利用真皮類似物的皮膚彈性增強能力評價方法

2023-10-05 11:32:59

專利名稱：利用真皮類似物的皮膚彈性增強能力評價方法
技術領域：
本發明涉及一種評價皮膚彈性增強效果的方法，該方法是通過製備與實際真皮類似的三維真皮類似物(mimetic dermis),並測量真皮類似物的變形程度的差異實現的。
背景技術：
皮膚真皮(dermis)的膠原(collagen)和彈性蛋白(elastin)分別由稱為膠原纖維和彈性纖維的蛋白質構成，它們是組成真皮結締組織的主要成分，是決定皮膚抗拉強度的重要構成成分。健康皮膚中的膠原和成纖維細胞通過相互作用發揮極強的收縮力，從而維持皮膚的緊繃和彈性。但是隨著年齡的增加，出現成纖維細胞不健康或者膠原質量下降、兩者間的附著點不牢固等情況時，維持皮膚緊繃的力降低，皮膚收縮性降低，失去彈性，從而會成為形成皺紋。皮膚彈性的核心要素是真皮膠原和成纖維細胞間的相互作用及結合力，目前採用膠原凝膠收縮分析方法(collagen gel contraction assay, ExperimentalDermatology, 17，788-789 (膠原凝膠收縮分析方法，實驗皮膚病學，17，788-789))測定膠原與成纖維細胞的相互作用。具體地說是將成纖維細胞和膠原混合製備成凝膠，在普通培養皿中培養後，比較各凝膠的收縮程度，從而觀察因物質處理引起的膠原和成纖維細胞相互作用的變化，並利用數字圖像(照片)計算各凝膠的表面積，以此評價皮膚彈性度。但是，此類方法只能顯示二維結果，具有以下缺點:不能以三維或更加富有視覺性的方式顯示實際皮膚中所發生的變化。

發明內容
本發明要解決的技術問題本發明人利用培養插入體(culture insert),製備了以三維形態構建的真皮類似物，並確認了通過觀察物質處理後上述真皮類似物的構造坍塌程度，可預測實際皮膚中發生的變化，從而完成了本發明。因此，本發明的目的在於，提供一種能夠以三維方式評價皮膚彈性增強效果的方法。技術方案為實現上述目的，本發明提供一種利用真皮類似物的皮膚彈性增強能力評價方法。所述方法包括以下步驟:a)使膠原和糖進行反應獲得糖化膠原對照組；以及使膠原、糖和需要評價皮膚彈性增強能力的候選物質進行反應獲得糖化膠原實驗組；使所述對照組和實驗組分別與成纖維細胞混合，從而製備凝膠山)利用培養插入體構建三維形態；c)在所述步驟b)的培養插入體內部分別加入步驟a)中製備的對照組及實驗組的凝膠並培養，從而製備真皮類似物；d)將製備的類似物形態以三維方式圖像化 '及e)根據所述d)的圖像化結果評價彈性變化。並且，本發明提供一種對增強皮膚彈性的化妝品原料進行篩選的方法，所述方法利用所述皮膚彈性增強能力評價方法。有益效果本發明利用真皮類似物，可通過三維圖像評價因物質處理而引起的真皮類似物坍塌程度，不僅觀察因物質處理而引起的成纖維細胞和膠原纖維的結合力及相互作用的變化，還可預測上述變化在實際皮膚中可能引起的變化，能夠以富有視覺性的方式顯示皮膚彈性降低、下垂等現象。此外，採用本發明的評價方法，還可容易地篩選出能增強皮膚彈性的廣品。


