抗皺劑的製作方法

2023-10-25 09:02:37

專利名稱：抗皺劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的抗皺劑。更詳細地說，本發明涉及以西洋菜，杜松，白朮和/ 或款冬來源的提取物作為有效成分的抗皺劑。另外，本發明還涉及以上述提取物作為有效成分的基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑以及皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑，以及使用上述提取物的人工皮膚製造方法，減輕皺紋的方法，皮膚鬆弛和皮膚彈力改善的方法。
背景技術：
覆蓋包括人在內的各種動物全身的皮膚，承受著如下的變化由於日光、乾燥、氧化、環境因素所致的壓力和精神壓力等的外部因子、以及老化導致皺紋形成、硬化、色斑、晦暗、彈性降低等。這裡，對皮膚進行大致劃分的話，可分為表皮和真皮兩層結構。在表皮與真皮之間有一種稱為基底膜的薄薄的纖細膜層存在。表皮的代謝是通過這層基底膜，獲取真皮細胞產生的因子或血液供給的。皮膚中表皮的增殖與分化是通過基底膜和真皮進行調節的。因此，藉助於基底膜的表皮與真皮間的交流，對皮膚表皮的功能調節來說，起著至關重要的作用。皮膚基底膜中存在有一種稱為錨著複合體的特殊結構，具有穩定表皮和真皮兩種組織間的粘連和交流的重要作用。錨著纖維複合體的蛋白質可以將作為角質形成細胞的細胞骨骼的角蛋白與真皮乳頭層結締組織的蛋白質這兩者相互聯結起來。錨著纖維複合體的重要構成成分之一就是層粘連蛋白-5(RouSSelle et al. , J Cell Biol. 1991 Aug ； 114(3) :567-76)。迄今為止的研究揭示了造成所謂Herlitz交界型大皰性表皮鬆解症這樣的重度水皰病的先天性遺傳疾病的原因是由於編碼層粘連蛋白-5三條肽鏈的基因的遺傳學變異。(Aberdam et al.，Nat Genet. 1994 Mar ；6(3) :299-304)。這表明層粘連蛋白-5 是表皮粘連所不可或缺的物質。而且已知該粘連蛋白-5會形成錨絲(anchoring filament)， 進而與已知作為層粘連蛋白-5受體的整聯蛋白α 6β4(半橋粒中存在的跨膜型整聯蛋白) 發生結合(Niessen et al.，Exp Cell Res. 1994 Apr ；211 (2) :360-7)。有報導指出，層粘連蛋白-5不僅直接結合形成連接真皮乳頭層錨著纖維的VII型膠原蛋白，而且還同其它的層粘連蛋白-6或-7 —起形成複合體，該複合體通過巢蛋白與基底膜骨架IV型膠原蛋白結合。有報告指出，觀察到構成上述複合體的IV型膠原蛋白的表達水平會隨著年齡老化而降低(Vazquez F et al.，Maturitas 1996,25 :209-215)，關於層粘連蛋白 _5 結合的 VII型膠原蛋白，來源於高齡者的皮膚成纖維細胞比來源於年輕人的皮膚成纖維細胞，其蛋白質水平以及mRNA水平的生成能力都有下降(Chen et al.，J. Invest. Dermatol.，102 205-209，1994)。也有報導指出，由VII型膠原蛋白構成的錨著纖維在正常皮膚中也會伴隨著生理老化和光老化而減少(辻卓夫，日皮會誌105 :963-975，1995，Tidman et al.，J. Invest Dermatol. ,83 :448-453,1984)。除了它們的種種的構成成分特徵之外，已知基底膜本身伴隨著皮膚老化也會出現多層化、分解斷裂等等結構(lavker et al. ,J. Invest. Dermatol. 