。用本發明的防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株TX-4製備的生防菌劑，其製備方法包括以下步驟(A)—級種子培養液的培養用無菌接種環挑取事先在NA固體培養基上劃線培養好的TX-4菌株單菌落斑，接種於裝有5mlNA液體培養液的容積為20ml的三角瓶中，於30。C、200rpm條件下振蕩培養16h-24h;(B)二級種子培養液的培養將上步(A)所得培養液5ml接種於裝有400mlNA培養液的容積為1000ml的三角瓶中，200rpm、30'C條件下振蕩培養16h-24h;(C)上罐發酵把上步(B)所得的400ml培養液接種於裝有20L發酵培養液的容積為30L的發酵罐中，其中發酵培養液成份重量百分濃度5y。(W/W)幹豆腐渣和水，設置發酵條件為溶氧100%，消泡劑50ml，攪拌速度為350rpm，30°C，72h，pH7.0-7.2;其中所述的消泡劑優選為無菌菜子油；(D)菌劑加工工藝將發酵好的發酵液按如下方法加工成菌劑在每升發酵液中添加玉米澱粉400g，橄欖油25ml，蔗糖25g，混合攪拌均勻，55。C烘箱中鋪開間隔烘，實時測定水份含量，使水份含量控制在3-5%之間，烘48h，磨碎得粉末，過200目篩，無菌鋁箔袋密封保裝，製劑成品TX-4菌劑；其中所述的TX-4菌劑中活菌總濃度優選為lxlO"l"0^cfu/g。本發明的有益效果是(1)本發明所得菌劑劑型穩定，可適溫保存2-3年，菌劑防治譜廣可以防治多種類型線蟲病害，物別是首次運用在水稻幹尖線蟲病害的防治，對由幹尖線蟲引起的"小穗頭"有很好的防治效果。大田示範防治結果表明，該菌劑對水稻幹尖線蟲病防治效果達90%以上，對蔬菜根結線蟲的防治效果在70%以上。(2)由於本發明的活菌製劑是生物製劑，沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列環境和安全問題。該製劑的使用可保證水稻幹尖線蟲病害的防治和蔬菜根結蟲病害的無公害防治，極大的減少水稻生產和蔬菜生產中化學農藥的施用量，為農民節本增收。(3)菌劑大量發酵所用的培養基原料為豆腐渣，所以菌劑的生產成本十分低廉，企業獲取的利潤空間極大。具體實施方式實施例本實施例的防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株TX-4可提取於2009年3月19日在中國典型培養物保藏中心保藏、保藏號為CCTCCNO:M209038。拉丁學名為戶aem力ad/tospp.的菌種，該菌種具有如下特徵細胞呈杆狀，中生，有芽孢，孢囊稍膨大，橢圓形，G+，鞭毛周生。菌落淡黃色，圓形，邊緣整齊，菌落隆起。發酵液能產生多種抗菌活性物質，能分泌胞外蛋白酶和纖維素酶。本實施例的防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株TX-4製備的生防菌劑，其製備方法包括以下步驟(A)—級種子培養液的培養用無菌接種環挑取事先在NA固體培養基上劃線培養好的TX-4菌株單菌落斑，接種於裝有5mlNA液體培養液的容積為20ml的三角瓶中，於30°C、200rpm條件下振蕩培養16h，過夜；(B)二級種子培養液的培養將上步(B)所得培養液5ml全部接種於裝有400mlNA培養液的容積為1000ml的三角瓶中，200rpm、3CTC條件下振蕩培養16h;(3)上罐發酵把上步(B)所得的400ml培養液接種於裝有20L發酵培養液(培養液成份5%幹豆腐渣和水)的容積為30L的發酵罐(型號鎮江東方生工GUS-30)中，設置發酵條件為溶氧100%，消泡劑(無菌菜子油)50ml，攪拌速度為350rpm，30°C，72h，pH7.0-7.2(酸、鹼流加用1MHC1、1MNaOH調節pH);(4)菌劑加工工藝將發酵好的發酵液按如下方法加工成菌劑在每升發酵液中添加玉米澱粉400g，橄欖油25ml，蔗糖25g，混合攪拌均勻，55'C烘箱中鋪開間隔烘，實時測定水份含量，使水份含量控制在3-5%之間，約烘48h，磨碎得粉末，過200目篩，無菌鋁箔袋密封保裝，製劑成品TX-4菌劑(活菌總濃度約為Ixl0ulxl012cfu/g)。