圖1通過HE染色照片示出了本發明的真皮類似物截面圖。圖2示出了採用目前膠原凝膠收縮分析方法及依據本發明真皮類似物評價方法時的結果。圖3示出了採用依據本發明的真皮類似物評價皮膚彈性增強功能的結果。本發明的優選實施方式本發明涉及一種能夠以富有視覺性的方式表現化妝品引起的皮膚彈性增強能力的方法，該方法是利用真皮類似物，以三維方式顯示皮膚彈性的變化實現的。利用本發明的真皮類似物，評價皮膚彈性增強能力的方法包含以下步驟:a)使膠原和糖進行反應獲得糖化膠原對照組；以及使膠原、糖和需要評價皮膚彈性增強能力的候選物質進行反應獲得糖化膠原實驗組；使所述對照組和實驗組分別與成纖維細胞混合，從而製備凝膠；b)利用培養插入體構建三維形態；c)在所述步驟b)的培養插入體內部分別加入步驟a)中製備的對照組及實驗組的凝膠並培養，從而製備真皮類似物；d)將製備的類似物形態以三維方式圖像化 '及e)根據所述d)的圖像化結果評價彈性變化。膠原凝膠收縮分析方法作為現有的評價方法，是將成纖維細胞和膠原混合製備成凝膠後，在普通培養皿中培養，從而製備成膠原凝膠，在製備過程中膠原凝膠處於漂在培養基中的狀態。與此相反，依據本發明的評價方法與現有方法的差別在於，本發明利用培養插入體構建三維形態後，將膠原凝膠附著在培養插入體內部，而非普通培養皿中。在培養過程中發生因成纖維細胞而引起的真皮重構(dermal remodeling)。真皮重構過程是成纖維細胞通過與膠原纖維結合，調節膠原纖維的排列，從結構性方面使真皮類似物穩定的過程。圖1示出了以上述方法製備的真皮類似物的截面圖。圖1的照片採用HE (蘇木精-曙紅)染色，根據圖片可知本發明的真皮類似物通過依據成纖維細胞的真皮重構過程，成纖維細胞在膠原蛋白基質中形成了與實際真皮層一樣的網狀結構。因此可確定本發明的真皮類似物與實際真皮在構造上非常類似。本發明中為製備真皮類似物，通過使膠原和糖反進行應後誘導膠原糖化(glycation),從而製備膠原凝膠。皮膚老化會引起膠原的糖化,這會降低膠原與成纖維細胞的結合，使皮膚彈性降低，引起皮膚下垂現象。因此，本發明為了製備彈性降低的真皮類似物，誘導了實際皮膚中發生的膠原的糖化。膠原糖化後，由於附著在膠原上的糖，因此不能順利進行真皮重構過程，因此用糖化的膠原製備的真皮類似物在結構上不穩定。此時，為誘導膠原糖化而採用的糖的種類沒有特殊限制，但優選使用核糖。並且，本發明中將需要評價皮膚彈性增強功能的候選物質與糖一同添加並與膠原發生反應，評價候選物質的膠原糖化抑制功能，從而通過此過程評價候選物質的皮膚彈性增強功能。此時，現有的膠原凝膠收縮分析方法提供膠原凝膠的二維結果，通過膠原表面積的變化判斷膠原凝膠的收縮程度。而本發明中採用真皮類似物的評價方法可提供三維結果，可根據真皮類似物的體積變化判斷真皮類似物的構造坍塌程度。利用本發明真皮類似物的皮膚彈性增強能力評價方法，通過用預計會產生皮膚彈性增強效果的候選物質進行處理，從而能夠以富有視覺性的方式顯示出上述物質的彈性增強功能並進行評價，因此，可容易地篩選出具有皮膚彈性增強能力的物質。
具體實施例方式以下，將通過實施例詳細說明本發明。[參考例I]真皮類似物的製備方法本發明中使用的真皮類似物可由下述方法製備1.在Epi管(Epi tube)中加入40 μ I的IOX P緩衝液{3個DMEM (DMEM細胞培養基(Dulbeccos，s Modified Eagle Medium) (DMEM 粉末，Gibco 公司，美國))、I 個 Ham’sF-12營養成分混合物(F-12粉末，Gibco公司，美國)、4ml抗生素-抗真菌劑(PSF，Gibco公司，美國)加入至400ml滅菌蒸懼水中溶解的溶液}、40 μ I重溶緩衝劑(Reconstitutionbuffer) (IOOml0.05M NaOH 中溶解 2.2g 的 NaHCO3 和 4.77g 的 HEPES 後過濾)、2 μ I 的 5ΜNaOH後充分混勻。