一種檢測心肌肌鈣蛋白i的方法及其應用的製作方法

2023-10-05 03:45:39

專利名稱：一種檢測心肌肌鈣蛋白i的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗技術領域，具體涉及一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，以及運用該方法製備的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒。
背景技術：
目前急性心肌梗死(AMI)檢測的主要生化標誌物有肌酸磷酸激酶同工酶 (CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)和心肌肌鈣蛋白I (cTnl)等。CK-MB、 LDH廣泛分布於體內，因此特異性較低，許多疾病都可導致它們的升高，且在血液中維持時間較短；cTnT與骨骼肌肌鈣蛋白T(sTnT)同源性很高，容易發生交叉反應。而cTnl具有特異性高、出現時間早、敏感性高和在血液中持續時間長等優點，可作為AMI早期診斷指標， 已經被證實為心肌損傷最特異、最敏感的血清標誌物之一。目前影響cTnl測定精確度的因素有以下幾方面(l)cTnl的存在形式不同cTnl 抗體識別游離形式cTnl和複合物形式cTnl的能力不同；0)cTnI的磷酸化cTnI的第22 位和第23位絲氨酸殘基可以在蛋白激酶A作用下發生磷酸化，形成四種磷酸化形式(未磷酸化態，22Ser磷酸化態，23Ser磷酸化態，22、23Ser均磷酸化態)共同存在於細胞中，磷酸化改變了 cTnl分子的構象，影響某些cTnl抗體的識別能力；( cTnl的氧化CTnI的第80 位和第97位胱氨酸殘基會發生氧化，從而影響某些cTnl抗體的識別能力；(4) cTnl的易水解性cTnI易受蛋白水解酶作用，且不同部分受影響的程度有差別，中心區域(第33位至 110位胺基酸)穩定性較高，N端和C端易被降解，產生包含不同抗原表位的cTnl蛋白酶解片段，不同cTnl抗體對不同降解表位的結合能力不同；( 幹擾物質類風溼性因子(RF)、 嗜異性抗體會造成假陽性結果，自身抗體、膽紅素和血紅蛋白會造成假陰性結果；(6)抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)是Ca2+螯合劑，可使cTnl-cTnC複合物解離，從而影響某些抗體的結合；肝素帶負電荷，易與帶正電荷(Pl為9. 87)的cTnl結合形成複合物，從而影響某些抗體的結合。高精確度cTnl檢測要求所選用的抗體需滿足下列條件(1)針對的抗原表位位於穩定的中間區域，不受水解影響；( 特異性高，和快骨骼肌型肌鈣蛋白、慢骨骼肌型肌鈣蛋白不發生交叉反應，即所針對的抗原表位應針對無同源性區域；C3)受cTnl的存在形式、 磷酸化、氧化的影響較小；(4)受經常出現的血液和血漿成分幹擾較小。目前商業化的試劑盒大都採用夾心免疫法，通常使用2 3個單克隆抗體，組合形式為1 2個捕獲抗體加1個檢測抗體或者1個捕獲抗體加1 2個檢測抗體。但是這樣的組合不可能做到對已知cTnl測定影響因素不敏感，也無法滿足高精確度cTnl檢測抗體的條件，因此試劑盒無法達到高精確度要求。現有的cTnl檢測方法主要有酶聯免疫法(ELISA)，化學發光法和酶聯螢光分析法。ELISA方法測定周期長；化學發光法和酶聯螢光分析法價格昂貴，需有專門儀器和專業人員操作，只適用於中心實驗室使用，檢測結果到達醫生手中的時間較長，不能滿足臨床快速檢測需要，也不適合於中小醫院尤其是沒有中心實驗室的鄉鎮醫院。而膠乳增強免疫比濁法操作簡單，適用於絕大多數醫院的自動生化分析儀使用，特別是對急診能實現快速定量檢測，其基本原理是將抗體包被在膠乳顆粒上，與相應抗原發生免疫反應後，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物所產生的濁度，即可測出標本中被檢物的含量。而cTnl抗體包被到膠乳顆粒上，一般可以採用物理吸附法和化學偶聯法，物理吸附法穩定性較化學偶聯法要差，易受到類風溼性因子(RF)和嗜異性抗體的幹擾，導致檢測結果假陽性或假性升高。目前採用的化學偶聯法多為隨機偶聯法，該法將導致抗體結合力的損失，增加了抗體用量和生產成本。針對目前的現狀，需要尋找一種新的cTnl檢測方法，該方法應該具有操作簡單、 適用範圍廣、精確度高和生產成本低等特點。