純化凝固蛋白的手段和實施其的方法
2023-10-24 06:48:57
專利名稱：純化凝固蛋白的手段和實施其的方法
技術領域：
本發明涉及純化可用作藥物的活性成分的凝固蛋白的領域。 現有技術凝固蛋白構成藥物的有效成分已有很長時間。在用作藥物活性成分的凝固蛋白中，可特別提到因子VII、因子VIII、凝血酶或血管性血友病因子(von Willebrand factor)0直到最近，只能通過從人血漿中純化得到凝固蛋白。在過去幾年中，以重組蛋白的方式已得到一些凝固蛋白，這些重組蛋白在轉基因哺乳動物的體液中，例如在轉基因哺乳動物的奶中產生。在所有情況下，包含凝固蛋白的待純化的起始材料由具有複雜構成的材料組成， 其中目的蛋白和非常大量的物質共同存在，這些物質包括蛋白質、脂類、碳水化合物、胺基酸、礦物鹽、細胞碎片和代謝廢物例如尿素、尿酸或膽紅素。因此，考慮到供人使用的藥物營銷所需要的健康和管理特性，開發純化凝固蛋白的方法是一項複雜的任務。可以理解，在計劃用於預防或治療凝血疾病的藥物中，用作活性成分的凝固蛋白應當以高度純化的形式存在，並且不與能夠對有機體產生不利的不理想的物質包括其他凝固蛋白、白蛋白、免疫球蛋白或上述蛋白質的降解產物相關聯。純化多種凝固蛋白的方法是已知的，包括純化因子VIII、抗-凝血酶-III、纖溶酶原、因子VII或血管性血友病因子。所有已知方法包括一連串基於蛋白質沉澱的步驟、通過層析基質的步驟、接著是連續洗脫步驟、深層過濾步驟、超濾步驟或濃縮步驟的選擇-分離步驟。值得一提的是，開發純化凝固蛋白的方法需要長時間的研究和對連續中間產物的一致性的多次控制，以保證將得到的終產物具有高純度，為非修飾的形式，並且基本上不含不理想的物質，無論這些方法完全是新的，或這些方法是已知方法的改良，甚至是微小的改良。特別地，對具有酶活性的凝固蛋白，例如因子VII、VIII和XI，純化的最終蛋白質必須是非激活的。然而，在純化步驟的任一步中凝固蛋白傾向於被激活，包括在層析步驟中，如果沒有堅持預設的設定狀態(例如濾器或使用的層析基質的質量、鹽濃度或溫度)的話。上面提及的至少部分解釋了為什麼已知方法不包括基於下述原理的親和層析步驟，即目的凝固蛋白在嫁接在層析底物上的配體上的特異性固定，然後在層析洗脫液中回收純化的蛋白質。在純化治療目的的蛋白質的方法中缺乏親和層析純化步驟也可通過此技術的缺點解釋，其中觀察到嫁接在親和基質上的配體分子的部分脫離，發現所述配體分子和純化的治療蛋白質在洗脫液體積中相結合。可以理解在用於治療凝血障礙的藥物中存在可能對有機體不利的層析基質的組成物質是被醫學條例所禁止的。儘管純化凝固蛋白的已知方法是符合要求的，在現有技術中需要替代方法或與先有方法相比改進的方法。發明概述本發明涉及用於選擇性結合凝固蛋白的親和基質，其包含在其上固定了特異性結合所述凝固蛋白的核酸適配子(nucleic aptamer)的固體基質材料。在一些實施方案中，所述核酸適配子由脫氧核糖核酸適配子組成。另外本發明的一個主題是在基質上固定凝固蛋白的方法，其包括下述步驟，即使包含所述凝固蛋白的樣品與親和基質接觸。本發明也涉及純化凝固蛋白的方法，其包括以下步驟a)使包含凝固蛋白的樣品與如上定義的親和基質接觸，以在(i)在所述親和基質上固定的核酸適配子和(ii)所述凝固蛋白之間形成複合物，和b)從在步驟a)中形成的複合物中釋放所述蛋白，和c)回收純化形式的所述凝固蛋白。本發明也涉及重組人凝固蛋白的純化組合物，其包含至少99. 9%以重量計的所述重組人蛋白質，並且其基本上不含非人蛋白質。附圖簡述
圖1顯示了在使用固定了抗-人FVII核酸適配子的親和基質純化兔奶中產生的重組人因子VII的方法的實施中得到的層析譜。沿χ-軸時間；沿y_軸在254nm處的吸光度值(OD)。圖2表示隨時間變化的在^Onm處的吸光度測量值曲線。圖3是SDS PAGE電泳凝膠圖，其上具有能夠相對定量條帶的考馬斯亮藍染色。在圖3中凝膠從左至右的泳道表示以下初始產物的遷移結果，圖從左至右為-泳道『『2」或『iMD"初始組合物Betafact ,