2.在上述I中加入320 μ I正常膠原水溶液或糖化的膠原水溶液，用移液管充分混勻。3.在上述2中加入IO4個成纖維細胞(人類新生兒的成纖維細胞，Cascadebiologies公司，美國)，用移液管充分混勻使成纖維細胞在溶液中均勻分布。4.12孔細胞培養板內部裝置培養插入體(culture insert, 12mm Transwell 1，康寧公司，美國)，將上述3的混合液加至培養插入體內部，後在37°C條件下反應30分鐘，使膠原水溶液凝固。5.待膠原完全凝固後往培養插入體的內部和外部均加入成纖維細胞培養基(M106, Cascade Biologies公司，美國)並培養一晚。之後培養真皮類似物,約培養一周時間且每3天更換一次培養基。在此過程中因成纖維細胞和膠原纖維間的相互作用而發生真皮重構過程。[實施例1]凝膠膠原收縮分析方法和利用真皮類似物的評價方法的比較使膠原和核糖反應，誘導膠原的糖化後分別製備膠原凝膠和真皮類似物，對膠原糖化對皮膚的影響進行評價。具體地說，真皮類似物是以上述參考例I的方法製備的，此過程中參考例I製備方法的步驟2中使用的糖化膠原溶液是利用0，62.5，125及250mM濃度的核糖處理膠原後誘導膠原糖化的。並且，核糖是將D- (_)核糖(Sigma公司，美國)溶於水後用0.2μπι過濾器(Minisart sartorious stedim生物科技公司，德國)精製使用。並且，膠原糖化的具體方法如下。為防止膠原的汙染，在潔淨臺內，在膠原水溶液(將I型膠原(Sigma公司，美國)溶於0.1%的乙酸製備成終濃度為3mg/ml)中添加特定濃度的(62.5、125及250mM) D-(-)核糖，裝配到可360度旋轉的行星擺轉混砂機(rotationmixer)後,在常溫下反應3天,從而誘導膠原的糖化。與上述相同的方法完成真皮類似物的培養後，利用外科用手術刀將真皮類似物從培養插入體中分離，放置到細胞培養皿上，觀察隨時間的變化產生的真皮類似物體積的變化。一般在將真皮類似物從培養插入體中分離後的10分鐘左右時進行觀察，用DSLR照相機(佳能Kiss Digital N，佳能公司，日本)獲得三維圖像，以圖像中各真皮類似物的高度差異為重點分析圖像。從培養池中分離後，隨著時間的延長結構穩定的真皮類似物的體積變化不是很大，然而不穩定的真皮類似物會發生坍塌的現象，圖像中的高度會降低，從而引起體積減少。因此，圖像中真皮類似物的高度與真皮類似物結構的穩定性呈比例。並且為了比較，將與上述相同濃度的核糖處理獲得的糖化膠原與成纖維細胞混合，從而獲得膠原凝膠，在普通培養皿中培養所獲得的膠原凝膠，獲取其對應的數碼圖像照片，實施作為二維方式測定方法的膠原凝膠收縮分析方法。上述兩種方法獲得的結果如圖2所示。圖2中I)示出了膠原凝膠無法正常收縮的二維結果。由於經核糖處理後，膠原凝膠無法收縮，因此仿佛向外側擴張。並且圖2中2)顯示因膠原的糖化而變弱的真皮類似物未能維持正常的形態，發生變形(坍塌)的結果。此方法通過顯示三維方式的結構變化，以視覺性的方式很好地示出了因膠原糖化引起的真皮失去彈性、發生變形並因此引起的坍塌的現象。