197973 :59-66)，並且認為這種結構變化的結果造成了皺紋、鬆弛等老化特徵的出現，以及伴隨老化的皮膚功能低下。為此，促進構成基底膜骨架的層粘連蛋白_5、IV型以及VII型膠原蛋白的生成本身，對於保持良好的基底膜構造狀態和防止皮膚老化是極其重要的。事實上有報導指出，對皮膚基底膜構造進行詳細觀察時，以二十歲後期到三十歲早期為對象進行觀察發現基底膜損傷發生頻率是較高，說明基底膜構造變化在誘導皮膚老化中具有重要的作用(IFSCC Magazine, 2000 4(4) :15-23)。為防止皮膚老化，主要問題之一就是抗皺。而且，皺紋大致分類為皮溝較淺的「表皮皺紋」(小皺紋)和皮溝較深的「真皮皺紋」(大皺紋)，然而，特別是真皮皺紋隨著基底膜的變化，會發生真皮層的變性和塌陷，因此，鑑於這一原因，基底膜的維護被認為是很重要的。進而，除上述基底膜的構成成分之外，真皮中大量存在的I型和III型膠原蛋白 (大約分別為80%和15% )，由於隨著年齡老化在真皮中的絕對值有所減少，所以認為它們的變化很可能同真皮彈性以及皮膚彈力的減少、皺紋、或者真皮的萎縮有很密切的關係。我們對III型膠原蛋白進行了調查，在胚胎的幼兒組織中III型膠原蛋白的比例要高於成人組織的比率，在皺紋明顯的Hders-Danlos症候群IV型的病人組織中未發現III型膠原蛋白的存在，因此認為構成正常的柔軟皮膚時III型膠原蛋白可能是一種很重要成分。而且，真皮中的I型和III型膠原蛋白是由成纖維細胞合成的。如果在膠原蛋白中培養這種成纖維細胞，則膠原蛋白出現收縮。收縮的膠原蛋白的纖維密度與真皮中的纖維密度值很接近。這是由於成纖維細胞使得膠原蛋白纖維靠近所生成的現象。在實際的真皮中，可以認為，成纖維細胞通過使得膠原蛋白纖維充分緊密接近來保持皮膚彈力的。可以說，為維持抗皺、改善皮膚鬆弛和皮膚彈力等的皮膚恆常性，除基底膜外，真皮的功能維持也很重要。至今為止，從維持皮膚恆常性的觀點出發，已經提出專利申請的包括具有增強基底膜主要成分層粘連蛋白-5的生成能力的大豆來源的調製品和溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂酸，以及罌粟科屬(Bacconia)屬、四稜豆屬(Psophocarpus)、決明屬(Cassia)和百金花屬(Erythraea)植物的提取物(特開平11-3432 號、特開2000_2沈308號、以及特開 2003-313135號公報)。同樣，已知的III型、IV型、VII型膠原蛋白生成促進劑有大豆、日本山毛櫸的樹芽、葛根、歐洲常春藤、山毛櫸科山毛櫸屬植物的提取物等各種植物來源的提取物(特開2001-39849號、特開2004-18471號、特開2004-75661號等)。但是，既促進基底膜重要構成成分層粘連蛋白_5、IV型、VII型膠原蛋白，又促進真皮的重要構成成分III 型膠原蛋白生成的促進物質只有葛根提取物(特開2001-39849號、特開2003-137767號和特開 2004-18471 號)。

發明內容
本發明涉及提供一種新型的抗皺劑。本發明人特別是為達到針對真皮抗皺的目的，對各種植物提取物進行了深入的研究，其結果發現，西洋菜、杜松、白朮、款冬能顯著促進基底膜的重要構成要素層粘連蛋白-5、IV型膠原蛋白、VII型膠原蛋白，以及真皮的重要構成成分III型膠原蛋白的生成， 而且在應用於皮膚的情況下，發現其具有防止皮膚老化作用、特別是抗皺作用和皮膚鬆弛與皮膚彈力的改善作用。同時，發現上述的提取物中的杜松、白朮、款冬具有抗炎作用和創傷癒合作用。迄今，尚未報導過上述植物提取物促進包括層粘連蛋白-5在內的細胞外基質生成的促進作用，以及在皮膚老化過程中的抗皺作用。