-泳道『『3」或『『NR」對應圖2的層析譜的1號峰的非留存部分，
-泳道『『4」 或『 1」對應圖2的層析譜的2號峰的洗脫部分。 圖4表示隨時間變化的在^Onm處的吸光度測量值曲線。 圖5是SDS PAGE電泳凝膠圖。在圖5中凝膠從左至右的泳道表示以下初始產物
的遷移結果-泳道「E5」通過MEP HyperCel層析步驟純化的包含轉基因人因子IX的轉基因母豬奶的初始組合物，-泳道『 6」對應圖4的層析譜的1號峰的非留存部分，-泳道「E7」對應圖4的層析譜的2號峰的洗脫部分，-泳道『 8」對應圖4的層析譜的3號峰的再生部分，-泳道「TFIX」 純化的人血漿因子IX對照。 圖6表示隨時間變化的在^Onm處的吸光度測量值曲線。在圖6中，1號峰對應未在柱中留存的初始產物的部分。2號峰對應洗脫部分。圖7表示初始產物和洗脫產物的凝膠圖，通過SDS PAGE分析和硝酸銀染色以顯現雜質的消除1號泳道對應初始產物，2號泳道對應洗脫部分。儘管初始產物具有相當高的純度，值得一提的是洗脫部分不再包含任何汙染物或降解的形式。圖8表示Mapt2固定適配子與轉基因兔奶中產生的重組人因子VII的結合曲線。箭頭對應不同注射的時間，在圖8上從左至右分別為1 重組因子VII的注射；2 包含IM NaCl的緩衝液的注射；3 包含2M NaCl的緩衝液的注射；4 包含3M NaCl的緩衝液的注射； 5 包含IOmM EDTA的50mM Tris緩衝液的注射。沿χ-軸時間，以秒表示；沿y_軸響應信號的值，以任意單位(RU)表示。圖9表示Mapt2固定適配子與轉基因兔奶中產生的重組人因子VII的結合曲線。 箭頭對應不同注射的時間，在圖9上從左至右分別為1 :50%丙二醇；2 =IOmM的EDTA。發明詳述在長時間的研究後，申請者開發了純化凝固蛋白的方法，其包括層析步驟，其中目的蛋白與預固定在層析基質上的配體特異性結合，並然後釋放留存在所述基質上的目的蛋白質，回收洗脫液中的純化蛋白質。更具體地，根據本發明，提供了用於純化凝固蛋白的方法，其包括目的凝固蛋白與上面固定了特異性結合所述目的蛋白質的核酸適配子的基質結合的步驟，和其後的回收所述純化的目的蛋白質的步驟。令人驚訝地，根據本發明已顯示在其上固定了特異性針對目的凝固蛋白的核酸適配子(即以包含這樣的核酸適配子的固定化合物的形式)的親和層析基質可成功地用於得到可用作藥物活性成分的凝固蛋白的方法。本發明涉及選擇性結合凝固蛋白的親和基質，其包含在其上固定了特異性結合所述凝固蛋白的核酸適配子(即以包含這樣的核酸適配子的固定化合物的形式)的固體基質材料。特異性結合目的凝固蛋白的核酸適配子分子以及包含這些核酸適配子的化合物構成了所述固體基質材料攜帶的特異性結合所述靶蛋白質的位點。術語「核酸適配子」包含具有5-120個核苷酸長度的單鏈核酸，且其特異性結合凝固蛋白。措辭「包含核酸適配子的化合物」也包含下述化合物，其在結構中包含上面定義的所述核酸。因此，包含特異性結合人或哺乳動物凝固蛋白的脫氧核糖核酸的化合物包含下述化合物，其中所述核酸被包含在含有生物素分子的結構中。根據本發明已顯示如上定義的親和基質能夠有效固定目的凝固蛋白，其在本說明書中也可被稱為「靶蛋白質」。如上定義的親和基質具有吸附靶蛋白質的高容量，因為使固體基質接觸包含待純化的凝固蛋白的液體溶液使固體基質攜帶的靶位點飽和至少50%成為可能。根據本發明也已顯示，與核酸適配子分子特異性結合的凝固蛋白可隨後以至少 75%的良好產量從親和基質上被洗脫。此外，已顯示本發明的親和基質對目的凝固蛋白具有高特異性，因為發現所述凝固蛋白可具有相對洗脫液中包含的蛋白質總重量高達以重量計99. 