基於雌馬酚激活BK_Ca通道的應用的製作方法

2023-10-25 03:26:17 2

專利名稱：基於雌馬酚激活BKCa通道的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於K+通道刺激技術領域，涉及基於雌馬酚激活BKca通道的應用。
背景技術：
K+通道在維持動脈平滑肌細胞膜電位中起重要作用，並調節著血管張力。根據門控特性的不同，血管平滑肌的K+通道至少可分為4種，即電壓門控性K+通道(voltage-gated K+ channel, Kv 通道)、內向整流 K+通道(inward rectifier K+ channel,Kir通道)、ATP敏感性K+通道(ATP-sensitive K+ channel, Katp通道)和鈣激活的K+通道(Ca2+-activated K+ channel, Kca 通道)。根據單通道電導大小和藥理學特性的差異，Kca通道又可分為三個亞類大電導鈣·激活的 K+通道(big conductance Ca2+_activated K+ channels, BKca 通道)、中電導I丐激活的 K+通道(intermediate conductance Ca2+-activated K+channels, IKca 通道)及小電導隹丐激活的 K+通道(small conductance Ca2+_activated K+ channels, SKca 通道)。收縮表型的血管平滑肌主要表達BKca通道，該通道由四個孔形成亞單位a和調節亞單位P I共同組成跨膜蛋白複合體。P I亞單位影響通道的Ca2+/電壓敏感性、對藥理學調節劑的反應以及通道向質膜的運輸。血管BKca通道激活引起平滑肌細胞膜電位超極化，關閉電壓依賴性Ca2+通道，導致血管擴張，從而對抗壓力和血管收縮劑引起的血管收縮。更為重要的是，BKea通道呈現組織和功能異質性。在腦動脈平滑肌細胞，BKea通道電流密度、對雌激素(作用於P I亞單位)的敏感性、^ I亞單位在mRNA和蛋白水平的表達以及P I與a亞單位蛋白的比值均明顯高於骨骼肌等外周小動脈平滑肌細胞。提示P I亞單位可能在腦血管BKca通道的調節中意義更為重要。因此，BKca通道的開放劑，尤其是選擇性激活BKca通道3 I亞單位的藥物對腦血管具有更強的選擇性擴張作用。Iberiotoxin (IbTX)能特異性地阻斷BKea通道,而Paxilline (PAX)也是較特異的BKea通道阻斷劑。大豆黃素(daidzin)是存在於大豆中的異黃酮類化合物，用於防治心腦血管疾病、骨質疏鬆症及更年期症候群等。近年發現，大豆黃素的代謝產物雌馬酚(equol)具有更高的生物活性，大豆黃素的生物學作用在一定程度上可能歸因於其代謝產物雌馬酚。然而，人群中能代謝大豆黃素為雌馬酚者約為309^50%。因此，人體能否將大豆黃素代謝為雌馬酚是決定大豆黃素能否更有效地發揮其藥理作用的關鍵。雌馬酚具有抗氧化、抑制心肌鈣超載、影響血管反應性、抗腫瘤、防治更年期綜合症和骨質疏鬆等作用。現代藥理學研究活性成分的藥理作用通常採用三類模型，一類是整體動物模型，另一類是離體器官模型，還有一類是細胞模型。前者主要用於藥效學觀察，後兩者主要用於探索藥物作用機制。整體動物模型是現代生物醫學研究中極其重要的實驗方法和手段，主要用於實驗生理學、實驗病理學和實驗治療學，尤其是新藥篩選研究。通過整體動物模型的研究，可以有意識地改變那些自然條件下不可能或不容易排除的因素，以便更加準確地觀察模型的實驗結果，並將研究結果推及於人類疾病，從而有助於更方便、更有效地認識人類疾病的發生、發展規律和研究防治措施。線栓法製備的大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebralartery occlusion, MCAO)再灌注模型因很好的模擬了臨床大腦中動脈阻塞溶栓治療的狀況，是目前最常用的研究抗腦缺血再灌注損傷藥物的動物模型。血壓測量是醫學動物實驗中掌握實驗對象生命活動的常用手段之一。最準確、可靠的測量方法是大動脈插管直接測量，但該方法需要實施麻醉，創傷大，對實驗技術和條件均要求較高。無創血壓測量法可以測量清醒動物，能夠獲取正常狀態下的血壓值，在基礎實驗研究中，常採用尾套測壓法測量清醒大鼠的血壓，該方法操作簡便、無創、可重複。整體動物模型的微循環觀察是研究微循環血流動力學最基本、最重要的方法，可以定量檢測組織血流量、血流速度等動態功能指標。其中雷射都卜勒血流儀(LaserDoppler Flowmetry, LDF)以其適應範圍廣、操作簡便、無創得到了廣泛應用。離體器官模型為藥理研究中重要而簡便的方法。通過觀察活性成分對特定離體組 織器官的作用，可以分析活性成分的藥理作用和可能的作用原理。其中，離體血管環實驗是篩選血管活性物質和研究其作用機制的常用模型，而選擇不同部位的血管還可以直接觀察化合物的組織選擇性。研究結果明確，並且可以進行定量分析。將人不同離子通道功能亞單位(a亞單位)或輔助亞單位(如^亞單位等)分別或共轉染於J1EK293細胞，經克隆篩選可建立穩定表達某種離子通道的細胞系。應用膜片鉗結合分子生物學技術可在體外研究該通道的特性、調節因素，並可用於篩選選擇性作用於通道不同亞單位的化合物及確定藥物對通道作用的結合位點。這是目前進行高通量藥物篩選和研究藥物作用機制的常用細胞模型。