西洋菜(學名Nasturtium officinalis R. Brown)作為一種十字花科植物的西洋菜的提取物，已知具有活血作用(特開2001-181120)，並由於促進生成血管內皮細胞生長因子而被用作育發產品(特開2003-313113)。但是並不知道其對於皮膚老化的作用。杜松(學名Juniperus oxycedrus Linne)作為一種柏科植物的杜松的提取物， 已知具有改善皮膚幹糙等的皮膚屏障功能的效果(特開2001-288066)，但是並不知道關於皮膚老化、抗皺、皮膚鬆弛和皮膚彈力的改善作用。另外，這裡所說的改善皮膚屏障功能效果是針對角質層而言的，並不涉及對角質層以下的真皮等的效果。白朮(學名Atractylodes macroc印hale)作為一種菊科植物的白朮的提取物， 已知有抗皮膚幹糙的作用(特開2003-194809)、抗白髮作用(特開2004-161639)，但是並不知道關於皮膚老化、抗皺、皮膚鬆弛和皮膚彈力的改善作用。款冬(學名Tussilago farfara Lirme)作為一種菊科植物的款冬的提取物，已知有抑制光毒性效果、可例舉出防止UVA照射大氣汙染物質產生的產物所導致的老化的作用(特開2002-12548)，但是並不知道對於主要由UVB照射引起的皺紋的預防/改善作用以及皮膚鬆弛和皮膚彈力的改善作用。因此，本發明提供，含有西洋菜、杜松、白朮以及款冬提取物中的至少任意一種作為有效成分而形成的抗皺劑、基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑、皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑，以及使用上述提取物的人工皮膚的製造方法、為皺紋減輕以及改善皮膚鬆弛和皮膚彈力的美容方法。本發明涉及的抗皺劑，通過含有西洋菜、杜松、白朮、款冬提取物，促進基底膜重要構成成分層粘連蛋白_5、IV型膠原蛋白、VII型膠原蛋白，以及作為真皮重要構成成分的 III型膠原蛋白等的細胞外基質的生成。此外，通過促進細胞外基質的生成，修復基底膜和真皮，使得創傷癒合，實現減少皮膚水分蒸發量、增加皮膚粘彈性等的皮膚狀態向正常轉化、或者實現減少皺紋數目及其長度的抗皺作用。雖然確切的機理還不清楚，但是這些作用都可以認為是由於促進了層粘連蛋白等生成所導致的基底膜及真皮的修復與穩定的結果。 因此，上述的提取物也能改善基底膜細胞的松解、基底膜從表皮的剝離、VII型膠原蛋白的異常等、由於基底膜不穩定所導致的表皮水皰病的症狀改善。另外，本申請發明最獨特的效果是上述所有的提取物不是單一地促進層粘連蛋白-5、III型、IV型膠原蛋白以及VII型膠原蛋白的某一種，而是促進它們所有的生成。
具體實施例方式抗皺劑本發明的抗皺劑是以西洋菜、杜松、白朮和/或款冬的提取物作為有效成分的。本說明書中使用的「抗皺」意思是指，在後述的「防止皮膚老化作用」中，防止和/或改善皮膚皺紋的作用，特別是減輕皮膚皺紋的數目和長度，但是有時與「防止皮膚老化作用」同義使用。另外，通過本發明所改善/防止的「皺紋」特指基底膜變化導致的真皮層塌陷生成的皮溝較較深的真皮皺紋。這些作用可以考慮例如，依據視覺感官判定的角質改善、皮膚水分量增加、皮膚彈性增加等的要因進行判斷。本發明所實現的上述作用，雖然被認為是通過西洋菜、杜松、白朮和款冬來源的提取物增加層粘連蛋白_5、III型、IV型或VII型膠原蛋白等細胞外基質的生成量，由此使基底膜和真皮穩定，並改善皮膚的恆常性的，但是明確的機理還不清楚。鑑於此，通過本發明的抗皺劑所獲得的抗皺作用並不僅僅是限於細胞外基質生成量的增加所導致的結果。此外，已知款冬提取物具有預防/改善UVA輻射所產生的皮膚老化或者皺紋產生的作用(特開2002-12548)，但是並不知道對於主要由UVB引起的皺紋的預防/改善作用。