大腸桿菌DH5α的耐乙酸突變株及其選育方法和應用的製作方法

2023-10-23 22:59:17

專利名稱：大腸桿菌DH5α的耐乙酸突變株及其選育方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種大腸桿菌，特別涉及一種大腸桿菌DH5α的突變株及其選育方法和應用。
為了解決乙酸對大腸桿菌的抑制問題，過去的一些研究主要集中在以下幾個方面(1)培養基優化；(2)發酵過程控制；(3)選育乙酸生成途徑－磷酸轉乙醯酶(PTA)或乙酸激酶(ACK)缺失突變株；(4)代謝工程方法。這幾種解決乙酸的抑制的方法主要集中在減少培養過程中乙酸的生成上，對改善菌體的生長和提高外源基因的表達效率都取得了一定的效果，但也存在一些不足之處。進行優化培養基時，在選用其它碳源如甘油替代葡萄糖時，往往會增加培養的成本，其效果也隨所用菌株不同而有較大差異。發酵過程中限制性流加葡萄糖以控制比生長速率低於臨界值能有效控制乙酸的生成，但會使菌體處於半飢餓態，是以犧牲比生長速率，延長培養時間來實現的，特別不利於與生長相關的外源基因的表達。發酵－分離耦合操作，可以在副產物產生的同時被除去，但對設備要求較高，投資加大，並難於在大規模生產上應用。PTA和ACK缺失突變株，雖然能夠減少乙酸的生成，但是往往會造成細胞生長減緩，並積累其它的有機酸如丙酮酸、琥珀酸，這同樣會抑制外源基因的表達。代謝工程方法改造大腸桿菌菌株是解決乙酸問題的根本方法，需要全面考慮大腸桿菌的整體代謝網絡的結構和調控特點，有待進一步進行研究，現有的工作多為將代謝流引向抑制作用較弱的代謝物或多糖，以及缺失PTA和ACK等。
選育耐乙酸大腸桿菌突變菌也可作為一種有效的手段以增強菌株對乙酸的耐受性和提高外源基因的表達效率，發明人曾篩選了大腸桿菌JM101的耐乙酸突變株JL3，不但改善了乙酸抑制條件下菌體的生長，而且減少了乙酸的積累並提高了外源β-半乳糖苷酶基因的表達效率(微生物學報，2001，41223～228)。文獻報導的大腸桿菌DH5α(HanahanD，J.Mol.Biol.，1983，166557～580)由於其轉化效率高，是基因工程中最常用的宿主菌之一，然而與其它一些大腸桿菌菌株相比，DH5α在基本培養基中消耗葡萄糖慢、生長能力差，且對乙酸十分敏感，不易實現高密度培養，所以DH5α的高密度培養存在較多問題。
本發明的構思是這樣的對DH5α進行誘變，在存在乙酸抑制壓力的條件下選育其耐乙酸突變株，以提高外源基因的表達水平。
大腸桿菌DH5α為一種屬於大腸埃希氏菌屬的菌種，對DH5α進行誘變或利用其自然突變，在存在乙酸抑制壓力的條件下進行選育，即可獲得本發明所說的耐乙酸突變株(Escherichia coli)DA19。該菌種已在2003年6月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號為CGMCC No.0941。
該菌種有如下特性該菌種與出發菌DH5α菌落形狀和大小相同；與出發菌一樣能夠利用葡萄糖、甘油、乙酸鈉為碳源，不能利用乳糖、蔗糖、澱粉作為碳源，與出發菌DH5α的營養需求相同，為維生素B1營養需求型；將含lacZ啟動子及其調控的β-半乳糖苷酶基因的質粒pUC18或pUC19轉入細胞內，在含有IPTG與X-gal的LB培養基瓊脂平板菌落顯蘭色，與出發菌一樣仍然存在α-互補現象。
1.形態特徵(1)細胞的形態和大小杆狀，0.5～3μm。
(2)胞子的形成不會形成孢子。
(3)革蘭氏染色性陰性。
2.在各種培養基上的生長狀態(1)LB瓊脂平板培養(30℃，48小時)菌落形狀圓形(Circular)，平滑(Smooth)，擴展(Spread)大小1～3mm；色調淺黃白色。
(2)LB瓊脂斜面培養(30℃，24小時)生長良好，菌苔光滑(Smooth)。
(3)LB液體培養(30℃，10小時)
生長良好，培養液混濁，放置一段時間會沉降(Sediment)。
(4)由蛋白腖生成氨陽性；(5)對氧的需求兼性厭氧；(6)由糖生成酸陽性葡萄糖、甘油、果糖；陰性蔗糖、乳糖；(7)生長pH範圍6.0～8.0；(8)生長最適宜溫度28～37℃；(9)營養需求型試驗維生素B1營養缺陷。
上述的特性可採用伯傑細菌鑑定手冊(Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology)介紹的方法進行鑑別，本發明的突變株DA19與出發菌DH5α最大的區別在於其耐乙酸能力強，在含乙酸的基本培養基中生長的菌體濃度大大高於其出發菌DH5α，以消耗的葡萄糖為基準的菌體得率YX/G是出發菌DH5α的2倍以上。