發明內容
本發明解決的問題在於提供基於雌馬酚激活BKca通道P I亞單位的應用，通過多種方法驗證了雌馬酚通過激活BKea通道3 I亞單位，可擴張血管、增加腦血流量、保護缺血再灌注腦組織，有益於缺血性腦卒中的防治，可用於相關藥物的製備。本發明是通過以下技術方案來實現雌馬酚在製備保護腦缺血再灌注損傷的藥物的應用。雌馬酚在製備增加腦血流量的藥物的應用。所述的增加腦血流量的藥物為不影響血壓的藥物。雌馬酚在製備舒張血管的藥物的應用。所述的藥物為舒張腦血管的藥物。雌馬酚在製備激活BKea通道的藥物的應用。所述的藥物為激活BKea通道的P I亞單位的藥物。雌馬酚在製備防治缺血性腦卒中的藥物的應用。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的基於雌馬酚激活BKea通道的應用，是在採用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型、尾套法測量大鼠血壓、雷射都卜勒血流儀觀測腦實質和軟腦膜血流量及離體血管肌張力描記和膜片鉗技術的基礎上對雌馬酚藥用活性的檢測，結果表明，雌馬酚具有以下作用
I、雌馬酚對腦缺血再灌注損傷具有保護作用；2、雌馬酚在治療劑量對血壓無影響，不會因降低血壓而減少腦血流量；3、雌馬酚可明顯增加腦血流量；4、雌馬酚有明顯的舒張血管作用，且對腦血管選擇性更強，血管舒張作用與激活血管平滑肌BKea通道有關；5、雌馬酚對BKea通道的激活依賴於@ I亞單位的存在；這表明雌馬酚通過激活血管平滑肌BKca通道3 I亞單位，舒張腦血管、增加腦血流、保護缺血再灌注腦組織，有益於缺血性腦卒中的防治，可用於相關藥物的製備。


·
圖1-1為雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠腦梗死容積的影響；圖1-2為雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠神經症狀評分的影響；圖1-3為雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠死亡率的影響；圖1-4為雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠血清LDH活力的影響；圖1-5為雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠血清MDA含量的影響；圖2-1為雌馬酚對大鼠血壓的影響；圖3-1為雌馬酚對大鼠腦血流量的影響；圖4-1為雌馬酚對5-HT誘導的大鼠去內血管的舒張作用；圖4-2為Paxilline對雌馬酚血管舒張作用的影響；圖4-3為Iberiotoxin對雌馬酌■血管舒張作用的影響；圖5-1為雌馬酚濃度依賴性激活重組人BKca通道(Slo a / P )電流；圖5-2為雌馬酚對重組人BKca通道a亞單位(Slo)電流無激活作用。
具體實施例方式本發明分別採用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型、尾套法測量大鼠血壓、雷射都卜勒血流儀觀測腦實質和軟腦膜血流量及離體血管肌張力描記和膜片鉗技術，對雌馬酚的抗腦缺血作用進行驗證說明，結果表明雌馬酚通過激活BKca通道P I亞單位，擴張血管、增加腦血流量、保護缺血再灌注腦組織，可應用相關藥物的製備。下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。一、雌馬酚對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用I.材料I. I儀器GPS型雙極電凝器(上海醫用雷射儀器廠)，電熱三用水箱(SHHW21. 420，天津泰斯特儀器有限公司)，YP3001電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，TDZ4-WS低速臺式離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，4-0單絲尼龍線(美國ETHIC0N公司)。I. 2藥品雌馬酚(南京萊茵醫藥科技有限公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(上海化學試劑公司)。乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)I. 3動物健康雄性SD大鼠，體重220_250g，由西安交通大學實驗動物中心提供。2.方法