本說明書中使用的「防止皮膚老化作用」是指，防止和改善伴隨年齡老化或光老化引起的基底膜構造變化的積累所導致的皮膚功能降低，具體的是皮膚的皺紋、鬆弛、硬化等，維持具有彈力的年輕健康的皮膚狀態。基底膜穩定劑本發明提供以西洋菜、杜松、白朮和款冬來源的提取物中至少任意一種作為有效成分的基底膜穩定劑。這裡，本說明書中使用的「基底膜穩定化」的含義是指，對於存在於表皮與真皮之間的，與維持皮膚恆常性密切相關的基底膜，穩定其骨架，進而進行修復。更具體地講，就是通過促進構成基底膜的重要成分，特別是細胞外基質的生成，對基底膜產生的全部作用。細胞外基質生成促進劑本發明還提供，以上述提取物中的至少任意一種作為有效成分的細胞外基質生成促進劑。這裡，本說明書中使用的「細胞外基質」的含義是指，為所屬行業中所公認的，特別是包含層粘連蛋白_5、IV型或VII型膠原蛋白在內的基底膜中的重要構成成分，以及III 型膠原蛋白等真皮的重要構成成分。皮膚鬆弛、皮膚彈力的改善劑本發明還提供，以上述提取物中的至少任意一種作為有效成分的皮膚鬆弛、皮膚彈力改善劑。這裡，本說明書中使用的「皮膚鬆弛、皮膚彈力的改善」的含義是指，通過提高皮膚彈性和收緊皮膚來改善由乾燥、紫外線等外界刺激、老化導致的皮膚鬆弛和皮膚彈力。 例如，，能夠通過體外試驗的膠原蛋白凝膠的收縮促進作用等進行評價，通過活體試驗的皮膚粘彈性等進行評價。此外，上述提取物除具有抗皺作用、基底膜穩定作用、細胞外基質生成促進作用、 皮膚鬆弛和皮膚彈力改善作用以及膠原蛋白凝膠收縮促進作用之外，還具有抗炎作用和傷口癒合作用。但是，上所述所有這些的作用的確切機理尚不清楚。本說明書中使用的「抗炎作用，，以及「創傷癒合促進作用，，是指，將本發明的植物提取物應用於各種炎症部位以及創傷部位的情況下，同非使用部位相比較而言進行相對確定的。利用本發明所得到的創傷癒合促進作用包括促進細胞外基質生成所產生的結果，穩定以及修復基底膜所產生的結果。 但是，該作用並不限於細胞外基質生成增加所引起的。此外，本發明中使用的提取物中，已經報導了西洋菜提取物有創傷癒合效果(特開2003-313134)。除上述抗炎作用和創傷癒合作用外，本發明使用的植物提取物也具有表皮水皰病的改善作用。這裡，本說明書中使用的「表皮水皰病的改善作用」的意思是指，不僅可以緩和、治療被分類為單純型表皮水皰病、接合型表皮水皰病以及營養失養型表皮水皰病的常見表皮水皰病，而且還可以預防該疾病的症狀。該作用是通過促進基底膜的重要構成成分膠原蛋白等的生成，從而穩定基底膜構造而帶來的。本發明中使用的植物提取物來源於西洋菜、杜松、白朮和款冬。從草本植物西洋菜、杜松、白朮和款冬各植物的根、葉、莖、花等提取，從木本植物杜松的根、芽、樹皮、果實、 葉、花等部位提取。提取方法可以採用溶劑提取法，用溶劑提取時，根據需要對植物材料進行乾燥，而且根據需要將植物材料切碎或粉碎後，用水性提取劑，例如冷水、溫水、或者沸水或較沸點溫度稍低的熱水；或者用有機溶劑，例如甲醇、乙醇、1，3_ 丁二醇，乙醚等在常溫或者加熱條件下進行提取。但是，提取方法不限於溶劑提取，所在行業內已知的常用方法都可以使用。上述提取物的形態不僅包括提取液本身，還包括採用常用方法進行適當稀釋或者濃縮、 或者乾燥後的形態。本發明的抗皺劑、基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑或者皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑可以單獨地含有各提取物，或者組合含有多種的提取物。