一種高效誘導喜樹離體葉片不定芽再生的培養基的製作方法

2023-10-04 20:18:24

專利名稱：一種高效誘導喜樹離體葉片不定芽再生的培養基的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術。
背景技術：
喜樹是我國南方特有樹種，因其體內不同部位均含有喜樹鹼而聞名。近年來在抗腫瘤的天然產物中喜樹鹼已經成為一種非常重要的化合物(Comins et al.，1994)。目前兩類喜樹鹼的衍生物已經被批准用於臨床治療癌症，其它幾種正在用於臨床實驗(Thomas et al.，2004)。喜樹因其藥用價值越來越得到科學工作者的重視。Liu and Adams(1998)的研究結果表明，不同地理種源喜樹鹼含量存在明顯差異，喜樹鹼含量高的種源和喜樹鹼含量低的種源相比能高出3.5倍多。目前喜樹處於瀕危狀態而且喜樹鹼的提取要消耗大量喜樹資源，因此急需培育出喜樹鹼含量高的喜樹種源進行大量繁殖以滿足市場上對喜樹鹼的需要(Liu and Li，2001)。由於樹木的周期比較長，傳統的育種方法無法在短期內解決這一問題，而遺傳轉化為林木的遺傳改良開闢了新的渠道(Estruch，1997)。因此通過遺傳轉化的方法提高喜樹鹼含量將非常具有吸引力並能彌補喜樹自然資源的缺乏。
由於農桿菌介導的遺傳轉化具有簡單、快速和高效的特點，而且得到的轉基因植物通常是單拷貝的，因而在大多數植物中得到了廣泛的應用(Hansen and Wright，1999；Wu et al.，2003)。不定芽再生是根癌農桿菌介導的遺傳轉化中一個非常關鍵的環節(Pérez-Tornero et al，2000)。然而在喜樹的組織培養方面，以腋芽和頂芽為外植體的組織培養研究已見報導(Jain and Nessler，1996；Liu and Li，2001)，然而這兩個再生系統不適合農桿菌介導的遺傳轉化。在農桿菌介導的遺傳轉化過程中，葉片是比較理想和有效的受體(Horsch et al，1985)。目前還沒有見到以喜樹葉片為外植體的組織培養系統的報導。因此我們建立了以喜樹葉片為外植體的組織培養系統，目的是為喜樹次生代謝基因工程打下良好基礎。