本發明活菌製劑的大田施用方法如下(1)防治水稻幹尖線蟲應用方法為，按菌劑與水比例為1:500-1000(W/V)，先將菌劑與水混合均勻，再將水稻種子倒入，藥液沒過水稻種子，在3(TC-35'C條件下浸種48h，然後再在3(TC條件下催芽至種子露白。(2)防治蔬菜線蟲病的應用方法為，菌劑稀釋l:400-800(W/V)倍，在蔬菜苗移栽時灌根、或蘸根使用。本發明的實施效果(1)對水稻幹尖線蟲的室內毒力測定及田間防效試驗實驗方法防治水稻幹尖線蟲應用方法為，將TX-4菌劑(活菌含量約為1.45x1011cfWg)與水比例為l:500、1:1000和l:2000(W/V)，空白對照用清水，化學藥劑用95%巴丹6000倍液。先將菌劑與水混合均勻，再將水稻(鎮稻99)種子倒入，菌液沒過水稻種子(400ml菌液浸300g稻種)，在3(TC條件下浸種，48h後，撈起稻種瀝乾菌液，每處理數稻穀50粒，剝開穎殼，將穎殼和米粒一起放入加水10ml的小三角瓶中浸4h，然後用紗網濾掉稻殼和米粒，濾液置離心管中3OOOrpm離心5min，倒掉上清液，顯微鏡下檢査沉澱中線蟲的存活率。其餘種子在30。C條件下催芽至種子露白後播種。育秧方式為旱育秧，秧齡25d，每處理分3個重複移栽到大田，小區面積15m2。水稻成熟時調查每小區水稻幹尖線蟲的病株數，計算病株率和防效。水稻成熟後測產，計算防病增產效果。結果室內毒力測定結果(表l)表明，TX-4菌劑對稻種中帶有的幹尖線蟲有明顯的殺滅作用。TX-4菌劑500倍液、1000倍液、2000倍液(W/V)，在3(TC條件下，浸種48h，對鎮稻99中幹尖線蟲的殺滅防效分別達94.0%、85.5%和70.8%，與95°/。巴丹6000倍液浸種48h的毒力(96.4%)相當。田間試驗結果(表l)表明，TX-4菌劑可以有效防止水稻幹尖線蟲病。從表l可以看出應用TX-4菌劑500倍液，在3CTC條件下浸種48h，再催芽至露白，對水稻幹尖線蟲病的防病保產效果與95%巴丹可溶性粉劑6000倍液相當。表1TX-4菌劑對水稻幹尖線蟲的毒力tableseeoriginaldocumentpage8注與對照相比不同大寫字母表示屍<0.01(2)對蔬菜根結線蟲的室內毒力測定實驗方法將具有根結的番茄植株洗去根表土，挑取根結外卵囊放在濾紙上，將濾紙置於200目網篩上，再將網篩置於盛有清水的培養皿中，使水略漫過卵塊。培養箱中25'C孵化，每24h收集培養皿中的二齡幼蟲(J2)。將線蟲懸浮液稀釋為100條/ml，4'C保存待用。在室溫條件下，將成品TX-4菌劑(活菌含量約為1.45xio11Cfu/g)稀釋成400、800和1600倍液(W/V)，各吸取2ml，加入無菌培養皿(直徑6cm)中，然後加入100條/ml的上述J2懸浮液2ml。以清水作空白對照，藥劑對照為95%巴丹1:6000倍液(W/V)，重複3次。分別在12、24、36和48h後觀察線蟲活力。結果毒力測定結果(表2)表明，TX-4菌懸液的各個處理均對南方根結線蟲J2的活性有顯著殺滅作用。其中稀釋400倍時抑制作用最為明顯，在處理12、24、36和48h後，對J2活性抑制率穩定在90n/。左右，與對照化學藥劑巴丹(95%巴丹1:6000倍)的活力相當。表2TX-4對根結線蟲二齡幼蟲室內毒力測定結果^廳,~HiSIi5Si48hTX-4400倍89.0A~~89.6A~~90.4A~91.7ATX-4800倍58.6B65.4B67.2B67.5BTX-41600倍36.8C41.0C47.3C52.1C95°/0巴丹1:6000倍90.4A91.7A94.6A95.0A空白對照0.95D2.15D6.2D6.8D注與對照相比不同大寫字母表示屍<0.01(3)對蔬菜根結線蟲病的田間防效試驗試驗地條件本試驗安排在江蘇省湯山鎮鎖金村蔬菜大棚的日光溫室內，土質為沙壤土，土壤有機質含量中等，根結線蟲重發田，前茬為黃瓜。採用人工深翻，整平翻曬。番茄於2007年10月15日播種，11月25FI移栽，管理照常規。試驗處理方法於番茄移栽前，將成品TX-4菌劑(活菌含量約為1.45xl0"cfu/g)分別稀釋400、800和1600倍(W/V)後，在番茄苗移栽時灌根澆透土壤移栽耕層，每棵苗灌400ml，空白對照用清水代替，對照生防藥劑為"線蟲必克"，1:400倍液，每棵苗灌400ml。試驗設4重複。