本發明的大腸桿菌DH5α的耐乙酸突變株DA19的選育方法依次包括如下步驟(1)對DH5α菌種進行培養，獲得DH5α菌液；(2)用60Co對DH5α菌液進行輻射，劑量為200-900Gy；(3)對輻射後的DH5α菌液為種子進行分批培養，培養時間16-40h；(4)連續培養，培養過程中逐步提高稀釋率，以初始稀釋率低於0.10h-1、最終稀釋率高於0.3h-1流加培養基A，最終OD600不低於0.3；
(5)繼續連續培養，培養過程中逐步提高稀釋率，以初始稀釋率0.05-0.12h-1、最終稀釋率不低於0.25h-1流加培養基B；(6)連續培養結束後用含葡萄糖和乙酸鹽的基本培養基平板進行單菌落分離，即可選育到本發明的菌種；所說的培養基A或B以葡萄糖為碳源，A含有50-70mmol/L的乙酸鹽和5g/L的蛋白腖，B含有100-150mmol/L的乙酸鹽和2.5g/L的蛋白腖。優選的乙酸鹽為乙酸的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽中的一種，以避免直接加入乙酸引起的pH變化。
按照本發明優選的技術方案，對流加培養基B結束後的培養液，再次進行用60Co進行進行輻射，並採用步驟(3)、(4)、(5)和(6)的方法進行培養，以進一步提供所獲得的菌種的耐乙酸能力。
本發明的菌種可用於表達外源基因。
本發明的DH5α的耐乙酸突變菌的優點在於生長優勢明顯，在耐乙酸能力增強的同時乙酸的產生也減少，容易實現高密度培養，外源基因表達效率提高。
為了更好地理解本發明的內容，通過以下實施例作進一步說明。
表1菌株名稱 DH5αDA19DA42DA50DA52DA53細胞濃度/(g/L) 0.1780.517 0.499 0.492 0.466 0.481YX/Ga/(g/g) 0.0630.216 0.207 0.204 0.191 0.199實施例1中流加培養基B的連續培養結束時，取培養液10ml，用劑量700Gy60Co再次輻照，再一次進行連續培養，方法同實施例1，但流加培養基C[1L含葡萄糖1.6g，乙酸鈉10g，pH7.0，無機鹽和維生素B1與培養基A相同]，初始稀釋率為0.082h-1，逐步提高稀釋率，176h達到0.158h-1，此時OD600nm為0.030，結束連續培養。取反應器中的最終培養液，適當稀釋塗MAB平板[1L中乙酸鈉10g，其它成分含量與MAA平板相同]，挑選菌落出現較早且大的單菌落。在含有10g/L乙酸鈉，葡萄糖濃度為5g/L MA培養基中[1L中含無機鹽和維生素B1與培養基A相同]搖瓶培養20h，選育到的突變株DB系列與實施例1中得到的DA19的培養結果見表2，由於突變株DB系列的耐乙酸能力進一步增強，在MA培養基中生長的菌體濃度比DA19高，以消耗的葡萄糖為基準的菌體得率YX/G也增加。
表2菌株名稱 DA19DB1DB7DB8DB15DB18細胞濃度/(g/L) 0.330 0.449 0.440 0.494 0.503 0.465YX/Ga/(g/g) 0.124 0.131 0.136 0.142 0.152 0.151實施例3將如實施例1所述方法培養的DH5α和DA19一級種子分別轉接1mL於兩個500mL錐形瓶裡100mL YPS培養基中，相同條件培養10h作為發酵罐培養的二級種子。將二級種子分別接種於5L發酵罐的M培養基[1L中含葡萄糖的量見表3，無機鹽及維生素B1的含量與實施例1中的培養基A相同]，接種後體積3.2L，30℃，攪拌轉速和通氣量根據溶解氧的變化進行調整，以保證培養的過程中溶解氧在20％以上，控制pH6.9～7.0，以考察在基本培養基中的生長和乙酸生成情況，培養結果見表3，其中YX/G是以消耗的葡萄糖為基準的菌體得率，YA/X是單位菌體的產乙酸得率。由表3可知，在基本培養基中，DA19的生長大大改善，YX/G大大高於出發菌DH5α，可以達到較高的菌體濃度。
表3