正如圖2顯示，現有的膠原凝膠收縮分析方法是以二維方式顯示結果，但本發明的方法可以將結果以三維的方式，視覺化顯示，因此可更有效地示出實際皮膚中發生的變化。[實施例2]利用真皮類似物的皮膚彈性增強功能評價為篩選對皮膚彈性增強有效果的物質，採用了依據本發明的上述參考例I的真皮類似物。具體地說，在本實驗中準備了沒有誘導膠原糖化的膠原(正常膠原)；用62.5mM的核糖處理，從而誘導膠原糖化的膠原；用62.5mM的核糖和IOppm生育酹同時處理,從而誘導膠原糖化的膠原；以及用62.5mM的核糖和Ippm 二棕櫚醯脯氨酸(DPHP)同時處理，從而誘導膠原糖化的膠原。此過程中的核糖是將D- (_)核糖(Sigma公司，美國)溶於水後用
0.2 μ m過濾器(Minisart sartorious stedim生物科技公司，德國)精製使用。並且，糖化膠原的具體方法如下。為防止膠原的汙染，在潔淨臺內往膠原水溶液(將I型膠原(Sigma公司，美國)溶於0.1%的乙酸製備成終濃度為3mg/ml)中添加D-(-)核糖使其濃度成為62.5mM,並根據需要添加IOppm生育酚或者Ippm DPHP，裝配到可360度旋轉的行星擺轉混砂機後，在常溫反應3天，從而誘導膠原的糖化。將用上述方法準備好的膠原和成纖維細胞混合後，將其附著於以三維形態構建的培養插入體(12mm Transwell 康寧公司，美國)內部進行培養，製得真皮類似物。真皮類似物的培養結束後，利用外科用手術刀將真皮類似物從培養分離體重分離，放置到細胞培養皿上，在將真皮類似物從培養插入體中分離後的10分鐘左右時進行觀察,用DSLR照相機(佳能Kiss Digital N,佳能公司，日本)獲得三維圖像，以圖像中各真皮類似物的高度差異為重點分析圖像。各個真皮類似物的三維圖像如圖3所示。
如圖3所示，可確定由於經過核糖處理，真皮類似物形態發生了坍塌。也可確定與公布的抗老化物質(生育酚或DPHP)同時處理時，真皮類似物的坍塌被抑制。如上所述，使用依據本發明的方法時，可對候選物質抑制由皮膚老化引起的膠原糖化，從而增強皮膚彈性的現象容易地進行評價，並進行視覺性地評價，因此可利用本發明有效篩選有助於皮膚彈性增強的物質。
權利要求
1.一種利用真皮類似物的皮膚彈性增強能力評價方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟:a)使膠原和糖進行反應獲得糖化膠原對照組；以及使膠原、糖和需要評價皮膚彈性增強能力的候選物質進行反應獲得糖化膠原實驗組；使所述對照組和實驗組分別與成纖維細胞混合，從而製備凝膠；b)利用培養插入體構建三維形態；c)在所述步驟b)的培養插入體內部分別加入步驟a)中製備的對照組及實驗組的凝膠並培養，從而製備真皮類似物；d)將製備的類似物形態以三維方式圖像化；及e)根據所述步驟d)的圖像化結果評價彈性變化。
2.—種對增強皮膚彈性的化妝品原料進行篩選的方法，其特徵在於，所述方法利用權利要求I所述的皮膚彈性增強能力評價方法。
全文摘要
本發明涉及一種評價皮膚彈性增強效果的方法，該方法通過製備具有與實際真皮類似構造的真皮類似物後，將真皮類似物變形程度的差異以三維形式可視化的方式實現。
文檔編號G01N33/15GK103189743SQ201180052645
公開日2013年7月3日 申請日期2011年10月21日 優先權日2010年10月29日
發明者閔大珍, 羅勇柱, 安順愛, 金惠景 申請人:株式會社愛茉莉太平洋