發明內容
本發明的目的在於提供一種適合於喜樹葉片組織培養的培養基，建立高效和可重複的喜樹組織培養再生系統。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案是由硝酸銨、硫酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、二水氯化鈣、四水硝酸鈣、七水硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉、硼酸、一水硫酸錳、七水硫酸鋅、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、煙酸、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、肌醇組成WPM培養基的基礎上還增加了植物激素6-BA(6-苄基氨基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)及瓊脂與蔗糖。
所述的培養基配方包括a.愈傷組織誘導培養基WPM+6-BA1.0mg/l+NAA0.2mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂6.0g/lb.不定芽再生和增殖培養基WPM+6-BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0/lc.不定芽生根培養基WPM+IBA0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/l其中，WPM培養基的配方為硫酸鉀(K2SO4)990mg/l、硝酸銨(NH4NO3)400mg/l、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)390mg/l、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)96mg/l、四水硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)556mg/l、磷酸二氫鉀(KH2PO4)170mg/l、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)37.3mg/l、七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8mg/l、硼酸(H3BO3)6.2mg/l、四水硫酸錳(MnSO4·4H2O)22.3mg/l、七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)8.6mg/l、五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025mg/l、二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/l、煙酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、鹽酸硫胺1mg/l、鹽酸吡哆醇0.5mg/l。
本發明的優點是該培養基對喜樹離體葉片愈傷組織誘導率高，愈傷組織不定芽發生頻率高，可以在較短的時間內得到大量的再生苗，建立優良的再生體系，為根癌農桿菌介導的遺傳轉化提供保障。
具體實施例方式
下面對本發明的實施例作詳細的描述。
該培養基的組成成分是由硝酸銨、硫酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、二水氯化鈣、四水硝酸鈣、七水硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉、硼酸、一水硫酸錳、七水硫酸鋅、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、煙酸、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、肌醇組成WPM培養基的基礎上還增加了植物激素6-BA(6-苄基氨基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)及瓊脂與蔗糖。
培養基配方包括a.愈傷組織誘導培養基WPM+6-BA1.0mg/l+NAA0.2mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂6.0g/lb.不定芽再生和增殖培養基WPM+6-BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/lc.不定芽生根培養基WPM+IBA0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/l其中，WPM培養基配方為硫酸鉀(K2SO4)990mg/l、硝酸銨(NH4NO3)400mg/l、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)390mg/l、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)96mg/l、四水硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)556mg/l、磷酸二氫鉀(KH2PO4)170mg/l、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)37.3mg/l、七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8mg/l、硼酸(H3BO3)6.2mg/l、四水硫酸錳(MnSO4·4H2O)22.3mg/l、七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)8.6mg/l、五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025mg/l、二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/l、煙酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、鹽酸硫胺1mg/l、鹽酸吡哆醇0.5mg/l。
各種培養基配置時除添加以上成分外，PH值要調整為5.8，分裝後在121℃，1.1kg/cm2的壓力下滅菌20分鐘。
應用以上培養基，用喜樹無菌苗葉片接種在該發明的培養基上，半個月時可以誘導出愈傷組織，一個月時可以產生不定芽。不定芽長到1cm左右時接種到生根培養基，進行生根培養。在生根培養基上生長3周左右即可進行移栽。
本發明用喜樹(Camptotheca acuminata)無菌苗的葉片進行培養，取得成功，葉片外植體來源於腋芽再生獲得的無菌苗，腋芽再生的基本培養基為B5培養基，具體操作如下B5培養基配方為由硝酸鉀(KNO3)2500mg/l、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)250mg/l、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)150mg/l、硫酸銨((NH4)2SO4)134mg/l、一水磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)150mg/l、七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8mg/l、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)37.3mg/l、碘化鉀(KI)0.75mg/l、硼酸(H3BO3)3.0mg/l、一水硫酸錳(MnSO4·H2O)10mg/l、七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)2mg/l、二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/l、五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025mg/l、六水氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.025mg/l、煙酸1mg/l、肌醇100mg/l、鹽酸硫胺10mg/l、鹽酸吡哆醇1mg/l。
腋芽再生無菌苗葉片的獲得以溫室3年生的喜樹腋芽為材料，腋芽在70％的乙醇中滅菌30s，5％次氯酸鈉中滅菌5分鐘，接著無菌水漂洗3遍後進行接種。
腋芽再生的培養基成分如下不定芽誘導培養基B5+BA1.0mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂6.0g/l不定芽繼代和增殖培養基B5+BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/l喜樹的腋芽在誘導培養基上培養半個月左右，每個腋芽可產生3-4個不定芽。將得到的不定芽在繼代增殖培養基上培養一個月左右，其葉片就可用於再生培養。
將通過上述途徑獲得的葉片邊緣剪去，將葉片向軸面朝下接種於葉片愈傷組織誘導培養基，半個月時可誘導出愈傷組織，將愈傷組織轉接到不定芽再生和增殖培養基繼續培養半個月時，便可誘導出不定芽。接著挑選生長健壯、發育正常、苗高1cm左右的不定芽轉接到生根培養基進行生根培養。不定芽在生根培養培養基上培養3周左右，即可進行移栽。將根系發育健壯的喜樹再生苗從培養基中取出，用自然水衝洗掉根部的培養基，移栽到沙子和泥炭土1∶1的基質中，移栽前兩周，用塑料薄膜作成拱棚罩住再生苗，以防止水分散失，造成小苗枯萎。以後逐漸打開塑料薄膜，在溫室進行正常培養，移栽成活率可達95％以上。
附註1.WPM及B5培養基為植物組織培養的公知培養基。
權利要求
1.一種高效誘導喜樹離體葉片不定芽再生的培養基，配方包括a.愈傷組織誘導培養基WPM+6-BA1.0mg/l+NAA0.2mg/l+蔗糖30g/l+瓊脂6.0g/lb.不定芽再生和增殖培養基WPM+6-BA0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/lc.不定芽生根培養基WPM+IBA0.5mg/l+蔗糖20g/l+瓊脂6.0g/l其中，WPM培養基配方為硫酸鉀(K2SO4)990mg/l、硝酸銨(NH4NO3)400mg/l、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)390mg/l、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)96mg/l、四水硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)556mg/l、磷酸二氫鉀(KH2PO4)170mg/l、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)37.3mg/l、七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8mg/l、硼酸(H3BO3)6.2mg/l、四水硫酸錳(MnSO4·4H2O)22.3mg/l、七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)8.6mg/l、五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025mg/l、二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/l、煙酸0.5mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、鹽酸硫胺1mg/l、鹽酸吡哆醇0.5mg/l。
全文摘要
一種高效誘導喜樹離體葉片不定芽再生的培養基，由硝酸銨、硫酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、二水氯化鈣、四水硝酸鈣、七水硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉、硼酸、一水硫酸錳、七水硫酸鋅、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、煙酸、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、肌醇組成WPM培養基的基礎上還增加了植物激素6－BA(6－苄基氨基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)及瓊脂與蔗糖。本發明中的培養基使喜樹離體葉片愈傷組織誘導率高，愈傷組織不定芽發生頻率高，可達70％，而且每片葉片不定芽發生數目多，平均為11個。這種培養基使喜樹離體葉片不定芽發生的再生系統具有高頻性和可重複性，為喜樹次生代謝基因工程打下了良好的基礎。
文檔編號C12N5/04GK1644682SQ200410044119
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月13日 優先權日2004年12月13日
發明者祖元剛, 王慧梅, 王文杰, 董鳳麗, 於景華, 楊逢建 申請人:東北林業大學, 祖元剛