95%的範圍的純度。如在實施例中所說明的，使用包含高純度的靶凝固蛋白(例如相對所述初始產物中包含的蛋白質總重量以重量計超過98% )的組合物作為初始產物，使用根據本發明的親和基質，目的凝固蛋白的純度可進一步得到2個數量級的提高。值得一提的是包括當在初始產物中存在的雜質具有與希望純化的靶凝固蛋白非常接近的結構或物理化學特性時，在純度中也能得到這樣的提高。也已顯示本發明的親和基質使純化基本序列截然不同的凝固蛋白，例如人因子VII和人因子IX成為可能。也已顯示本發明的親和基質使從複雜組合物的初始介質(例如富含人因子IX的血漿組合物和來自人因子IX轉基因動物的奶)中純化凝固蛋白成為可能，且所述親和基質具有與所述目的凝固蛋白結合的高特異性。也已顯示本發明的親和基質使從也包含非人直向同源蛋白質的初始介質中選擇性純化人凝固蛋白成為可能，例如從人因子IX轉基因動物的奶中，所述奶也包含由所述轉基因動物天然產生的因子IX，由所述轉基因動物天然產生的所述因子IX(或內源FIX)可為例如豬FIX。也已顯示本發明的親和基質使從也包含非人直向同源蛋白質的初始介質中選擇性純化人凝固蛋白成為可能，例如從人因子VII轉基因動物的奶中，所述奶也包含由所述轉基因動物天然產生的因子VII，由所述轉基因動物天然產生的所述因子FVII (或內源 FVII)可為例如兔FVII。重要地，已顯示特別是對於從複雜組合物(例如血漿或所述目的凝固蛋白的轉基因哺乳動物的體液)中純化目的凝固蛋白，得到本發明的親和基質的上述高吸附能力、良好產量和高特異性的特徵。也已顯示核酸適配子在固體基質上的固定是不可逆的和長效的，因為在洗脫液溶液中未檢測到從基質上脫離的核酸適配子的存在。特別地，已顯示本發明的親和基質可通過在洗脫後去除保持與基質結合的蛋白質被「再生」非常多次而沒有顯著的下述損傷(i)其對靶凝固蛋白的吸附能力，(ii)其針對所述靶蛋白質的特異性，或(iii)對固定在固體基質材料上的核酸適配子的不進行釋放。 此外，可根據已知技術和使用已知再生試劑，例如尿素實施本發明的親和基質的再生。核酸用作目的凝固蛋白的配體具有許多優勢。由於其寡核苷酸的性質，適配子具有弱免疫原性和對嚴格物理化學條件(尿素、DMS0、極酸或極鹼的pH的存在，使用有機溶劑或高溫)的高抗性，在用作親和配體的情況下，這允許多種用於控制健康安全，特別是有關病毒或非常規病原體的安全的策略。此外，它們具有高度的選擇性。最後，如已經提及的， 適配子的生產涉及相對有限的成本。因此，本發明的親和基質的上述特徵的組合使所述親和基質能夠被用作純化凝固蛋白的手段，因為-所述親和基質使實施純化具有非常高純度的凝固蛋白的方法成為可能。-所述親和基質未被檢測到釋放不理想的物質，特別是未檢測到核酸適配子分子釋放至包含純化的凝固蛋白的洗脫液的溶液中。-核酸適配子分子的可能脫離不導致有關人健康的缺點，-當凝固蛋白具有酶活性時，目的凝固蛋白在親和基質上的結合和然後洗脫不導致所述凝固蛋白以可檢測得到的量的形成激活形式，-生產所述親和基質相對便宜，這特別歸功於核酸適配子生產的低成本，和-所述親和基質用於純化凝固蛋白的使用自身相對便宜，這歸功於所述基質的長壽命，特別因為其再生多次的可能性，和持續長時間。此外，如已經提及的，在從構成複雜的介質中，特別是從工業規模上常規使用的介質，例如人血漿或培養基或包含所述目的蛋白質的生物液中純化的方法中，本發明的親和基質能夠以可逆的方式選擇性結合靶凝固蛋白並具有良好的產量和良好的特異性。此外，如在本說明書中稍後將詳細說明的，本發明的親和基質適於處理大體積的包含目的凝固蛋白的溶液。本發明的親和基質因此構成純化凝固蛋白的工具，其極佳地適於在工業規模上使用。根據本發明的親和基質的其他優勢將稍後在本說明書中詳細說明，或者涉及親和基質自身的描述，或者涉及純化凝固蛋白的方法，其中使用所述親和基質。