2. I動物分組與給藥將體重220_250g的健康雄性SD大鼠隨機分為6組，分別為假手術組(Sham)、模型組(Vehicle)和雌馬酹 5. 0mg/kg、2. 5mg/kg>I. 25mg/kg、0. 625mg/kg 組。各給藥組連續灌胃給藥3天，I次/日，第4日手術前30min再灌胃給藥I次。模型組和假手術組大鼠灌胃給予等容積的賦形劑。2. 2大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的建立按照Longa等人的線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合三氯乙醛經腹腔注射(4ml/kg)麻醉後，仰位固定於鼠板上，酒精消毒頸部皮膚，沿頸部正中做切口，暴露左側頸總動脈(commom carotid artery, CCA)和迷走神經。小心分離頸總動脈和迷走神經，然後鈍性分離頸內動脈(internal carotid artery, ICA)和頸外動脈(externalcarotid artery, ECA)。在ECA下穿兩根線備用,用雙極電凝器將ICA、ECA小分支電凝,結紮ECA遠心端備用，在CCA和ICA上用無損傷動脈夾阻斷血流。在ECA近心端剪一小口，將一端為杵狀的4-0單絲尼龍線插入小口，緩緩送入，取下ICA上的動脈夾，線栓自ECA經CCA·分叉處插入ICA，將尼龍線緩緩推入大腦中動脈，稍遇阻力即止，自頸內、外動脈分叉處算起線栓插入約17mm 22_。此時左側大腦中動脈的血供來源被完全阻斷,記錄下時間為腦缺血開始時間。取下CCA上的動脈夾，消毒，縫合傷口。在缺血2h後拔出線栓行再灌注。假手術組僅將尼龍線栓放入ECA，不進入ICA，模擬腦缺血再灌，手術過程應無出血，呼吸節律正常，手術時間控制在30min內。術後記錄各組大鼠死亡情況，計算死亡率。2. 3神經行為症狀評分大鼠左側MCAO 2h再灌注4h後進行神經行為症狀評分，採用10分法進行行為缺陷評分，評分標準如下①提鼠尾觀察前肢屈曲情況，雙前肢對稱伸向地面0分，手術對側(右)前肢輕度屈曲I分，前肢中度或嚴重屈曲2分；②提鼠尾觀察軀幹扭曲情況，無扭曲0分，輕度扭曲I分，中度或嚴重扭曲2分將大鼠置於平地上，分別推雙肩向對側移動檢查阻力，如雙側阻力對等且有力0分，如向手術對側推動時阻力輕度下降者I分，重度下降2分；④將大鼠雙前肢置於一金屬網上，觀察雙前肢張力，對等有力0分，對側前肢張力下降I分將大鼠置於水平地面，觀察其運動情況，運動正常0分，自發運動減少I分，給予刺激才運動2分，對刺激無反應3分。滿分10分，分數越高，行為障礙越嚴重。2. 4腦梗死範圍測定及血清LDH活力和MDA含量測定大鼠腦缺血24h後，用水合三氯乙醛經腹腔注射麻醉，仰位固定於鼠板上，打開腹腔，暴露腹主動脈，用無菌注射器從腹主動脈採血，轉移至一次性試管靜置，待血液凝固後800rpm離心lOmin，收集析出的血清，保存至_80°C低溫冰箱，隨後檢測血清中LDH活力及MDA的含量。取血後迅速斷頭取出大腦，將其置於_20°C的冰箱內約lOmin，之後取出連續冠狀切片，每片腦片厚約2mm，共6片，置於2%TTC溶液中37°C水浴箱中孵育30min，然後取出用PBS衝洗3次，再用4%多聚甲醛溶液固定6h。梗死的腦組織染色後呈白色，正常腦組織染色後呈紅色。腦片用數位照相機拍照，用圖像處理軟體Adobe photoshop分析，計算連續冠狀切片的腦組織的梗死容積百分比。2. 5數據處理統計分析用SPSS 13. 0軟體,數據以mean土SE表示,用SigmaplotlO. 0軟體做統計圖。腦組織梗死容積百分比的組間比較採用非參數檢驗，神經行為症狀評分、血清LDH活力和MDA含量組間比較採用one-way ANOVA檢驗，死亡率組間比較採用X2檢驗。P〈0. 05和P〈0. 01為差異具有顯著性，分別以和「**」表示。3.結果3. I雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠腦梗死容積的影響由圖1-1 可見(n=8，*P < 0. 