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種操作簡單、適用範圍廣、精確度高、抗幹擾能力強及生產成本低的檢測心肌肌鈣蛋白I的方法。本發明所採用的技術方案為一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法將抗體組合物與聚苯乙烯膠乳顆粒進行偶聯， 然後與檢測標本中相應抗原發生免疫反應形成聚集顆粒，在400 700nm波長下測定反應物產生的濁度，即可得出檢測標本中cTnl的含量。此方法的反應原理是膠乳增強免疫比濁法，基本反應過程為將抗體包被在膠乳顆粒上，與相應抗原發生免疫反應後，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物所產生的濁度，即可測出標本中被檢物的含量。在本發明中，檢測標本中的cTnl與結合在膠乳顆粒表面的抗人cTnl抗體結合，產生抗原抗體反應，使膠乳顆粒形成聚集，在400 700nm 波長處測定吸光度，對照標準曲線可求出cTnl的含量。所述抗體組合物由至少3種抗體組成，每種抗體的量由與其結合的具體抗原的量決定。抗體的選擇原則為抗體為cTnl特異、而不與快骨骼肌型肌鈣蛋白I和慢骨骼肌型肌鈣蛋白I發生交叉反應，即所述抗體是cTnl特異性的，不會和快骨骼肌型肌鈣蛋白I、慢骨骼肌型肌鈣蛋白I發生免疫反應。抗體組合物的選擇原則為抗體組合物中若其中一種抗體對檢測標本中某個影響cTnl精確測定的因素敏感(該因素會影響「一種抗體」與cTnl 的結合)，則至少有另一種抗體對該影響cTnl精確測定的因素不敏感(該因素不會對「另一種抗體」與cTnl的結合構成幹擾)，即如果選擇了一種對檢測標本中某個影響因素比較敏感的抗體，那麼選擇的其他抗體中至少要有一種抗體對該影響因素不敏感，抗體經組合後，能夠形成較強的反應性。檢測標本中影響cTnl精確測定的因素包括cTnl的存在形式、 cTnl的磷酸化、cTnl的氧化、cTnl的易水解性、抗凝劑(具體影響狀況如背景技術中所述) 對抗體結合的影響。抗凝劑如乙二胺四乙酸、肝素(具體影響狀況如背景技術中所述)。所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，即由抗體組成的抗體組合物可以是單克隆抗體組合物、多克隆抗體組合物、或者單克隆抗體和多克隆抗體的組合物。作為優選，所述抗體組合物為MlS18M8單克隆抗體、19C741 49單克隆抗體、56083 93單克隆抗體、MF419(l li36單克隆抗體按1 :1:1: 1的比例進行組合，或MlS18M8單克隆抗體、19C741 49單克隆抗體、8E1086 9(1單克隆抗體、458169 m單克隆抗體按1 :1:1:1 的比例進行組合。
作為優選，所述聚苯乙烯膠乳顆粒的平均粒徑為0. 05 0. 5 μ m。所述偶聯為定向化學偶聯，使得抗體組合物以特定取向連接到聚苯乙烯膠乳顆粒上，包括以下步驟(1)聚苯乙烯膠乳顆粒的激活在聚苯乙烯膠乳顆粒(帶有羧基)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺(EDAC)，EDAC與聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為0. 5 5 100，反應0. 5 Ih後加入己二酸二醯胼，己二酸二醯胼與聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為50 250 100，繼續反應0.5 lh，得到激活的聚苯乙烯膠乳顆粒；(2)抗體組合物的氧化用高碘酸鈉將抗體組合物非結合活性區域Fc端的羧基氧化成醛基，高碘酸鈉與抗體組合物的重量比為1 15 10；(3)抗體組合物與聚苯乙烯膠乳顆粒的偶聯將步驟(1)激活的聚苯乙烯膠乳顆粒與步驟( 氧化的抗體組合物混合，抗體組合物與聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為2 22 100，反應1 池後，加入葡萄糖，葡萄糖與激活的聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為 (25 50) 100，繼續反應2 4h，得到偶聯抗體組合物的聚苯乙烯膠乳顆粒。本發明還提供運用上述檢測心肌肌鈣蛋白I的方法製備的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒，該試劑盒包括試劑1、試劑2，其中試劑1為緩衝液，試劑2由偶聯抗體組合物的聚苯乙烯膠乳顆粒、緩衝液組成，偶聯抗體組合物的聚苯乙烯膠乳顆粒與緩衝液的重量體積比為 0. 