就申請者所知，本發明首次描述了包含固定化核酸適配子的親和基質，用於在工業規模上使用的條件下純化凝固蛋白。此外，特異性針對凝血酶、針對因子VII和針對因子 IX的多種核酸適配子是現有技術中已知的(見PCT申請號WO 02/26932)。為了本發明的目的，術語「選擇性結合」旨在指通過使親和基質接觸合適組成的溶液(其也可被稱為洗脫溶液)，使目的凝固蛋白與親和基質的固定化核酸成分的特異性非共價結合，所述結合是可逆的，在所述親和基質上所述核酸和所述目的蛋白質之間形成非共價複合物。根據本發明，術語「凝固蛋白」旨在指在導致血凝塊形成的級聯反應鏈中涉及的任意蛋白質。凝固蛋白包含因子I (纖維蛋白原)、因子II (凝血酶原)、因子V(前加速素)、 因子VII (前轉變素)、因子VIII (抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或PTA)、因子XII (Hageman因子)、因子XIII (纖維蛋白穩定因子或FSF)、PK (前激肽釋放酶)、HMWK (高分子量激肽原)、組織促凝血酶原激酶、肝素輔因子II (HCII)、蛋白質C(PC)、凝血調節蛋白(TM)、蛋白質S(PS)、血管性血友病因子 (vffF)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)，或其他組織因子。在一些實施方案中，凝固蛋白由具有酶活性的凝固蛋白組成。具有酶活性的凝固蛋白包括因子II (凝血酶原)、因子VII (前轉變素)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或PTA)、因子 XII (Hageman因子)、因子XIII (纖維蛋白穩定因子或FSF)、PK (前激肽釋放酶)。在一些優選的實施方案中，凝固蛋白由天然或重組人凝固蛋白組成。在優選的實施方案中，凝固蛋白是天然或重組人因子VII。通常，在其上可固定本發明的適配子的固體基質包括具有通常在過濾基質、膜等中可見的結構和組成的任意類型的基質。固體基質特別包括樹脂、親和層析柱樹脂、聚合物珠、磁珠、順磁性珠、過濾膜的基質材料，等等。固體基質也特別包括基於玻璃或金屬的材料，例如鋼、金、銀、鋁、銅、矽、玻璃或陶瓷。固體基質也特別包括聚合物材料，例如聚乙烯、 聚丙烯、聚醯胺、聚偏乙烯及其組合。在一些實施方案中，固體基質上可包被便於和適配子、或和包含所述適配子的化合物連接、結合、形成複合體、固定或相互作用的材料。在一些實施方案中，固體基質是玻璃載片，其表面覆蓋金層，已經過羧甲基化處理的層，葡聚糖層，膠原層，抗生物素蛋白層，鏈黴抗生物素層，等等。這樣，根據本發明的適配子，或根據本發明的包含所述適配子的化合物可通過例如上述附著塗料的方式，被固定在固體基質上，或者通過生成共價鍵的化學反應，或者通過經非共價鍵的連接，例如氫鍵、靜電力、範德華力，等等。實施例描述了根據本發明的親和基質的實施方案，其中核酸適配子通過包含結構中其的化合物經非共價鍵固定在固體基質材料上。在實施例中，特別描述了包含在其表面嫁接鏈黴抗生物素分子的固體基質材料的親和基質，在包含適配子的化合物結構中包含的核酸適配子在其一端與生物素分子偶聯， 並且所述適配子通過基質材料的鏈黴抗生物素分子和包含所述核酸適配子的化合物的生物素分子之間的非共價固定化固定在所述固體基質材料上。在實施例中，描述了包含在其上嫁接鏈黴抗生物素分子的基質材料的親和基質的一個實施方案。這些固體基質材料是容易商業獲得的。措辭「特異性結合凝固蛋白的核酸」或「適配子」或「核酸適配子」旨在指具有結合給定目的凝固蛋白的能力的DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)分子，所述能力比結合任意其他蛋白質的能力更強。