一種應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照及製備方法
2023-10-25 04:22:17 4
一種應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照及製備方法
【專利摘要】一種應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照，於生物晶片上依次為：1)FLAG包被抗體；2)HA-FLAG多肽；3)HA生物素標記抗體。本發明還公開了製備上述陽性參照的方法。本發明能表徵從抗原與抗體反應到顯色整個實驗成功與否，並做為參比物質對血清中的目標物進行定量分析，解決了以往方法存在的可靠性差及無法標準化的缺陷。
【專利說明】一種應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照及製備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照。
[0002]本發明還涉及製備上述陽性參照物的方法。
【背景技術】
[0003]蛋白晶片的技術原理最早由Roger Ekin在上世紀80年代就已提出，它將大量蛋白質分子按預先設置的排列固定於一種載體表面形成微陣列，根據蛋白質分子間特異性結合的原理，構建微流體生物化學分析系統，以實現對生物分子準確、快速、大信息量的檢測。蛋白晶片技術主要用於基於晶片的蛋白質組學研究，其特點是高通量，即在一個只有幾十平方毫米的片基上標記成千上萬種蛋白質用於檢測其他目的蛋白。其基本原理就是利用抗體分子能與抗原分子特異性結合的特點，將游離的雜蛋白和結合於固相載體的目的蛋白分離，並利用特殊的標記物對其進行定量分析。蛋白晶片有著廣泛的應用範圍，包括，藥物篩選，疾病診斷治療、司法鑑定等領域。
[0004]現有的生物晶片檢測方法包括發光檢測方法和非發光檢測方法兩類，最廣泛應用的還是發光檢測方法，其中又主要包括螢光檢測法、化學發光檢測法和複合光照射檢測法。而近年發展起來的化學發光檢測法因其快速、精確、重現性好及試劑安全無毒的特點，顯示出很好的應用前景。用化學發光檢測法對目標物進行檢測時，為了降低背景值以及實驗體系對目標檢測物定量的影響，一般要設置一個參照點，將測得的目標物的發光值與參照點的發光值相比得到相對值。
[0005]目前蛋白晶片參照點通常是將某種(些)特異的蛋白直接進行酶標記或者生物素標記等直接包被於晶片表面。這類參照點的作用是用來指示化學發光反應的正常進行，或者對晶片點樣位置進行確定。這類參照點儘管也曾被用於作為待測物質的參比點。但由於結合不牢固，容易被洗液衝洗掉，影響了對目標物定量的準確性。而且這類參照點只能表徵雜交反應中從生物素與辣根過氧化物酶(HRP)反應到顯色反應，無法表徵抗原-抗體的反應，也影響了對目標物定量的準確性。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照。
[0007]本發明的又一目的是提供一種製備上述陽性參照物的方法
[0008]為實現上述目，本發明提供的應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照，於生物晶片上依次為:
[0009]I) FLAG 包被抗體；
[0010]2) HA-FLAG 多肽；
[0011]3)HA生物素標記抗體。
[0012]本發明提供的製備上陽性參照的方法:
[0013]a)將FLAG包被抗體固定於生物晶片上；
[0014]b)在生物晶片上加入含有多肽的樣品和各個濃度梯度的標準抗原；
[0015]c)除去抗原物質，除去非特異性結合的物質；
[0016]d)加入生物標記抗體；
[0017]e)除去多餘的抗體。
[0018]其中，FLAG包被抗體以矩陣形式固定於生物晶片上。
[0019]其中，為FLAG包被抗體為AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗體。
[0020]其中，HA-FLAG多肽的基礎序列為:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
[0021]本發明的陽性參照可以監控蛋白晶片免疫反應的每個階段，與樣本檢測同步，有效的降低了人為操作或儀器誤差給蛋白晶片檢測帶來的誤差。
【具體實施方式】
[0022]本發明提供的應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照，是利用抗體分子能與抗原分子特異性結合的特點，在樣品中(特別是血清)混入一種人工合成的多肽，將多肽與抗體物質結合的發光值作為參照，用測得的目標物發光值與其比較，得到相對值，以此進行樣品中目標物的定量分析。