05 0. 35%。作為優選，所述緩衝液為PBS緩衝液、Tris緩衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液、 醋酸鹽緩衝液、檸檬酸-磷酸鹽緩衝液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液、2-嗎啉乙磺酸(MES)緩衝液、氯化銨緩衝液中的一種或幾種。所述試劑盒中試劑1所用的緩衝液與試劑2所用的緩衝液只要為上面的緩衝液中的一種任意搭配均可。該心肌肌鈣蛋白I試劑盒除包括試劑1和試劑2外，還可以包括校準品，所述校準品採用cTnl-cTnT-cTnC複合物作為配製材料。目前各種試劑盒採用的校準品材料都各不相同，既有cTnl的單體形式，又有cTnC-Tnl、cTnC-cTnT-cTnl複合物形式，研究結果表明， 採用cTnl-cTnT-cTnC複合物作為校準品，由於其分子穩定性好又能被多數抗體識別，可大大縮小各試劑盒之間檢測結果差異。本發明的優點和有益效果1、本發明所採用的檢測方法具有操作簡單、適用範圍廣、精確度高及生產成本低的優點；2、本發明檢測方法中採用至少3種以上抗體的組合物，儘可能地滿足了高精度 cTnl檢測抗體所需條件，均衡了抗體對各種測定影響因素的敏感性，可以最小化陰性或陽性幹擾，增加了測定方法的精確度；3、本發明採用定向偶聯法將cTnl抗體包被到膠乳顆粒上，抗體偶聯部位為Fc片段，使抗原結合位點指向流動相，因此不會發生抗體結合力損失的情況，保持了抗體的活力，大大減少了抗體的用量，降低了生產成本。除此之外，該方法得到的致敏膠乳顆粒穩定性較好，抗體不會從膠乳顆粒上脫落，而且由於化學偶聯過程中，Fc片段發生了結構上的改變，因此減少了類風溼性因子(RF)和嗜異性抗體的幹擾，大大提升了檢測結果的準確性和可信性；4、本發明試劑盒中採用結構穩定、能被多數抗體識別的cTnl-cTnT-cTnC複合物作為校準品配製材料，進一步提高了試劑的檢測性能。


圖1所示的是本發明試劑盒與對照試劑盒的蛋白酶降解敏感性比較圖；圖2所示的是本發明試劑盒與對照試劑盒的肝素敏感性比較圖；圖3所示的是本發明試劑盒與對照試劑盒的磷酸化敏感性比較圖。
具體實施例方式下面通過實施例進一步詳細描述本發明，但本發明不僅僅局限於以下實施例。實施例1 cTnl抗體組合物的選擇本實施例選用兩種抗體組合物作為本發明試劑盒的製備，進行試驗，這兩種抗體組合物分別為僅1818 28、1亂74卜49、56083 93、1^419(1 1964個單克隆抗體(購自HyTest)按 1:1:1: 1的比例進行組合，及M1818 28、19C741 49、8E10 ; 9(1、458169 1784個單克隆抗體(購自HyTest)按1 :1:1: 1的比例進行組合。當然，除了以上組合的抗體組合物外，也可以為符合要求的其他組合的抗體組合物。實施例2 cTnl檢測試劑盒的製備本實施例的主要原材料如下1.抗體本發明試劑盒1僅1&8 現、1叱741 49、56083 93、1^419(1 1!36(比例為1 1 1 1)本發明試劑盒2:M1818 w、19C741 49、8E10TO 9(1、458169 1784 (比例為 1 1 1 1)對照試劑盒僅1818 28、1亂741 49(比例為1 1)2.膠乳本發明僅示例性地採用直徑為150 250nm的帶羧基基團的聚苯乙烯膠乳顆粒進行實驗。本實施例的主要試劑配製如下試劑Rl 含 1. 2% PEG6000(聚乙二醇 6000)、0. 15M(mol/L) NaCl 的甘氨酸緩衝液。 該試劑為無色透明溶液。試劑R2 用抗人cTnl抗體組合物偶聯聚苯乙烯膠乳顆粒。該試劑為乳白色溶液。具體步驟如下1.取Iml (100mg/ml)聚苯乙烯膠乳顆粒，用0. 1M、pH5. O的MES溶液(2-嗎啉乙
磺酸緩衝液)洗滌3次，超聲分散；2.加入0. 2ml用0. 1M、pH5. O的MES溶液新鮮配製的EDAC (10mg/ml)混合完全， 室溫混和15min ；3.加入0. 8ml用0. 1M、pH5. O的MES溶液新鮮配製的己二酸二醯胼(83mg/ml)， 4 °C反應過夜；4.用0. 1Μ、ρΗ5. O的MES溶液洗滌2次，0. 1Μ、ρΗ7. 5的磷酸鹽溶液洗滌1次，超聲