處理後50d時調査發病情況，計算病情指數和防效。根結線蟲病情指數調查方法及分級每個小區每重複隨機取15株。危害程度採用分級法記錄即O級沒有根結或卵塊；I級l-2個根結或卵塊；II級3-10個根結或卵塊；III級11-30個根結或卵塊；IV級31-100個根結或卵塊；V級100個以上根結或卵塊。病情指數的計算方法，公式為病情指數=0:(各級植株數x級值)/(調查總株數x5》x100結果田間試驗結果(表3)表明，TX-4菌劑稀釋400、800、1600時的防治效果分別為75.19%、61.83%和51.91%,均高於"線蟲必克"400倍液的防效(40.46°/。)。菌劑產品具有極大的市場開發前景。表3TX-4菌劑對番茄根結線蟲病的田間防治試驗結果tableseeoriginaldocumentpage9注與對照相比不同人寫字母表示屍<0.0權利要求1、一種防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株TX-4，該菌株TX-4為類芽孢桿菌屬拉丁文學名為Paenibacillusspp.，該菌種已於2009年3月19日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNOM209038。2、權利要求1所述的防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株TX-4在防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病方面的應用。3、一種用權利要求1所述的防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株TX-4製備的生防菌劑。4、根據權利要求3所述的生防菌劑的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(A)—級種子培養液的培養用無菌接種環挑取事先在NA固體培養基上劃線培養好的TX-4菌株單菌落斑，接種於裝有5mlNA液體培養液的容積為20ml的三角瓶中，於30°C、200rpm條件下振蕩培養16h-24h;(B)二級種子培養液的培養將上步(A)所得培養液5ml接種於裝有400mlNA培養液的容積為1000ml的三角瓶中，200rpm、30。C條件下振蕩培養16h-24h;(C)上罐發酵把上步(B)所得的400ml培養液接種於裝有20L發酵培養液的容積為30L的發酵罐中，其中發酵培養液成份重量百分濃度5%幹豆腐渣和水，設置發酵條件為溶氧100%，消泡劑50ml，攪拌速度為350rpm，30°C,72h，pH7.0-7.2;(D)菌劑加工工藝將發酵好的發酵液按如下方法加工成菌劑在每升發酵液中添加玉米澱粉400g，橄欖油25ml，蔗糖25g，混合攪拌均勻，55'C烘箱中鋪開間隔烘，實時測定水份含量，使水份含量控制在3-5%之間，烘48h，磨碎得粉末，過200目篩，無菌鋁箔袋密封保裝，製劑成品TX-4菌劑。5、根據權利要求4所述的生防菌劑的製備方法，其特徵在於步驟(C)中所述的消泡劑為無菌菜子油。6、根據權利要求4所述的生防菌劑的製備方法，其特徵在於步驟(D)中所述的TX-4菌劑中活菌總濃度約為lxlO"lxli2cfWg。全文摘要本發明公開了一種防治水稻幹尖線蟲或蔬菜根結線蟲病的菌株TX-4及其製劑，屬於農作物防病治病
技術領域：
，專用農作物的生物防治。大田示範防治結果表明，該菌劑對水稻幹尖線蟲病防治效果達90％以上，對蔬菜根結線蟲的防治效果在70％以上。本發明的防治水稻幹尖線蟲病或蔬菜線蟲病的菌株TX-4為類芽孢桿菌屬，拉丁文學名為Paenibacillusspp.，該菌種已於2009年3月19日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCCNoM209038。文檔編號A01P5/00GK101550405SQ20091003003公開日2009年10月7日申請日期2009年3月31日優先權日2009年3月31日發明者朱桂梅,楊敬輝,潘以樓,陳宏州申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所