一種用於天然蛋白分子分離鑑定的梯度電泳方法
2023-10-24 20:30:07 2
一種用於天然蛋白分子分離鑑定的梯度電泳方法
【專利摘要】一種用於天然蛋白分子分離鑑定的梯度電泳方法，包括配置梯度膠、製備凝膠板、上樣、電泳、凝膠經染色、脫色及成像等步驟，本發明建立的Native-Gradient-PAGE蛋白電泳法，具有如下優點：所需試劑都是常規試劑，且使用常規SDS-PAGE電泳儀器就可以進行操作；電泳分離效果明顯，靈敏度高，電泳結束後，不同蛋白分子因泳動速率不同，顆粒尺寸大小不一，則處於不同的泳道位置；通過此蛋白電泳，易於將天然蛋白各組分分離。
【專利說明】—種用於天然蛋白分子分離鑑定的梯度電泳方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種通過電泳分離天然蛋白中不同分子量相差較小的方法。
【背景技術】
[0002]天然蛋白質是生物體內一種極重要的高分子有機物，主要有胺基酸組成，因胺基酸的組合排列不同，導致蛋白質種類繁多，性質、功能各異。因此，對不同功能特性的蛋白質進行分離鑑定，可以有選擇的加以利用，這在醫學、食品行業中的應用開發研究中具有深遠的意義。
[0003]現有的天然蛋白分離的方法有色譜技術和電泳技術。色譜技術主要有離子交換色譜、分子排阻色譜、反相色譜、疏水作用色譜等方法，色譜技術主要根據蛋白分子的理化特性來實現分離效果的。電泳技術是Native-PAGE和非還原性Native-PAGE。電泳技術中，由於分離蛋白分子有不同的形狀、尺寸及所帶電荷，根據它們的電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，在保持天然狀態條件下達到分離的目的。但是，這些方法只對於被分離蛋白質分子的等電點、分子量大小差異較大的靈敏度高，而對於等電點、分子量大小相近等複雜的蛋白樣品的分離不適合，解析度不高。另外，這些方法都有成本高、耗時長、汙染環境等缺點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提出一種用於天然蛋白分子分離鑑定的梯度電泳方法。
[0005]本發明是通過以 下步驟來實現。
[0006]( I)配置梯度膠、堆積膠及緩衝液。
[0007]a) 8^15%梯度膠溶液:40%的儲液，其中丙烯醯胺中丙烯醯胺(Acr):N, N-甲叉雙丙烯醯胺(Bis)= 29:1，1.5M的pH=8.8的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸以及10%的過硫酸銨(AP)、超純水、四甲基乙二胺(TEMED)。
[0008]b)堆積膠溶液:40%的儲液，其中丙烯醯胺中丙烯醯胺(Acr):N, N-甲叉雙丙烯醯胺(Bis) =29:1,0.5M的pH=6.8的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸(HCl)以及10%的過硫酸銨(AP)、超純水、四甲基乙二胺(TEMED)。
[0009]c)上樣緩衝液:0.5M的pH=6.8的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸、0.5%的3，3，，5，5，-四溴苯酚磺醯酞(BPB)、丙三醇、超純水。
[0010]d)電極緩衝液:0.025M三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.192M的甘氨酸(Gly)。
[0011](2)上樣:採用凝膠電泳系統，凝膠板長度為74mm。樣品與等體積2X的上樣緩衝液混合均勻，離心lmin。取10 μ I加入上樣孔中。
[0012](3)電泳:電泳條件堆積膠為電壓60 V，時間30分鐘；梯度膠為電壓80V，時間120分鐘；電泳時採用常規方法冷卻，電泳溫度控制在15°C以下。
[0013](4)混合物中不同組分蛋白質分離的判定:電泳後凝膠經染色，脫色後成像，分析蛋白分離情況。經參考純蛋白的對照，根據每個泳道裡的分離的條帶，分別判定混合物中不同組分的蛋白，也可通過Quality One軟體定量出不同組分蛋白的純度。
[0014]本發明建立了 一種天然蛋白分離鑑定的電泳方法，即Native-Gradient-PAGE蛋白電泳法，實現相近的分子量和等電點的天然蛋白分子的分離，在Native-PAGE中不能很好的分離蛋白混合物，利用本發明可以高解析度的分離各種組分。