作為其它的形式，本發明的抗皺劑、基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑或者皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑，有時進一步含有絲氨酸蛋白酶抑制劑而構成。如後述實施例所記載的那樣，本發明的抗皺劑、基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑或者皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑，通過進一步含有絲氨酸蛋白酶抑制劑，能抑制膠原蛋白的分解，使基底膜和真皮保持更良好的狀態。其結果是，利用本發明獲得的抗皺作用、皮膚鬆弛和皮膚彈力的改善作用、創傷癒合促進作用、表皮水皰病的改善作用等都將會有良好的效果。作為該絲氨酸蛋白抑制劑，並沒有限定，可以例舉，歐薄荷、鹿蹄草、小連翹、魚腥草、山金車、木瓜、山楂、旋果蚊子草、西洋玫瑰、野薔薇、 葡萄、牡丹、蛇麻、覆盆子、羅馬甘菊的提取物，這些也都可以按照上述的西洋菜等的提取方法，同樣採用溶劑提取等進行提取。此外，上述的絲氨酸蛋白酶抑制劑也包括抑肽酶、凝血酸、ε-氨基己酸等。本發明使用的上述提取物，按照能夠實現防止皮膚老化作用、特別是抗皺作用以及皮膚鬆弛和皮膚彈力改善作用所必需的量，或者按照能夠實現基底膜和真皮的穩定或者層粘連蛋白_5、III型、VI型或VII型膠原蛋白等的細胞外基質生成量增加所需的量進行配合。此外，根據增加角質或者透皮水分含量增加(改善幹糙)、增加皮膚彈性、改善皮膚紋理等的目的進行相應量的配合，而且該配合量也可依據配合劑型等的各種因素而有所變化。對配合量沒有任何限制，但是上述提取物的配合量，相對於抗皺劑、基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑或者皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑的總質量而言，為0. 0001-10質量％的濃度，最優選為0.001-1質量％的濃度。本發明的抗皺劑、基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑或者皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑中，除上述提取物外，在不影響抗皺作用等的範圍內，也可以根據需要適當配合一般化妝品和醫藥品中可以配合的成分，例如，液態油脂、固體油脂、蠟、碳水化合物、高級脂肪酸、高級醇、酯類、矽油類、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、非離子表面活性劑、保溼劑、水溶性高分子化合物、增粘劑、成膜劑、紫外線吸收劑、金屬離子螯合劑、低級醇、多元醇、糖類、胺基酸類、有機胺類、PH調節劑、皮膚營養劑、維生素類、防氧化劑、香料、粉末、色素材料、水等。另外，也可以適當配合L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸磷酸酯、L-抗壞血酸硫酸酯等的L-抗壞血酸的酯衍生物及其鹽；L-抗壞血酸葡萄糖苷等的L-抗壞血酸的配糖體及其鹽；4-甲氧基水楊酸等的烷氧基水楊酸及其鹽；對苯二酚β-D-葡萄糖、對苯二酚α-D-葡萄糖等的對苯二酚配糖體及其鹽；凝血酸、凝血酸甲醯胺鹽酸鹽等的凝血酸衍生物；4-正丁基間苯二酚等的間苯二酚衍生物；曲酸、鞣花酸、亞油酸、洋甘菊提取物、視黃酸、視黃醇、視黃醇醋酸酯、視黃醇棕櫚酸酯、甘草酸及其衍生物等；溶血磷脂醯膽鹼和溶血磷脂酸、大豆調製品等的層粘連蛋白-5生成促進劑；葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖類；煙酸苄酯、煙酸丁氧基乙酯、辣椒素、薑酮、斑蝥酊、 