在一些實施方案中，根據本發明的親和基質的成分核酸適配子具有結合給定人凝固蛋白的能力，所述能力比結合任意其他的人蛋白質的能力更強。在一些實施方案中，根據本發明的核酸適配子特別具有結合給定人凝固蛋白的能力，所述能力比結合任意其他由非人哺乳動物基因組編碼的同源蛋白質的能力更強。例如， 特異性針對人因子VII的核酸適配子具有結合人因子VII的能力，所述能力比結合來源於非人哺乳動物的因子VII，包括兔因子VII的能力更強。用於本說明書的目的，當通過使用上述結合檢測技術中的任一種和在相同檢測條件下，用第一種核酸得到的結合信號值相比用第二種核酸得到的在統計上顯著更高時，第一種核酸具有比等效質量的第二種核酸更強的結合人因子Vll/VIIa的能力。例如，當使用的結合檢測技術是Biaeore 技術時，當第一種核酸的共振信號值比測量的第二種核酸的共振信號值在統計上顯著更高時(與表示的共振測量單位無關)，第一種核酸具有比等效質量的第二種核酸更強的結合人因子Vll/VIIa的能力。2個「在統計上」有差異的測量值包括彼此具有大於使用的結合檢測技術的測量誤差的差異的2個值。優選地，本發明的親和基質的核酸適配子對靶凝固蛋白具有強親和力。優選地，所述核酸適配子對所述靶凝固蛋白具有小於500nM的Kd值。Kd值可根據Biaeore 技術測量。例如，已顯示包含SEQ ID No 86序列的核酸適配子具有結合人因子Vll/VIIa的能力，所述能力比其結合任意來源於非人哺乳動物的因子Vll/VIIa的能力顯著更強。特別地，儘管SEQ ID No 86序列的核酸具有結合任意類型的人因子Vll/VIIa，包括天然因子 Vll/VIIa或重組因子Vll/VIIa的強能力，其結合由非人哺乳動物基因組編碼的因子VII/ Vila，包括兔因子Vll/VIIa的能力弱或無能力。更具體地，對包含SEQ id No 86序列的適配子，根據Biacore 技術已測定出結合人因子Vll/VIIa的能力的值為約100nM(以解離常數Kd表示)。此外，所述核酸適配子對人血漿因子Vll/VIIa和對重組人因子Vll/VIIa(例如在轉基因兔中產生的)二者具有相同的結合能力。已顯示SEQ ID No 86序列的核酸和人因子Vll/VIIa之間形成的複合物是化學計量的，即形成複合物的SEQ ID No 86序列的核酸的分子數與人因子Vll/VIIa的分子數的比例為約1 1，且可特別地為1 1。如已經在上面提到的，本發明的親和基質可在純化由非人轉基因哺乳動物產生的重組人凝固蛋白的方法的步驟中使用。在純化凝固蛋白的方法的這些實施方案中，複雜的初始介質包括與大量蛋白質混合的重組人蛋白質，所述大量蛋白質由所述轉基因哺乳動物天然產生，其中視情況而定包括與重組人蛋白質同源的凝固蛋白。可以理解，在這些實施方案中，本發明的親和基質的成分核酸適配子選擇性結合目的人蛋白質、而在相同操作條件下不結合由非人哺乳動物天然產生的同源蛋白質是有利的。在本發明的親和基質的成分核酸適配子的這些特定實施方案中，所述適配子「特異性」結合目的人凝固蛋白的能力也可被表示為分別針對人蛋白質和針對非人哺乳動物同源蛋白質的解離常數Kd的比例。根據本發明的親和基質的成分核酸適配子的另一個特徵，所述核酸適配子特異性結合人凝固蛋白的能力也可被表示為以下條件(A)人Kd/非人 Kd < 0.01(A)，其中-「人Kd」是核酸適配子針對所述人蛋白質的解離常數，以摩爾單位表示，和-「非人Kd」是所述核酸適配子針對所述非人同源蛋白質的解離常數，以相同的摩爾單位表示。優選地，為了在純化重組人凝固蛋白的方法中最佳使用本發明的親和基質，也可通過人Kd/非人Kd的比例小於0. 005定義特異性結合所述重組人蛋白質的核酸適配子。