[0015]本發明所述的Native-Gradient-PAGE蛋白電泳法是基於Native-PAGE電泳，但是，Native-PAGE電泳只有一種濃度的分離膠，而Native-Gradient-PAGE是配製不同濃度梯度的分離膠，因此在凝膠中可以形成不同尺寸大小的網狀結構，根據分離蛋白本身的尺寸、形狀及所帶電荷量達到高解析度的分離效果。
[0016]本發明使用常規的蛋白電泳系統，凝膠中不含有巰基乙醇，確保混合物各蛋白組分的天然狀態；另外，整個電泳都不能加SDS，因為SDS帶大量的負電荷，會影響天然蛋白帶電荷量；並通過控制蛋白泳動速率、電泳的時間及電壓等因素，將蛋白混合物的各種天然蛋白分子進行分離。
[0017]本發明建立的Native-Gradient-PAGE蛋白電泳法,具有如下優點:所需試劑都是常規試劑，且使用常規SDS-PAGE電泳儀器就可以進行操作；電泳分離效果明顯，靈敏度高，電泳結束後，不同蛋白分子因泳動速率不同，顆粒尺寸大小不一，則處於不同的泳道位置；通過此蛋白電泳，還可以分析出天然蛋白各組分的純度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]附圖1為本發明Native-Gradient-PAGE電泳分析β _乳球蛋白中的兩個亞型β -1g-A和β _lg_B。泳道1:標準蛋白β -1g-A,泳道2:標準蛋白β -1g-B,泳道3: β -乳球蛋白混合樣，每孔上樣量均為1.5μ g。
[0019]附圖2為本發明Native-Gradient-PAGE電泳分析牛乳酪蛋白中主要兩種蛋白形態a S-酪蛋白(a s-casein)、β -酪蛋白(β -casein)。泳道I ;Marker標準蛋白，泳道2 ；酪蛋白全蛋白，泳道3 ;酪蛋白全蛋白，每孔上樣量均為15 μ g。
【具體實施方式】
[0020]本發明通過以下實施例作進一步說明，但本發明並不受其限制。
[0021]實施例1。
[0022]β -乳球蛋白A ( β -1g-A)和β -乳球蛋白B ( β -1g-B)的分離。
[0023]採用Native-Gradient-PAGE蛋白電泳分離β_乳球蛋白突變體A ( β _lg_A)和β-乳球蛋白突變體B ( β-1g-B), β-1g-A的分子量約為18.3KDa，等電點(pi)為5.26，β-1g-B的分子量約為18.2 KDa，等電點(pi)為5.34。由於在電泳體系裡，β-lg-A所帶負電荷量多，泳動速率大，則β _ Ig-A是下面的一條帶,上面的一條帶則是β-1g-B。利用Quality One軟體分析其不同突變體的純度為β-1g-A為62.5%，β-1g-B為37.5%。
[0024]具體實施過程包括如下步驟。
[0025]1、配置凝膠及緩衝液。
[0026]8?15%梯度膠溶液中，含有40%的丙烯醯胺(Acr:Bis = 29:1),1.5M的Tris-鹽酸(pH8.8)以及10%AP、超純水、純TEMED ;堆積膠溶液中含40%的丙烯醯胺(Acr:Bis =29:1)，0.5M 的 Tris-鹽酸(pH6.8)、10%AP、超純水及純 TEMED。
[0027]蛋白溶液與上樣緩衝液等體積混合，上樣緩衝液中含0.5M的Tris-鹽酸(pH6.8)、
0.5%的BPB、丙三醇、超純水。
[0028]電極緩衝液中含0.025M Tris、0.192M甘氨酸。
[0029]2、上樣及電泳:採用 Electrophoresis Power Supply (EPS 601)凝膠電泳系統，凝膠板厚度為74_。樣品與等體積2X的樣品緩衝液混合後離心lmin，加入上樣孔中。電泳條件分兩步設置，第一步電壓60 V，時間0.5h ;第二步電壓80V，時間2h。總計電泳時間2.5h。電泳時配備循環冷卻水，將電泳溫度控制在15°C以下。
[0030]3、蛋白質的分離及純度分析。
[0031]電泳結束後,將凝膠放在培養皿中,加入染色液,搖床振蕩染色15min，然後用脫色液脫色至蛋白質區條帶清晰為止。最後將凝膠置於凝膠成像系統中成像，根據電泳圖分析電泳結果。通過Quality One軟體定量出兩個亞型的純度。
泳道1-3的電泳圖片如附圖所不。由圖中可以看出，β-1g-A和β-1g-B泳動速率不同，β -1g-A比β -1g-B的泳動速率快,泳道3清晰地出現兩個條帶。根據β -乳球蛋白的A和B兩個異構體標準品的停留的位置，可說明該方法可有效分離出天然蛋白樣品中兩個異構體。