分散備用；5.取1. 5ml抗體組合物(3. 9mg/ml)溶液，加入0. 2ml用0. 1Μ、ρΗ7. 5的磷酸鹽溶液配製的高碘酸鈉溶液(10mg/ml)，室溫混合15min ；6.將步驟5中氧化好的抗體組合物加入到步驟4中已激活的聚苯乙烯膠乳溶液中，4°C反應過夜；7.加入0. 22ml 10% BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4°C混合4h ；8.加入0. 3ml 10%葡萄糖溶液，4°C混合過夜；9.用0. 12M、pH7. 5甘氨酸溶液洗滌3次，加入0. 12M、pH7. 5甘氨酸溶液(含1 % BSA、0. 1% TW-20、0. 2% NaN3的甘氨酸緩衝液)至聚苯乙烯膠乳顆粒終濃度為0. 15%。cTnl校準品在磷酸鹽緩衝溶液中加入不同含量的cTnl-cTnT-cTnC複合物，除菌過濾，所述的cTnl校準品中cTnl-cTnT-cTnC複合物含量控制在O 10ug/L之間，這些校準品均為無色透明液體。實施例3 cTnl的測定檢測工具日立7060型自動生化分析儀。分析方法兩點終點法；波長:600nm ；樣品量25ul ；Rl :200ul ；R2 :50ul ；校準方式多點校準；反應方向向上；測定溫度37°C ；樣品與Rl混勻後，於第Imin讀取吸光度 A1 ；於5min時加入R2，於細化時讀取吸光度A2。反應吸光度的計算為A2與Al的校準差值。計算方法採用多點校準，多參數曲線方程(如logit/log)擬合，以ΔΑ可求得肌鈣蛋白含量。實施例4不同影響因素的敏感性分析1、蛋白酶降解敏感性分析將內源性組織蛋白酶的混合物和cTnl-cTnT-cTnC複合物一起孵育120h，本發明試劑盒(包括本發明試劑盒1、本發明試劑盒2、和對照試劑盒同時檢測孵育前和孵育後 cTnl-cTnT-cTnC複合物濃度，其中孵育前複合物濃度為10ug/L。實驗結果表明，和對照試劑盒相比，本發明試劑盒大大提高了檢測結果的穩定性(見圖1)。2、肝素敏感性分析本發明試劑盒(包括本發明試劑盒1、本發明試劑盒2、和對照試劑盒同時檢測不含肝素和含10IU/ml肝素的樣本，實驗結果表明，對照試劑盒對含有肝素的樣本敏感性很高，和不含肝素的樣本相比，其反應性有所降低，而本發明試劑盒在測定不含肝素或含有肝素樣本時，反應性變化不大，即對肝素敏感性不高(見圖2)。3、磷酸化敏感性分析本發明試劑盒(包括本發明試劑盒1、本發明試劑盒2、和對照試劑盒同時檢測未發生磷酸化和被人為磷酸化的cTnl-cTnT-cTnC複合物，實驗結果表明，對照試劑盒對磷酸化敏感性很高，而本發明試劑盒對磷酸化基本不敏感(見圖3)。實施例所用的原料，除另有說明外，均為市售工業品。本發明的上述實施例是對本發明的說明而不能用於限制本發明，與本發明的權利要求書相當的含義和範圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的範圍內。
權利要求
1.一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特徵在於將抗體組合物與聚苯乙烯膠乳顆粒進行偶聯，然後與檢測標本中相應抗原發生免疫反應形成聚集顆粒，在400 700nm波長下測定反應物產生的濁度，即可得出檢測標本中cTnl的含量；所述抗體組合物由至少3種抗體組成，所述抗體為cTnl特異、而不與快骨骼肌型肌鈣蛋白I和慢骨骼肌型肌鈣蛋白I發生交叉反應，且所述抗體組合物中若其中一種抗體對檢測標本中某個影響cTnl精確測定的因素敏感，則至少有另一種抗體對該影響cTnl精確測定的因素不敏感，檢測標本中影響 cTnl精確測定的因素包括cTnl的存在形式、cTnl的磷酸化、cTnl的氧化、cTnl的易水解性、抗凝劑對抗體結合的影響，抗體經組合後有較好的反應性。
2.根據權利要求1所述的一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特徵在於所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
3.根據權利要求1所述的一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特徵在於所述抗凝劑包括乙二胺四乙酸、肝素。
4.根據權利要求1所述的一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特徵在於所述抗體組合物為M18w m單克隆抗體、19C741 49單克隆抗體、56083 93單克隆抗體、MF419(1 196單克隆抗體按1 :1:1: 1的比例進行組合，或MlS18M8單克隆抗體、19C741 49單克隆抗體、 8E1086 9(1單克隆抗體、458169 178單克隆抗體按1 :1:1: 1的比例進行組合。