本發明的親和基質的成分核酸適配子可根據名為SELEX的技術製備。使用的術語「適配子」包括能夠特異性結合蛋白質的單鏈核酸，DNA或RNA分子。適配子通常包括 5-120個之間的核苷酸並可根據名為SELEX(通過指數富集的配體的系統進化)的方法在體外選擇，其最初在PCT申請號WO 1991/019813中詳細描述。選擇適配子的SELEX方法由下述步驟組成使蛋白質與核酸、DNA或RNA的組合文庫(一般為1015個分子)接觸；去除不結合靶的核酸，分離和擴增結合靶的核酸。重複此方法直到溶液中富集了足夠的對目的蛋白質具有良好親和力的核酸(Tuerk和Gold，「Systematic evolution of ligands by exponential enrichment :RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" (1990) Science,249 (4968) :505-10 禾口 Ellington 禾口 Szostak，「Invitro selection of RNA molecules that bind specific ligands」，(1990)Nature Aug 30 ；346 (6287) :818-22)。 其他 SELEX 方法的實例在文件 EP 0 786 469, EP 668 931, EP 1 695 978 和 EP 1 493 825 中給出，其中的教導可重現以實施選擇根據本發明使用的核酸適配子的方法。為了在純化人因子Vll/VIIa的手段中使用，特異性結合目的凝固蛋白的核酸優選地被包含在化學結構(在本說明書中又稱「化合物」)中，其也包含間隔手段，且在適當時包含在固體基質上固定的手段。在一些實施方案中，核酸適配子被包含在以下通式(I)的化合物的結構中[FIX]x-[SPACJy-[APT] (I)，其中:-[FIX]表示用於固定在基質上的化合物，-[SPAC]表示間隔鏈，-[APT]表示特異性結合凝固蛋白的核酸，又稱核酸適配子，-χ是等於0或1的整數，和_y是等於0或1的整數。
在通式(I)的化合物的一些實施方案中，[APT]由SEQ ID No 86序列的脫氧核糖核酸組成。在通式(I)的化合物中以[SPAC]表示的「間隔鏈」可為任意已知類型。所述間隔鏈具有以下功能，即物理性間隔核酸和在其上固定所述化合物的固體基質表面，及賦予核酸相對可固定於其上的固體基質的表面的相對移動性。間隔鏈限制或阻止由於固體基質和核酸彼此距離過近造成的立體障礙，距離過近阻礙所述核酸和可能與所述核酸分子接觸的凝固蛋白分子之間的結合事件。在通式(I)的化合物中間隔鏈優選地結合在適配子核酸的5』端或3』端。有利地，間隔鏈同時結合適配子的一端和固體基質。具有間隔鏈的此構造具有不直接在固體基質上固定適配子的優勢。優選地，間隔鏈是非特異性寡核苷酸或聚乙二醇 (PEG)。當間隔鏈由非特異性寡核苷酸組成時，所述寡核苷酸有利地包含至少5個核苷酸的長度，優選5-15個核苷酸之間的長度。在間隔鏈由聚乙二醇組成的通式(I)的化合物的實施方案中，所述間隔鏈包含 PEG(C18)類型的聚乙二醇，例如由Sigma Aldrich公司出售的PEG(C18)。為了在間隔鏈上固定適配子，可使用多種化學基團化學修飾核酸，例如能共價固定所述核酸的基團，例如硫醇、胺或能夠與固體基質上存在的化學基團反應的任意其他基團。在通式(I)的化合物中，化合物[FIX]由選自下述的化合物組成(i)能夠與固體基質材料形成一個或多個共價鍵的化合物和(ii)能夠通過弱非共價鍵，包括氫鍵、靜電力或範德華力特異性結合固體基質的化合物。化合物[FIX]的第一種類型包含雙功能偶聯劑，例如戊二醛，SIAB或SMCC。SIAB,由Hermanson G. T. (1996,Bioconjugate techniques,San Diego :Academic Press, pp 239-242)描述，是下面通式(I)的化合物