05，**P < 0. 01 vs. Vehicle)，與 Vehicle 組比較，當給予大鼠0. 625mg/kg 2. 5mg/kg的雌馬酹時,腦缺血再灌注大鼠腦梗死容積隨劑量增加而減小(P〈0. 05或P〈0. 01)，而劑量增至5mg/kg時，作用反而 減弱。表明雌馬酚在一定劑量範圍對腦缺血再灌注損傷有保護作用。3. 2雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠神經症狀評分的影響大鼠左側MCA02h再灌注4h時，雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠神經症狀評分的影響的檢測結果如圖1-2 (n=10,**P < 0.01 vs. Vehicle)所示，Vehicle組神經症狀嚴重，應用不同劑量雌馬酚後，可明顯減輕腦局部缺血再灌注損傷引起的神經症狀(P〈0. 01)，說明雌馬酚能改善腦缺血再灌注引起的神經功能障礙。3. 3雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠死亡率的影響如圖1-3所示(*P < 0. 05 vs. Vehicle，圖中數字為動物數)，與Vehicle組比較，給予不同劑量的雌馬酚均有降低腦缺血再灌注動物死亡率的趨勢，其中2. 5mg/kg劑量組的作用有顯著性差異(P〈0. 05)。3. 4雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠血清LDH活力的影響由圖1-4 可見(n=10, mP < 0. Olvs. Sham, **P < 0. 01 vs. Vehicle),與 Sham 組相比，Vehicle組和各給藥組動物血清中LDH的活力均升高(P〈0. 01 )，提示缺血再灌注引起神經細胞膜等損傷，細胞內LDH釋放入血。與Vehicle組比較，給予不同劑量的雌馬酚均能降低腦缺血再灌注動物血清中LDH的活力，以2. 5mg/kg和I. 25mg/kg劑量組的血清LDH活力降低較明顯(P〈0. 01 )，這進一步從血液生化角度表明了雌馬酚抗腦缺血再灌注損傷的效果。3. 5雌馬酚對腦缺血再灌注大鼠血清MDA含量的影響如圖1-5 所示(n=8，##P < 0. Olvs. Sham *P < 0. 05, **P < 0. 01 vs. Vehicle)，與Sham組相比，Vehicle組和各給藥組動物血清中MDA的含量均升高(P〈0. 01 )，這符合腦缺血再灌注損傷以脂質過氧化為標誌的特徵。給予不同劑量的雌馬酚均能降低腦缺血再灌注動物血清中的MDA含量，以2. 5mg/kg和I. 25mg/kg劑量組的血清MDA含量降低較明顯(P〈0. 01或P〈0. 05)，表明雌馬酚能抑制腦組織脂質過氧化反應，保護腦缺血再灌注損傷。上述檢測結果表明雌馬酚對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。二、雌馬酚對大鼠血壓的影響I.材料I. I儀器BP-6動物無創血壓採集處理系統，TM_WAVE動物無創血壓測試軟體，BP-6動物無創血壓測試箱，大鼠鼠籠均購自成都泰盟科技有限公司I. 2藥品雌馬酚購自南京萊茵醫藥科技有限公司。I. 3動物健康雄性SD大鼠，體重220_250g，由西安交通大學實驗動物中心提供。2.方法2. I動物分組與給藥
體重220_250g的健康雄性SD大鼠，依次測量血壓後隨機分為3組，分別為雌馬酚給藥2. 5mg/kg、l. 25mg/kg、0. 625mg/kg。連續灌胃給藥4天，I次/日，於末次給藥後30min再次測量血壓。2. 2血壓的測量將大鼠放入鼠籠中，露出鼠尾，將其穿過加壓尾套並儘可能固定在鼠尾根部。隨後將大鼠放入血壓測試箱中(溫度設定在37°C )。打開TM_WAVE軟體，觀察顯示窗口的脈搏波形是否穩定。待動物安靜並出現穩定的脈搏波形時，開始測量血壓。先給尾套充氣加壓，脈搏波逐漸減小，當脈搏波消失時停止充氣，開始放氣。當尾套壓力等於收縮壓時脈搏波開始出現，此點的血壓值即為鼠尾血壓值。重複測量3次，取其平均值。2. 3數據處理數據測量採用TM_WAVE軟體，統計分析用SPSS 13. 0軟體，數據以mean±SE表示， 用Sigmaplot 10. 0軟體做統計圖。給藥前後比較採用獨立樣本t檢驗，P〈0. 05和P〈0. 01為差異具有顯著性，分別以和「**」表示。3.結果檢測結果如圖2-1所示(n=8)，雌馬酚3個劑量組給藥前後的血壓無明顯變化。說明雌馬酹在0. 625mg/kg^2. 