球形固定化細胞/酶粒子的製備方法
2023-10-04 18:19:19
專利名稱：球形固定化細胞/酶粒子的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種固定化生物催化劑的製備方法，更確切地說是一種固定化細胞/酶的製備方法。
採用包埋法製備固定化細胞/酶所用的載體有兩類。一類是天然高分子材料，如明膠、瓊脂和海藻酸鈣等，由於其機械強度一般都較差，難以適用於生物反應器中，尤其是流化床類型生物反應器中長期地連續運轉。另一類是合成高分子材料，如聚丙烯醯胺等，主要由於其單體往往對菌體或酶有毒性，或者在製備過程中條件相對苛刻，易於損傷酶的活性，且一般亦難以製成球形顆粒，以適應流化床生物反應器操作。近幾年來，不少專利文獻報導了用聚乙烯醇(PVA)作為載體，在將聚乙烯醇水溶膠凝膠化，改進成形技術使之成為球形，提高凝膠化粒子機械強度，緩和微生物細胞包埋時載體凝膠化工藝條件以及減少酶活力損失方面已取得顯著成果。如日本特許昭61-100193A採用硼酸成形方法使聚乙烯醇水溶膠凝膠化，製得了球形的固定化細胞/酶粒子，且機械強度好。但是該過程使用了對細胞/酶具有毒性的硼酸，勢必將損傷細胞/酶的活性，因此不適宜PH呈酸性範圍的微生物細胞/酶的固定化。最近中國專利文獻CN1076488報導對該硼酸法進行了改進，採用了硼酸一磷酸的二階段成形的方法，縮短了細胞/酶與硼酸的接觸時間，但還是擺脫不了硼酸，且所用的磷酸鹽濃度也較高，約在3～20％。此外，迄今為止所發表的專利文獻中都未提及固定化微生物催化劑製備過程中有關孔隙率的調節，使之適應不同大小細胞/酶和不同底物的要求，致使所製備的固定化生物催化劑通透性好，傳質阻力小，機械強度高。
本發明的目的在於提供一種球形固定化細胞/酶粒子的製備方法。依此方法製備的固定化細胞/酶，具有規則的球形顆粒，有彈性與韌性，機械強度高，耐磨，其內部有豐富的網狀結構，且孔隙率大小可以進行調整，用在生化反應過程中通透性好，傳質阻力小，固定化細胞/酶活力高。
為了達到上述目的，本發明是通過下述技術方案加以實現的。採用無毒聚乙烯醇、海藻酸鈣、矽溶膠複合材料，將其製成混合水溶膠，並按比例加入微生物細胞/酶，均勻混合後在多價金屬離子溶液中初步形成規則的球形粒子，粒子再經2次以上冷凍與部分風乾過程，然後再置於低濃度的致孔劑中，放置一定時間後便可得到所需的固定化細胞/酶粒子。上述製備過程中其技術特徵在於1.使用的無毒聚乙烯醇複合載體，它是由聚乙烯醇、海藻酸鈣及矽溶膠所製成的複合物凝膠，它們在水溶膠中的重量百分數為聚乙烯醇6～15％，海藻酸鈣為0.5～1.5％，矽溶膠為0.3～5.0％；2.所使用的多價金屬離子溶液為CaCl2水溶液，其濃度為0.1～0.5M；3.所使用的致孔劑為低濃度的磷酸或磷酸鹽，如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉或相應鉀鹽等，其濃度為0.03～0.55％(重量)。
本發明的具體實施過程是首先將聚乙烯醇、海藻酸鈣和矽溶膠按照上述比例製成混合水溶膠後，高壓滅菌消毒。然後加入微生物細胞溼菌體，其含量一般為1～10％(重量)，充分混均，再將含有該微生物細胞的混合水溶膠在含有多價金屬離子的水溶液中初步製成規則的球形顆粒。制粒方式可以採用離心式制粒或多噴嘴壓力式制粒，實驗室可採用蠕動泵滴加制粒。多價金屬離子水溶液可以是CaCl2水溶液，其濃度一般為0.1～0.5M。初具球形顆粒的固定化細胞粒子在CaCl2水溶液中需保持2～6小時，隨後在室溫下解凍風乾，脫除部分水份，如此冷凍、解凍和部分風乾兩次以上，再用生理鹽水洗滌後，浸於含有0.03～0.55％(重量)的磷酸或磷酸鹽(如磷酸氫二鈉)的緩衝溶液中，使之進一步形成所需的具有一定孔隙率的固定化細胞粒子。
縱觀固定化細胞粒子的形成過程，影響其粒子大小的主要因素在於混合水溶膠的組成和粘度，以及噴嘴的大小和溶膠在噴嘴處的噴出速度。而影響粒子的孔徑和孔隙率的因素在於，聚乙烯醇海藻酸鈉及矽溶膠在水溶膠中的含量，培養基或緩衝液中磷酸根離子的濃度和凝膠粒子在該培養基或緩衝液中停留時間，還有凝膠的風乾脫水程度等。這些因素也直接影響到固定化細胞粒子的強度。