5.根據權利要求1所述的一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特徵在於所述聚苯乙烯膠乳顆粒的平均粒徑為0. 05 0. 5 μ m。
6.根據權利要求1所述的一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法，其特徵在於所述偶聯為定向化學偶聯，包括以下步驟(1)聚苯乙烯膠乳顆粒的激活在聚苯乙烯膠乳顆粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺，乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺與聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為0.5 5 100，反應0. 5 Ih後加入己二酸二醯胼，己二酸二醯胼與聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為50 250 100，繼續反應0.5 lh，得到激活的聚苯乙烯膠乳顆粒；(2)抗體組合物的氧化用高碘酸鈉將抗體組合物非結合活性區域Fc端的羧基氧化成醛基，高碘酸鈉與抗體組合物的重量比為1 15 10；(3)抗體組合物與聚苯乙烯膠乳顆粒的偶聯將步驟(1)激活的聚苯乙烯膠乳顆粒與步驟( 氧化的抗體組合物混合，抗體組合物與聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為2 22 100，反應1 池後，加入葡萄糖，葡萄糖與激活的聚苯乙烯膠乳顆粒的重量比為 (25 50) 100，繼續反應2 4h，得到偶聯抗體組合物的聚苯乙烯膠乳顆粒。
7.運用權利要求1所述的一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法製備的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒，其特徵在於包括試劑1、試劑2，其中試劑1為緩衝液，試劑2由偶聯抗體組合物的聚苯乙烯膠乳顆粒、緩衝液組成，偶聯抗體組合物的聚苯乙烯膠乳顆粒與緩衝液的重量體積比為0. 05 0. ；35%。
8.根據權利要求7所述的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒，其特徵在於所述緩衝液為PBS 緩衝液、Tris緩衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、檸檬酸-磷酸鹽緩衝液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液、2-嗎啉乙磺酸緩衝液、氯化銨緩衝液中的一種或幾種。
9.根據權利要求7所述的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒，其特徵在於還包括校準品，所述校準品採用cTnl-cTnT-cTnC複合物作為配製材料。
全文摘要
本發明提供了一種檢測心肌肌鈣蛋白I的方法及運用該方法製備的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒。該方法將抗體組合物與聚苯乙烯膠乳顆粒進行偶聯，然後與檢測標本中相應抗原發生免疫反應形成聚集顆粒，在400～700nm波長下測定反應物產生的濁度，即可得出檢測標本中cTnI的含量。抗體組合物由至少3種抗體組成，抗體為cTnI特異、而不與快骨骼肌型肌鈣蛋白I和慢骨骼肌型肌鈣蛋白I發生交叉反應，且抗體組合物中若其中一種抗體對檢測標本中某個影響cTnI精確測定的因素敏感，則至少有另一種抗體對該影響cTnI精確測定的因素不敏感。該方法操作簡單、適用範圍廣、精確度高、抗幹擾能力強、生產成本低。
文檔編號G01N33/68GK102539784SQ201110440258
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者夏佳音, 鄒炳德, 鄒繼華 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司