單標記寡聚核苷酸螢光探針及檢測核酸酶的方法
2023-10-23 16:10:22 1
專利名稱：單標記寡聚核苷酸螢光探針及檢測核酸酶的方法
技術領域：
本發明涉及 外切酶、聚合酶、多聚核苷酸激酶、磷酸酯酶等多種核酸酶的分析檢測領域，更具體地，涉及一種單標記寡聚核苷酸螢光探針，以及利用單標記寡核苷酸螢光探針分析檢測核酸酶的方法。
背景技術：
DNA是生命信息傳遞的重要遺傳物質，這種傳遞過程依賴各種核酸酶的特殊作用。 例如，核酸的延伸、校正、連接、磷酸化、去磷酸化、酶切等重要的生命過程無不依靠核酸酶與DNA的特異性相互作用。快速簡便的核酸酶動力學分析方法對研究生物多樣性和深入理解生命現象有著重要意義。核酸酶活性分析，通過研究DNA反應產物的方法有凝膠電泳、高效液相色譜、親和力分析(filter binding)等。這些方法都是不連續性分析，操作麻煩、費時、費用高，無法快速、方便地獲取分析結果，而且一般是採用放射性標記來提高靈敏度。採用增色效應紫外分析法可連續檢測核酸酶反應，但是可檢測底物濃度的範圍較窄並且所需底物的濃度較高。酶聯免疫吸附方法(ELISA)也被用於酶切反應的研究，但也是一種不連續的分析體系。 近幾年來，隨著螢光核酸探針的發展，出現了一些新的分析技術和方法來檢測核酸酶與DNA 相互作用過程，主要是通過螢光共振能量轉移對目標DNA與核酸酶反應前後體系螢光的變化進行實時的監測。其中分子信標(Molecular Beacon)核酸探針應用最為廣泛。分子信標是呈髮夾結構的短鏈DNA，一端標記螢光基團，一端標記猝滅基團。在進行核酸酶活性分析中，將分子信標設計成特異的序列與核酸酶相互作用導致分子信標的構象發生變化，從而由螢光信號實時指示核酸酶的動力學作用過程。但是有許多重要核酸酶的作用位點是在 DNA鏈的末端，例如聚合酶、連接酶、核酸外切酶、激酶、去磷酸化酶等等，由於分子信標的 5』-端和3』-端分別標記了螢光基團和猝滅基團，使之不能直接作為核酸酶的作用底物，這樣就需要設計使用另一條與分子信標互補的序列來提供能與核酸酶反應的DNA末端。這樣不僅增加了設計成本和工作量，而且額外的DNA分子增加了反應的複雜性，既要考慮分子信標與互補模板的濃度匹配，又要考慮使二者形成穩定雜交體的反應條件。諸多的因素使得分子信標方法在核酸酶的實際檢測應用中受到限制。因此，迫切需要開發出簡便、快速、靈敏度高、成本低、準確可靠的核酸酶實時檢測方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種可用於實時檢測核酸酶活性和酶催化反應動力學的簡便、快速、靈敏度高、成本低、準確可靠的分析方法，以克服現有技術中的諸多局限。本發明的技術方案是，根據光誘導電子轉移猝滅原理設計單標記寡聚核苷酸螢光探針(簡稱單標記探針)，該探針序列既作為DNA底物與核酸酶反應，又作為指示反應進程的探針，實時檢測螢光信號的變化來分析核酸酶的活性以及與DNA反應的動力學過程。
所謂光誘導電子轉移猝滅原理是指1)構成DNA序列的四種脫氧核糖核苷酸對於特定的螢光基團在激發光誘導下通過電子轉移機制使得螢光信號產生猝滅作用的現象；
2)這種猝滅作用 是在光引發下電子從脫氧核糖核苷酸轉移到螢光基團產生的，鹼基的氧化能力(給電子能力)和螢光基團的還原能力(得電子能力)大小決定了猝滅作用的強弱；
3)對於給定的螢光基團，四種鹼基根據氧化電勢排列猝滅作用的強弱順序為dG>dA> dC ^ dT ；相對於分子信標，本發明的單標記探針在設計中僅標記螢光基團而不標記淬滅基團，利用上述的光誘導電子轉移猝滅原理，通過鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸(簡稱鳥嘌呤，dG) 來產生猝滅作用，在單標記探針與核酸酶的反應過程中鳥嘌呤的變化導致螢光信號的變化，從而指示核酸酶與DNA的反應活性。本發明的單標記寡聚核苷酸螢光探針(簡稱單標記探針)具有莖環結構，其中環部為單鏈結構，一般由5-24個核苷酸殘基組成，而莖部則根據待測核酸酶的活性功能分為水解模式與合成模式兩種設計(參見