權利要求
1.選擇性結合凝固蛋白的親和基質，其包含在其上固定了特異性結合所述凝固蛋白的核酸適配子的固體基質材料。
2.根據權利要求1的親和基質，其特徵在於所述核酸適配子由脫氧核糖核酸適配子組成。
3.根據權利要求1或2的親和基質，其特徵在於所述核酸適配子被包括在以下通式 (I)的化合物的結構中[FIX]x-[SPACJy-[APT] (I)，其中:-[FIX]表示用於固定在基質上的化合物，-[SPAC]表示間隔鏈，-[APT]表示特異性結合凝固蛋白的核酸，-χ是等於0或1的整數，和-y是等於0或1的整數。
4.根據權利要求3的親和基質，其特徵在於，在通式⑴的化合物中，[APT]由SEQID No. 1序列的脫氧核糖核酸組成。
5.根據權利要求1至4中任一項的親和基質，其特徵在於所述凝固蛋白選自因子I(纖維蛋白原)、因子II (凝血酶原)、因子V(前加速素)、因子VII (前轉變素)、因子VIII (抗血友病因子A)、因子IX (抗血友病因子B)、因子X (司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或 PTA)、因子XII (Hageman因子)、因子XIII (纖維蛋白穩定因子或FSF) ,PK(前激肽釋放酶)、 HMWK(高分子量激肽原)、組織促凝血酶原激酶、肝素輔因子II (HCII)、蛋白質C(PC)、凝血調節蛋白(TM)、蛋白質S(PS)、血管性血友病因子(vWF)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)，或其他組織因子。
6.根據權利要求1至5中任一項的親和基質，其特徵在於所述固體基質材料選自樹脂、 聚合物珠、磁珠、順磁性珠、過濾膜的基質材料和聚合物材料。
7.在基質上固定凝固蛋白的方法，其包括以下步驟，其中使包含所述凝固蛋白的樣品接觸根據權利要求1至6中任一項的親和基質。
8.純化凝固蛋白的方法，其包括以下步驟a)使包含凝固蛋白的樣品與根據權利要求1至6中任一項的親和基質接觸，以在(i) 在所述親和基質上固定的核酸適配子和(ii)所述凝固蛋白之間形成複合物，和b)從在步驟a)中形成的複合物中釋放蛋白質，和c)回收純化形式的所述凝固蛋白。
9.根據權利要求8的方法，其特徵在於所述樣品選自人血漿、或人血漿部分、或所述凝固蛋白的轉基因哺乳動物的奶、或所述奶的部分。
10.根據權利要求8或9的方法，其特徵在於所述血漿蛋白質是人的。
11.根據權利要求10的方法，其特徵在於所述樣品包含至少一種非人血漿蛋白質。
12.根據權利要求11的方法，其特徵在於所述人血漿蛋白質與所述非人血漿蛋白質是同源的。
13.根據權利要求12的方法，其特徵在於所述人血漿蛋白質是所述非人血漿蛋白質的同系物。
14.根據權利要求8至13任一項的方法，其特徵在於通過使所述親和基質接觸含有二價離子螯合劑、優選EDTA的洗脫緩衝液進行步驟b)。
15.重組人凝固蛋白的純化組合物，其包含以重量計至少99.9%的所述重組人蛋白質，且其基本上不含非人蛋白質。
16.包含根據權利要求15的重組人凝固蛋白的純化組合物的藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及選擇性結合凝固蛋白的親和基質，其包含在其上固定了特異性結合所述凝固蛋白的核酸適配子的固體基質。
文檔編號C07K1/22GK102405288SQ201080017046
公開日2012年4月4日 申請日期2010年2月19日 優先權日2009年2月19日
發明者G·佩雷, M·諾格雷 申請人:Lfb生物技術公司