5mg/kg劑量範圍對血壓無影響。三、雌馬酚對大鼠腦血流量的影響I.材料I. I儀器大鼠立體定位儀(日本Narishige, SN-2N);雷射都卜勒血流測定儀(瑞典Perimed, PF5001 )、雷射針式探頭(瑞典 Perimed, probe-407)> PSff 軟體(瑞典 Perimed)I. 2藥品雌馬酚購自南京萊茵醫藥科技有限公司。I. 3動物健康雄性SD大鼠，體重220_250g，由西安交通大學實驗動物中心提供。2.方法2. I腦血流量測定大鼠腹腔注射10%水合三氯乙醒(4ml/kg)麻醉,將頭部固定在大鼠立體定位儀上，剪開頭部皮膚及皮下組織，暴露顱骨，在大腦頂葉頂端鑽孔、開窗(大小以能放置針式探頭即可)，並小心去除硬腦膜。使用雷射都卜勒血流測定儀觀測腦血流約20min，若血流值一直較穩定，則開始腹腔注射給藥。藥物劑量分為2. 5mg/kg、I. 25mg/kg和0. 625mg/kg三組，給藥後觀察腦血流量的變化。觀察時間約2-3h，以腦血流量穩定至給藥前水平為止。2. 2數據處理統計分析用SPSS 13. 0軟體,數據以mean土SE表示,用Sigmaplot 10. 0軟體做統計圖，給藥前後比較採用one-way ANOVA檢驗。P〈0. 05和P〈0. 01為差異具有顯著性，分別以和「**」表示。3.結果檢測結果見圖3-1 (n=6, **P < 0. 01 vs. Vehicle), 2. 5mg/kg、I. 25mg/kg 兩個劑量組的腦血流量與給藥前相比明顯增加(P〈0. 01)，0. 625mg/kg組的腦血流量與給藥前相比無明顯改變。結果表明中、大劑量的雌馬酚可顯著增加腦血流量。四、雌馬酚對大鼠腦基底動脈及腸繫膜動脈的舒張作用I.材料
I. I儀器血管張力測定儀(丹麥DMTA/S公司，610M);SHB_3循環水多用真空泵(鄭州杜普儀器廠)；解剖顯微鏡(日本Olympus公司，SZ1145) ;pH計(瑞士 MEITLER TOLEDO公司，DELTA 320);電子分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司，BSA124S);供氧裝置；顯微外科手術器械；可調微量加樣器(美國Eppendoff公司)；小型注射器。I. 2藥品5-輕色胺(5-HT)購自Sigma公司，溶於蒸懼水中；Paxilline (PAX)和Iberiotoxin (IbTX)購自Sigma公司，雌馬酚購自南京萊茵醫藥科技有限公司，以上三藥均溶於二甲亞碸中；所有藥物分別配成適當濃度分裝保存於_20°C，應用時稀釋成所需濃度。I. 3動物健康雄性SD大鼠，體重220-250g，由西安交通大學實驗動物中心提供。2.方法2. I營養液配製Krebs-Henseleit 液(KH 液)
權利要求
1.雌馬酚在製備保護腦缺血再灌注損傷的藥物的應用。
2.雌馬酚在製備增加腦血流量的藥物的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的藥物是激活BKea通道的藥物。
4.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的藥物為不影響血壓的藥物。
5.雌馬酚在製備舒張血管的藥物的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的藥物是激活BKea通道的藥物。
7.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的藥物為舒張腦血管的藥物。
8.雌馬酚在製備激活BKea通道的藥物的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述的藥物為激活BKea通道的￠1亞單位的藥物。
10.雌馬酚在製備防治缺血性腦卒中的藥物的應用。
全文摘要
本發明公開了基於雌馬酚激活BKCa通道的應用，在採用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型、尾套法測量大鼠血壓、雷射都卜勒血流儀觀測腦實質和軟腦膜血流量及離體血管肌張力描記和膜片鉗技術的基礎上對雌馬酚藥用活性的檢測，結果表明雌馬酚通過激活BKCa通道β1亞單位，擴張血管、增加腦血流量、保護缺血再灌注腦組織，有益於缺血性腦卒中的防治，可用於相關藥物的製備。
文檔編號A61K31/353GK102784135SQ20121023164
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者於瑋, 王燕, 鄧秀玲 申請人:西安交通大學