圖1)1)水解模式的莖部是由一定長度的互補鹼基對構成的雙鏈結構，其中至少有3個連續G-C鹼基對在莖部末端，即莖部末端的一條鏈是連續的C鹼基，另一條鏈是連續的G鹼基，C鹼基端標記螢光基團，G鹼基端既產生猝滅作用又參與待測核酸酶反應或者在進一步修飾後用作待測核酸酶的底物，在核酸酶作用下莖部的一條鏈水解，釋放出螢光信號；2)合成模式的莖部由6-10對互補鹼基構成的雙鏈和5』 -(dC)4_8(4-8個連續的胞嘧啶脫氧核糖核苷酸)側鏈組成，5』 -端標記螢光基團，3』 -端與核酸酶反應，聚合延伸產生4-8個連續的鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸，猝滅5』-端的螢光基團，根據螢光信號的變化情況分析待測核酸酶活性。本發明中選用可被鳥嘌呤高效猝滅的螢光基團來標記探針，常用的螢光基團的中英文全稱見表1。表1.單標記探針的螢光基團標記的中英文全稱
權利要求
1.一種單標記寡聚核苷酸螢光探針，具有莖環結構，其環部為單鏈結構，莖部為雙鏈結構，莖部末端是3個以上的連續C鹼基和連續G鹼基組成的G-C鹼基對，C鹼基端標記螢光基團，G鹼基端具有螢光淬滅作用。
2.一種單標記寡聚核苷酸螢光探針，具有莖環結構，其環部為單鏈結構，莖部由6-10 對互補鹼基構成的雙鏈和5』 _(dC)4_8側鏈組成，且5』 -端標記螢光基團。
3.如權利要求1或2所述的單標記寡聚核苷酸螢光探針，其特徵在於，所述環部由5-24個核苷酸殘基組成。
4.如權利要求1或2所述的單標記寡聚核苷酸螢光探針，其特徵在於，所述螢光基團是6-羧基螢光素、5-四氯螢光素、5-六氯螢光素、6-羧基羅丹明χ或6-羧基四甲基羅丹明。
5.權利要求1所述的單標記寡聚核苷酸螢光探針在核酸酶檢測中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所檢測的核酸酶是下列所述酶i)或酶ii) i)對雙鏈DNA的3』或5』末端或者末端附近序列具有切割活性的核酸酶； )以雙鏈DNA的3』或5』末端為反應底物，且與i)所述的核酸酶聯用能夠切割雙鏈 DNA的3』或5』末端或者末端附近序列的核酸酶；以所述單標記寡聚核苷酸螢光探針作為DNA底物與所述核酸酶反應，實時檢測螢光信號的變化，從而分析核酸酶的活性以及酶與DNA反應的動力學過程。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所檢測的核酸酶是下列酶中的一種作用於雙鏈DNA的核酸外切酶、限制性內切酶、作用於雙鏈DNA的修飾酶、具有脫嘌呤/脫嘧啶裂解酶活性的修復酶和對損傷的鳥嘌呤位點具有N-糖基化酶活性的修復酶。
8.權利要求2所述的單標記寡聚核苷酸螢光探針在核酸酶檢測中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所檢測的核酸酶是下列所述酶1)或酶2)1)具有聚合活性或者聚合和保真活性的DNA聚合酶；2)與1)所述DNA聚合酶聯用，使得DNA的聚合延伸反應得以實現的酶。以所述單標記寡聚核苷酸螢光探針作為DNA底物與所述核酸酶反應，實時檢測螢光信號的變化，從而分析核酸酶的活性以及酶與DNA反應的動力學過程。
10.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述酶2)是具有3』-端去磷酸化活性的激酶和磷酸酶。
全文摘要
本發明公開了一類單標記寡聚核苷酸螢光探針及檢測核酸酶的方法。該單標記寡聚核苷酸螢光探針具有莖環結構，環部由5-24個核苷酸殘基組成，莖部根據待測核酸酶的活性分為水解模式與合成模式兩種水解模式的莖部為雙鏈結構，且末端至少有3個連續G-C鹼基對，C鹼基端標記螢光基團，G鹼基端產生猝滅作用，在核酸酶作用下莖部的一條鏈水解，釋放出螢光信號；合成模式的莖部由一段雙鏈和5』-(dC)4-8側鏈組成，5』-端標記螢光基團，3』-端與核酸酶反應，聚合延伸產生4-8個連續的鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸，猝滅5』-端的螢光基團，根據螢光信號的變化情況分析待測核酸酶活性。
文檔編號C12Q1/68GK102154489SQ201110049749
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月1日 優先權日2011年3月1日
發明者宋晨, 張晨, 蘇昕, 趙美萍 申請人:北京大學