魚石脂、咖啡因、單寧酸、α-冰片、煙酸生育酚酯、六煙酸肌醇酯、環扁桃酯、桂利嗪、妥拉唑林、乙醯膽鹼、維拉帕米、千金藤鹼、Y-谷維醇等的活血劑；硫磺、噻嗯素等的抗脂溢劑； 從多樣的目的出發，可適當配合檜木硫醇、鳶尾提取物、兒茶鉤藤提取物、尿囊素、蘆薈提取物、鹿蹄草提取物、百裡香提取物、薑黃提取物、黃柏提取物、黃連提取物、小連翹提取物、刺芒柄花提取物、水解酪蛋白、水解酵母提取液、葛根提取物、木糖醇、苦參提取物、大米提取物的水解液、柴胡提取物、藏紅花提取物、氧化鋅、四稜豆提取物、紫草提取物、芍藥提取物、 生薑提取物、包覆了二氧化矽的氧化鋅、鼠尾草提取物、錦葵提取物、川芎提取物、當藥提取物、陳皮提取物、辣椒提取物、當歸提取物、桃仁提取物、硫代牛磺酸、人參提取物、大蒜提取物、射幹提取物、亞牛磺酸、樺樹提取物、枇杷提取物、葡萄提取物、山毛櫸樹芽提取物、絲瓜提取物、牛至提取物、百合提取物、薏苡仁提取物、迷迭香提取物、精氨酸及其鹽酸鹽、絲氨酸及其鹽酸鹽等胺基酸及其衍生物；泛酸鈣、D-泛醇、泛醇乙醚、乙醯泛醇乙醚等的泛酸類；麥角鈣化醇、膽鈣化醇等的維生素D類；煙酸、煙酸醯胺、煙酸苄酯等的煙酸類；α -生育酚、生育酚醋酸酯、DL- α -生育酚煙酸酯、DL- α -生育酚琥珀酸酯等的維生素E類、維生素K、維生素P、生物素等的維生素類；泛醌等的輔酶等。本發明的抗皺劑、基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑或者皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑的劑型沒有特殊的限制，可以製成，溶液體系、可溶化體系、乳化體系、粉末分散體系、水-油雙相體系、水-油-粉末三相體系、軟膏、凝膠、氣霧劑等的任何劑型。另外，使用形態也沒有特殊的限制，可以使用化妝水、乳液、霜劑、精華液、啫哩、凝膠、軟膏、面膜、粉底等的任何形態。皮膚外用劑進而，本發明提供含有上述提取物形成的皮膚外用劑。這裡，本發明的皮膚外用劑是指，以抗皺作用和皮膚鬆弛與皮膚彈力改進作用之外的防止皮膚老化作用、抗炎作用、創傷癒合促進作用、表皮水皰病改善作用等為目的使用的外用劑。但是，本發明的皮膚外用劑並不僅限於上述目的，還包括有意利用上述提取物的細胞外基質生成促進作用試圖進行皮膚的各種症狀的改善。本發明的皮膚外用劑可以配合的物質同上述的抗皺劑等一樣，但是可根據本領域技術人員所希望的目的來決定適合的種類、數量、濃度等。例如，以抗炎作用和創傷癒合作用為目的的情況下，上述提取物相對於皮膚外用劑總質量的配合濃度為0. 0001-10質量％，優選的配合濃度為0.001-1質量％。抗自皮劑、S^J莫穩定劑、細朐,夕卜基質牛成促講布丨或者_夫松她夫彈力齊|丨的製造方法。在另一方式中，本發明提供包括添加西洋菜、杜松、白朮和款冬來源的提取物到水相或者油相的工序的抗皺劑、基底膜穩定劑、細胞外基質生成促進劑或者皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑的製造方法。該方法也可以適用於上述的皮膚外用劑。人工皮膚的製造方法進而，本發明提供人工皮膚的製造方法，其特徵在於，將西洋菜、杜松、白朮和款冬的提取物中的至少任意一種添加到人工皮膚形成培養基中。本發明中用於人工皮膚製造的基礎培養基，可以使用以前用於人工皮膚製造的任意培養基，作為這些培養基可以例舉出，含10%胎牛血清的Dulbecco改良的fegle培養基 (DMEM培養基)；含10%胎牛血清、轉鐵蛋白5 48/1111、胰島素5 48/1111、三碘甲狀腺原氨酸 2nM、霍亂毒素0. InM、氫化可的松0. 