以本發明所製得的固定化細胞/酶粒子，外觀呈規則的球形顆粒，其粒徑一般1.5～3.0mm，有彈性、機械強度好、耐磨損、抗擠壓，其內部具有豐富網狀結構，有利於細胞的附著與生長，在進行生化反應時，通透性好，傳質阻力小。在厭氧發酵過程中產生的CO2極易排出。用於連續的流化床或固定床反應器中，固定化細胞粒子無漂浮現象，保證了反應器正常運轉，並且在使用中具有酶活高和壽命長的特點。
將用上述方法製得的固定化酵母細胞粒子，置於含有0.04％磷酸培養基中進行細胞增殖，約經過28小時，其內酵母菌濃度達(2～4)×109個細胞/毫升粒子，其粒徑約為3mm，然後將其置於二級噴射環流移動床反應器和一個多段固定床反應器串聯的反應系統中，以糖蜜為原料進行酒精發酵。該固定化酵母細胞在反應器內無漂浮現象，流動狀態好，機械強度高。當底物糖濃度為16％時，空時為5.01時，其終了酒精濃度為8.5％(體積)，糖轉化率為94.4％，對糖收率為93.4％，生產能力為48.07克酒精/(催化劑·小時)。該固定化酵母細胞使用壽命達3個月以上。
下面以實施例對本發明作進一步說明。
實施例一聚乙烯醇40克(聚合度為1750±50，醇解度大於97％)；海藻酸鈉5克；矽溶膠40毫升(濃度為28％)；水400毫升；酵母溼菌體10克；氯化鈣水溶液1升(0.3M)。
將聚乙烯醇、海藻酸鈉、矽溶膠與水於85℃～95℃下充分混合製成混合水溶膠，並進行高壓滅菌消毒。待該水溶膠冷卻至30℃左右，加入已培養好且經過高速離心後的酵母溼菌體，充分混合均勻，然後通過蠕動泵滴入預先配製好的氯化鈣水溶液中，成為3～4mm球形顆粒，並在該氯化鈣溶液中緩慢攪拌2小時。濾去氯化鈣溶液，用生理鹽水洗滌一次後，移入冰室，於-25℃條件下冷凍10小時，再取出於28～30℃下解凍風乾8小時，如此反覆冷凍及風乾三次，再將其置於28℃下的含有0.04％(重量)磷酸的液體培養基中進行細胞增殖，經過28小時，便製得所需的固定化酵母細胞粒子，其粒徑為3mm，該固定化酵母球形粒子內酵母菌濃度高達(2～4)×109個細胞/毫升粒子，並且有彈性與韌性，耐磨抗壓，其結合了合成高分子和天然高分子作為固定化載體的優點。
實施例二聚乙烯醇9克(聚合度為1750±50，醇解度大於97％)；海藻酸鈉1.2克；水90毫升；簡單節桿菌溼菌體5克；氯化鈣水溶液200毫升(0.3M濃度)。
製備固定化節桿菌粒子方法同實施例一。將所製備的固定化節桿菌粒子置於含有0.5％磷酸二氫鉀的培養基中，溫度為32℃，時間為48小時，便製得所需的固定化節桿菌球形催化劑，將其用於醋酸可的鬆脫氫制醋酸強的松的過程中，其Δ1.2脫氫酶的活力可提高3.8倍。進行搖瓶實驗，當底物濃度為10mg/ml時，反應時間僅需13小時便可達到98％的轉化率，當底物濃度為20mg/ml時，反應時間也僅17小時便可達到97％的轉化率。
權利要求
1.一種球形固定化細胞/酶粒子的製備方法，它是以聚乙烯醇複合材料與水混合成水溶膠後，按比例加入微生物細胞/酶，均勻混合後在成形劑中製成初具球形粒子膠體，膠體粒子再經2次以上冷凍、解凍與部分風乾過程後，再置於致孔劑中便可獲得外觀呈球形、內部呈多孔網狀結構的固定化細胞/酶粒子。該方法的技術特徵在於a.聚乙烯醇複合材料由聚乙烯醇、海藻酸鈣及矽溶膠組合而成，它們在水溶膠中的重量百分比分別為6～15％，0.5～1.5％和0.3～5.0％；b.成形劑為多價金屬離子的CaCl2水溶液，其濃度為0.1～0.5M；c.致孔劑為低濃度的磷酸、磷酸鹽(如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等)或相應鉀鹽，如磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等，其濃度為0.03～0.55％(重量)。
全文摘要
本發明涉及一種固定化生物催化劑的製備方法。該方法是以無毒的聚乙烯醇複合材料為載體，先將其製成混合水溶膠，並按比例加入微生物細胞或酶，均勻混合後在多價金屬離子溶液中初步形成規則的球形粒子，粒子再經多次冷凍與部分風乾過程，然後再置於低濃度的致孔劑中，便可得到所需的固定化細胞或酶粒子。按本方法所製成的固定化生物催化劑粒子，酶活高、機械強度好、耐磨損、抗擠壓、內部具有豐富網狀結構，應用時通透性好，傳質阻力小。
文檔編號C12N11/00GK1143112SQ9610159
公開日1997年2月19日 申請日期1996年4月1日 優先權日1996年4月1日
發明者張瑛, 甘一如, 元英進, 王大中 申請人:天津大學