[0023]本發明的的陽性參照包括以下幾個部分:
[0024]I) FLAG 包被抗體；
[0025]2) HA-FLAG 多肽，其基礎序列為:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK
[0026]3) HA生物素標記抗體
[0027]由以上三種組成一個「三明治」的複合物。
[0028]本發明舉實施例來進一步說明本發明，但本發明保護範圍不限於下述實施例。
[0029]1、檢測血清中腫瘤標誌物AFP、CEA、t-PSA的濃度
[0030]a)將AFP、CEA、t_PSA包被抗體以及Flag包被抗體用點樣儀以矩陣形式固定於生物晶片上；
[0031]b)在封閉好的晶片上加入含有人工合成多肽的血清樣品和各個濃度梯度的標準抗原，反應1-1.5小時；
[0032]c)除去抗原物質，用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1 % BSA/0.05%吐溫)除去非特異性結合的物質；
[0033]d)加入生物標記的AFP、CEA、t-PSA抗體以及HA抗體，反應25_40min ；
[0034]e)用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1% BSA/0.05%吐溫)除去多餘的抗體；
[0035]f)加入 HRP (1/10000)，反應 30min ；
[0036]g)用洗液(1XTBS/1%甘油/0.1% BSA/0.05%吐溫)除去多餘的HRP ；
[0037]h)加入發光液，顯色；
[0038]i)收集AFP、CEA、t-PSA發光值以及陽性參照點發光值；
[0039]j)將AFP、CEA、t-PSA發光值除以陽性參照發光值，得到CEA的相對值；
[0040]k)將AFP、CEA、t_PSA各個濃度標準抗原的相對發光值與理論濃度做成標準曲線，然後將血清中AFP、CEA、t-PSA的相對值帶入血清中，得到中AFP、CEA、t_PSA在血清中的濃度。
[0041]本發明的特點在於，經過Blast比對後，沒有發現人體蛋白質組中有與其同源的蛋白，不易被血清中的酶類降解，由人工合成純化後純度能達到95%以上，價格較低，能夠表徵從抗原與抗體反應到顯色整個實驗成功與否，並做為參照點對血清中的目標物進行定量分析，解決了以往方法存在的可靠性差及無法標準化的缺陷，以實現免疫雜交技術在體外診斷中的成功應用。
[0042]通過表1和表2的對比數據可以看出，以HA-FLAG為參照點所測得的數據從準確性和重複性兩方面都要優於C-myc帶有生物素的蛋白，說明以HA-FLAG為參照點監控整個免疫雜交過程，這樣的參照點所測出的數據穩定性較好，準確性較高。
【權利要求】
1.一種應用於蛋白晶片定量檢測的陽性參照，於生物晶片上依次為: DFLAG包被抗體；
2)HA-FLAG 多肽； 3)HA生物素標記抗體。
2.根據權利要求1所述的陽性參照，其中，FLAG包被抗體以矩陣形式固定於生物晶片上。
3.根據權利要求1或2所述的陽性參照，其中，為FLAG包被抗體為AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗體。
4.根據權利要求1所述的陽性參照，其中，HA-FLAG多肽的基礎序列為:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
5.製備權利要求1所述陽性參照的方法: a)將FLAG包被抗體固定於生物晶片上； b)在生物晶片上加入含有多肽的樣品和各個濃度梯度的標準抗原； c)除去抗原物質，除去非特異性結合的物質； d)加入生物標記抗體； e)除去多餘的抗體。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，FLAG包被抗體以矩陣形式固定於生物晶片上。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其中，為FLAG包被抗體為AFP、CEA、t-PSA以及Flag包被抗體。
8.根據權利要求5所述的方法，其中，HA-FLAG多肽的基礎序列為:YPYDVPDYA-C-C-C-C-C-C-DYKDDDDK。
【文檔編號】G01N33/68GK104198738SQ201410471782
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】丁立功, 馬君蘭, 臧百盛, 宮曉豔 申請人:北京九州泰康生物科技有限責任公司