4 μ g/ml的DMEM-Ham' sF12(3 1)培養基；角質形成細胞生長培養基(KGM)和含10%胎牛血清的DMEM培養基的1 1混合培養基等。在這些培養基中添加的上述提取物，依據種類各有不同，但大約為0. 001質量質量％的程度。 除該提取物以外，抗皺劑的形態中使用的各種物質也可以一同添加進去，特別是上述的絲氨酸蛋白酶抑制劑，為了抑制膠原蛋白的分解、穩定基底膜，被認為是優選的物質。在本發明的人工皮膚製造中，首先將含有人成纖維細胞的收縮I型膠原蛋白放置在金屬網上。含有人成纖維細胞的收縮I型膠原蛋白可以按如下進行調製。在冰上製備好成纖維細胞的膠原蛋白懸液後，皮氏培養皿上使膠原蛋白凝膠化而進行製備。然後，從皮氏培養皿上將膠原蛋白寧膠剝離，將膠原蛋白放入二氧化碳孵箱使其收縮。接下來，在上述的膠原蛋白凝膠上培養表皮細胞，例如人正常表皮的表皮形成細胞，形成表皮。通過培養皮膚細胞來形成表皮可如下進行。將收縮的膠原蛋白凝膠放置在金屬網上，接著將玻璃環狀物放置在該凝膠上。在該玻璃環內加入人包皮來源的表皮形成細胞懸液並使液體不外漏。在二氧化碳孵箱中使表皮形成細胞附著，移走玻璃環。表皮層長滿上述培養基表面後，將表皮層暴露於空氣中，繼續進行培養，以形成角質層。按照這種方法可以獲得，在含有成纖維細胞的收縮I型膠原蛋白凝膠構成的真皮層和表皮層之間有充足沉澱了基底膜成分的，與自然皮膚接近的人工皮膚。本發明使用的上述提取物不僅是在表皮細胞接種後的幾天時間內，在交換培養基時被加入到新鮮培養基中，而且並不只限定於這個時期，可以根據需要適量添加。減輕自皮紋的方法禾口皮膚杉膚彈力的改！!方法在另一方式中，本發明提供美容方法，其特徵是，通過在皮膚上使用西洋菜、杜松、 白朮和款冬提取物中的至少任意一種，來減輕皺紋，改善皮膚鬆弛和皮膚彈力。而且該方法不僅可以減輕皺紋，改善皮膚鬆弛與皮膚彈力，還可以用於上述的細胞外基質的生成促進， 進一步用於需要基底膜以及真皮穩定的各種皮膚症狀，例如在表皮水皰病的改善中使用。 在該方法中，上述提取物所應用的對象通常是哺乳動物，特別是適用於人類。實施例以下，列舉實施例來更詳細地說明本發明。[實驗方法-1]關於層粘連蛋白-5生成促進效果的試驗方法(1)表皮角質細胞的培養表皮角質細胞由人包皮分離而來，並在低濃度鈣的表皮細胞生長培養基(KGM)中培養。向該培養基中加入牛腦下垂體提取液和EGF。細胞在KGM中繼代培養4代後，經胰蛋白酶-EDTA處理後懸浮附著細胞，過濾去除細胞團塊，獲得均一的細胞懸液。離心分離收集細胞，按照8 X 104/ml的密度再懸浮在DMEM-F12 (2 1) -0. 1 % BSA培養基中。將0. 5ml該細胞懸液，加入到含有2倍藥物濃度的相同培養基0. 5ml中。培養使用M孔細胞培養板， 37°C進行M小時培養。培養結束後，將上清液移入EppendrofT管中，lOOOOrpm、5分鐘離心分離，將上清液轉移至一支新管中，直到層粘連蛋白-5的測定日都保存在-20°C。此外，為溶解出細胞內部和培養塑料容器上結合的層粘連蛋白_5，向各孔中加入含有各種表面活性劑的Tris鹽酸緩衝液(PH7.4)，-20°C過夜保存。第二天，進行超聲波處理，再度冷凍。次日，再溶解後，10000rpm、5分鐘離心分離，將上清液轉移至管中，直到層粘連蛋白-5的測定日都保存在-20°C。(2)層粘連蛋白-5的夾心ELISA法測定採用夾心ELISA法測定培養上清、細胞層中存在的層粘連蛋白_5。96孔ELISA板的固相表面包被上抗層粘連蛋白-5的層粘連蛋白^3鏈的單克隆抗體811165。