[0032]實施例2。
[0033]牛乳酪蛋白(casein)的分離。
[0034]牛乳中酪蛋白(casein)不是單一的蛋白質，有許多類型蛋白構成，但目前主要分為as-、β-、κ-三種類型，每類又有多種遺傳變異體。其中as-、β-含量最大，a S-中a Sl-，a S2-兩種酪蛋白形態屬於鈣敏感蛋白，易形成聚合物，一般情況分子量範圍是29-33KDa ； β -酪蛋白(β -casein)成分性質相對穩定,低溫下，常以單體存在，分子量24.0KDa0故如圖中所示，A圖SDS-PAGE中泳道I是標準蛋白Marker，依據分子量的範圍，可判定泳道2兩條純度高的蛋白分別是a s-casein、β-casein ;參照A圖，在B圖Na'ive-Gradient-PAGE泳道3中可清楚地看到a s-casein、β -casein在梯度分離膠中停留位置相距很遠，因此也就可以清晰地辨別α s-casein、β -casein,。因此，通過該方法可以高解析度地鑑定a s-casein、β-casein。
[0035]具體實施過程包括如下步驟。
[0036]1、配置凝膠及緩衝液。
[0037]8?15%梯度膠溶液中，含有40%的丙烯醯胺(Acr:Bis = 29:1),1.5M的Tris-鹽酸(PH8.8)以及10%過硫酸銨、超純水、純TEMED ;堆積膠溶液中含40%的丙烯醯胺(Acr:Bis =29:1),0.5M的Tris-鹽酸(pH6.8)、10%過硫酸銨、超純水及純TEMED。
[0038]蛋白溶液與上樣緩衝液等體積混合，上樣緩衝液中含0.5M的Tris-鹽酸(pH6.8)、
0.5%的BPB、丙三醇、超純水。
[0039]電極緩衝液中含0.025M Tris、0.192M甘氨酸。
[0040]2、上樣及電泳:採用 Electrophoresis Power Supply (EPS 601)凝膠電泳系統，凝膠板厚度為74_。樣品與等體積2X的樣品緩衝液混合後離心lmin，加入上樣孔中。電泳條件分兩步設置，第一步電壓60 V，時間0.5h ;第二步電壓80V，時間2h。總計電泳時間2.5h。電泳時配備循環冷卻水，將電泳溫度控制在15°C以下。[0041]3、蛋白質的分離
電泳結束後,將凝膠放在培養皿中,加入染色液,搖床振蕩染色15min，然後用脫色液脫色至蛋白質區條帶清晰為止。最後將凝膠置於凝膠成像系統中成像，根據電泳圖分析電泳結果。
【權利要求】
1.一種用於天然蛋白分子分離鑑定的梯度電泳方法，其特徵是按以下步驟: (1)配置梯度膠、堆積膠及緩衝液: a)8?15%梯度膠溶液:40%的儲液，其中丙烯醯胺中丙烯醯胺:N，N-甲叉雙丙烯醯胺=.29:1，1.5M的pH=8.8的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸以及10%的過硫酸銨、超純水、四甲基乙二胺； b)堆積膠溶液:40%的儲液，其中丙烯醯胺中丙烯醯胺:N，N-甲叉雙丙烯醯胺=29:1，.0.5M的pH=6.8的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸以及10%的過硫酸銨、超純水、四甲基乙二胺； c)上樣緩衝液:0.5M的pH=6.8的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、0.5%的3，3』，5，5』 -四溴苯酚磺醯酞、丙三醇、超純水； d)電極緩衝液:0.025M三羥甲基氨基甲烷、0.192M的甘氨酸； (2)上樣:採用凝膠電泳系統，凝膠板長度為74mm;樣品與等體積2X的上樣緩衝液混合均勻，離心Imin ;取10μ I加入上樣孔中； (3)電泳:電泳條件堆積膠為電壓60V，時間30分鐘；梯度膠為電壓80V，時間120分鐘；電泳時採用常規方法冷卻，電泳溫度控制在15°C以下； (4)混合物中不同組分蛋白質分離的判定:電泳後凝膠經染色，脫色後成像，分析蛋白分離情況；經參考純蛋白的對照，根據每個泳道裡的分離的條帶，分別判定混合物中不同組分的蛋白，並通過Quality One軟體定量出不同組分蛋白的純度。
【文檔編號】G01N27/447GK103675072SQ201310613929
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】李欣, 陳紅兵, 周建文, 高金燕, 謝秀玲, 吳志華, 楊安樹, 佟平 申請人:南昌大學