初始葡 DH5α DA19萄糖濃菌濃1乙酸1YA/X1，2YX/G1菌濃1乙酸1YA/X1，2YX/G1度/ (g/L) /(mmol/) /(mmol /(g/g) /(g/L) /(mmol/L) /(mmol/L (g/g)g/L) L)/g) g)230.4543.65 8.04 0.2030.8901.89 2.63 0.4041030.4683.74 8.52 0.0501.97 19.5 9.89 0.192104，5--- -4.14 4.84 1.17 0.4041024，5--- -26.2 93.2 3.56 0.2571.為峰值；2.為乙酸濃度最大時單位菌體產乙酸得率；3.用2mol/LNaOH調節pH；4.用1mol/L NH3·H2O調節pH；5.1L培養基中加入0.5mL微量元素混合溶液[1L微量元素混合溶液含FeSO4·7H2O 40g，MnSO4·nH2O 10g，AlCl3·6H2O 10g，CoCl24g，ZnSO4·7H2O 2g，Na2MoO4·2H2O 2g，CuCl2·2H2O 1g，H3BO40.5g]。
實施例4將帶有phoA啟動子調控表皮生長因子(EGF)基因表達的質粒轉入出發菌DH5α和突變菌DA19、DB15中，如實施例1所述的條件培養的二級種子1ml分別接入250ml搖瓶裡30ml YPS10G培養基[1L YPS培養基含葡萄糖10g]中，30℃，250r/min搖床培養，12000rpm離心10min，用電泳方法檢測上清液中EGF的含量，考馬斯亮蘭染色，結果見表4，由表4可知，耐乙酸突變株DA19和DB15表達的EFG水平和單位菌體表達的EGF(YEGF/X)均高於DH5α，表明耐乙酸突變株表達EGF效率提高。
表4StrainsDH5αDA19 DB15EGF/(mg/L) 3.98 7.54 5.72YEGF/X/(mg/g) 4.04 6.22 5.68DH5α的耐乙酸突變株系列生長改善、耐乙酸能力增強、菌體得率提高，同時在培養過程中乙酸產生減少，易實現高密度培養，用於表達外源基因效率提高。根據本發明公開的突變菌及實施例，有關技術人員可以方便地選育DH5α的耐乙酸突變菌株，應用於高密發酵和外源基因產物的生產中。
權利要求
1.一種大腸桿菌DH5α的耐乙酸突變株(Escherichia coli)CGMCCNo.0941。
2.權利要求1所述的大腸桿菌DH5α的耐乙酸突變株(Escherichiacoli)CGMCC No.0941的選育方法，其特徵在於，依次包括如下步驟(1)對DH5α菌種進行培養，獲得DH5α菌液；(2)用60Co對DH5α菌液進行輻射；(3)對輻射後的DH5α菌液先進行分批培養；(4)連續培養，培養過程中逐步提高稀釋率，以初始稀釋率低於0.10h-1、最終稀釋率高於0.30h-1流加培養基A，最終OD600不低於0.30；(5)繼續連續培養，培養過程中逐步提高稀釋率，以初始稀釋率0.05-0.12h-1、最終稀釋率不低於0.25h-1流加培養基B；(6)連續培養結束後用含葡萄糖和乙酸鹽的基本培養基平板進行單菌落分離，即可選育到本發明的菌種；所說的培養基A或B以葡萄糖為碳源，A含有50-70mmol/L的乙酸鹽和5g/L的蛋白腖，B含有100-150mmol/L的乙酸鹽和5g/L的蛋白腖。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，用60Co對DH5α菌液進行輻射，劑量為200-900Gy；或通過其自發突變。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，乙酸鹽為乙酸的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽中的一種。
5.根據權利要求2、3或4所述的方法，其特徵在於，在流加培養基B後的培養液，再次進行用60Co進行進行輻射，並採用步驟(3)、(4)、(5)和(6)的方法進行培養。
6.權利要求1所述的菌種在表達外源基因中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α的耐乙酸突變株CGMCC No.0941及其選育方法和應用。本發明對DH5α進行誘變，在存在乙酸抑制壓力的條件下選育其耐乙酸突變株，以提高外源基因的表達水平。本發明的菌種可用於外源基因的表達。本發明的DH5α的耐乙酸突變菌的優點在於生長優勢明顯，在耐乙酸能力增強的同時乙酸的產生也減少，容易實現高密度培養，外源基因表達效率提高。
文檔編號C12N1/20GK1472309SQ0312945
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月23日 優先權日2003年6月23日
發明者葉勤, 朱才慶, 葉 勤 申請人:華東理工大學