為使用夾心法測定層粘連蛋白_5，將另外一種抗體，即抗層粘連蛋白日3鏈的單克隆抗體6 12預先進行生物素標記(b-6FU)。本方法，僅能測定具有功能的異源三聚體(α 3 β 3 γ幻，不能檢測異源二聚體(β3γ2)。在預先加有含b-6F12的3%明膠磷酸緩衝液的各孔中加入樣品。 孔內樣品的最終稀釋率為，培養液1/4，細胞層1/10。抗原抗體在37°C反應2小時，衝洗培養板後添加生物素HRP (辣根過氧化物酶)溶液，進一步反應30分鐘到1小時。衝洗後，加入HRP底物ABTS溶液，用ELISA板讀數儀讀取405nm吸光度。在0 40ng/ml濃度範圍內製作標準曲線。層粘連蛋白-5的生成量按照培養基中的游離量和細胞層的殘留量的總和進行計算，用相對未添加植物提取物的樣品(對照)的相對比值進行表示。如表1所示，給出了各提取物的層粘連蛋白-5生成量的增長率。表 1(結果-1)
樣品浪度(%)相對無添加對照的層粘連蛋白西洋菜(日本產)0.0011250.011350.0011170.01120白朮0.0011150.01129款冬(日本產)0.0011070.01110[實驗方法-2]關於IV型膠原蛋白、VII型膠原蛋白生成促進效果的試驗方法
(1)人成纖維細胞的培養將在含10% FBS的DMEM培養基中培養的人成纖維細胞播種於M孔板，細胞附著後，用含有0. 25% FBS和250 μ M抗壞血酸葡萄糖苷的DMEM培養基進行培養基交換，加入測試藥物。培養一天後，回收上清，離心分離，測定所得上清中的IV型、VII型膠原蛋白，並測定細胞的DNA量，作為細胞數目的指標。O) DNA 的定量DNA量的測定採用Hoechst公司的Η33342進行螢光測定法的測定。(3)用夾心ELISA法測定IV型、VII型膠原蛋白IV型、VII型膠原蛋白用夾心ELISA法進行測定。本實施例中使用的抗體如下所
7J\ ο· IV型膠原蛋白特異性抗體；單克隆抗體JK-199和多克隆抗體M0_S_CLIV· VII型膠原蛋白特異性抗體；單克隆抗體NP-185和單克隆抗體NP-32將單位未添加測試藥物的樣品(對照)DNA的IV型、VII型膠原蛋白量為100時， 單位測試藥物樣品DNA的IV型、VII型膠原蛋白量作為IV型、VII型膠原蛋白量生成促進率。如表2所示，給出了對應的膠原蛋白生成促進率。表2(結果-2)
權利要求
1.含有來源於西洋菜以及款冬提取物中的至少任意一種作為有效成分的組合物用於製備基底膜穩定劑的用途。
2.含有來源於西洋菜以及款冬提取物中的至少任意一種作為有效成分的組合物用於製備細胞外基質生成促進劑的用途。
3.如權利要求2所述的組合物用於製備細胞外基質生成促進劑的用途，其特徵在於， 生成促進的細胞外基質的構成成分為選自層粘連蛋-5，III型膠原蛋白，IV型膠原蛋白以及VII型膠原蛋白組成的組中的一種或二種以上。
4.如權利要求2或3所述的組合物用於製備細胞外基質生成促進劑的用途，其特徵在於，生成促進所有的層粘連蛋白-5，III型膠原蛋白，IV型膠原蛋白以及VII型膠原蛋白。
5.含有來源於西洋菜以及款冬的提取物中的至少任意一種作為有效成分的組合物用於製備皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑的用途。
全文摘要
本發明提供含有西洋菜以及款冬的提取物中的至少任意一種作為有效成分的組合物用於製備細胞外基質生成促進劑、細胞外基質生成促進劑、皮膚鬆弛和皮膚彈力改善劑的用途。
文檔編號A61Q19/08GK102302424SQ20111025676
公開日2012年1月4日 申請日期2006年4月12日 優先權日2005年4月13日
發明者小倉有紀, 海鹽健一, 豬股慎二, 高田惠子 申請人:株式會社資生堂