S-腺苷甲硫氨酸(sam)和超氧化物歧化酶(sod)在製備用於治療阿爾茨海默病的藥物中的用途
2023-10-24 04:22:57
S-腺苷甲硫氨酸(sam)和超氧化物歧化酶(sod)在製備用於治療阿爾茨海默病的藥物中的用途
【專利摘要】本發明公開了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和超氧化物歧化酶(SOD)組合在製備用於治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。
【專利說明】s-腺苷甲硫氨酸（SAM)和超氧化物歧化酶（SOD)在製備用 於治療阿爾茨海默病的藥物中的用途
[0001] 本申請是申請日為2009年2月25日的、發明名稱為"S-腺苷甲硫氨酸（SAM)和 超氧化物歧化酶（S0D)在製備用於治療阿爾茨海默病的藥物中的用途"的中國專利申請 200980106484. 5 (PCT/EP2009/001323)的分案申請。【技術領域】
[0002] 本發明涉及S-腺苷甲硫氨酸（SAM)和超氧化物歧化酶（S0D)在製備用於治療阿 爾茨海默病的藥物中的用途。
[0003] 發明背景
[0004] 阿爾茨海默病（AD)是一種分布非常廣泛的神經退行性痴呆形式，其影響著相當 大比例的世界上年齡超過70歲的人群，其中男人與女人的比率為1:2。AD的發病率在不斷 上升中，原因是更為常見的非遺傳性AD形式開始於約70-75歲，而預期壽命由於生活標準 的提高和醫學與藥理學的進步而增加。該疾病還以與染色體14、19和21的某些基因座中的 突變相關的遺傳傳遞形式存在（一個典型是唐氏症候群個體）。家族型AD的早發約在50 歲出現，並且引起腦變性，之後在2-3年中死亡。該疾病的晚發形式也引起腦變性和死亡， 但是在10年或更長的時間內。
[0005] 腦在神經元之間的間隙中存在大量斑塊，並在神經元中（尤其是在大腦皮質、海 馬和杏仁核的神經元中）、以及在具有認知功能的腦的其它部分中存在典型的神經原纖維 纏結。澱粉樣蛋白斑塊，也稱為老年斑，是β_澱粉樣蛋白（Αβ)肽的聚合物，Αβ肽衍生自 較大的蛋白：β-澱粉樣蛋白前體蛋白（ΑΡΡ)。ΑΡΡ是高保守的跨膜糖蛋白超家族的成員。
[0006] 在最近十年中，從事AD研究的科學家為了了解其病因學（尤其是分子機理）已經 進行大量實驗。對分子組分及其調節的研究可以闡明其治療和診斷前景。注意力已經集中 於早老蛋白（presenilins)，其在ΑΡΡ加工中的作用以及因而在Αβ產生中的作用似乎具有 高度意義。已經證明，這些蛋白，即早老蛋白1(PS1)和早老蛋白2(PS2)，呈現酶活性或調 節其它酶（即分泌酶）的活性，分泌酶將APP裂解成通常可降解的代謝物（α -分泌酶）或 Α β肽（β -和γ -分泌酶）。在家族性AD中，編碼PS1和PS2的基因的突變導致Α β的過 量生成和特別是同種型Α β-42(其是高度促澱粉狀變的）的蓄積。最近，關於PS1敲除小 鼠的實驗證實分泌酶活性大幅降低，說明PS1，不僅屬於γ-分泌酶複合物，也主要負責 Αβ的生成和蓄積。關於β-分泌酶，據認為BACE基因的產物可單獨行使β-分泌酶斷裂 作用。
[0007] 臨床上有用的和分泌酶抑制劑的開發可以成為對抗阿爾茨海默病的重要 武器，並且是當前神經科學中最令人興奮的挑戰之一。已經清楚地證明，PS1的活性不能被 完全抑制，因為需要這種蛋白加工轉導因子Notch-Ι，一種對很多幹細胞（如與紅細胞生成 有關的那些）的成熟而言重要的因子。
[0008] 可以在能夠表達與AD有關的基因的細胞培養系統中成功地研究DNA甲基化對基 因表達的調節。作為我們研究的結果，在與老化有關的調節機制方面已經發現了一個非常 有趣的跡象，即，老年人中DNA低甲基化的逐步整體增加以及在老年性痴呆患者中觀察到 的同型半胱氨酸蓄積。同型半胱氨酸蓄積和DNA低甲基化在代謝上相關，因為同型半胱氨 酸不能轉化成甲硫氨酸，使得代謝向著S-腺苷同型半胱氨酸的合成逆轉，已知s-腺苷同型 半胱氨酸是強DNA-甲基轉化酶抑制劑，並由此誘導DNA低甲基化。依照已經成熟建立的理 論--很多基因在特定序列的胞嘧啶去甲基化時表達，這種生物化學方式可能導致未表達 的基因表達和正常表達的基因過表達。對於AD，這可能是事實，因為PS1即γ -分泌酶的過 表達可以間斷地超過α-分泌酶活性，並由此產生Αβ肽，之後肽蓄積，並且可以在很多年 後引起該疾病。DNA甲基化在AD中的可能作用的再一跡象是發現：AD患者腦中存在低得多 的死後甲基供體水平。S-腺苷甲硫氨酸（SAM)的較低可得性可能容易地導致與ΑΡΡ代謝有 關的基因的表達改變或增加，從而最終導致Αβ肽在老年斑中的蓄積。
[0009] 已經在表達APP、PSl、PS2、BACE、α-分泌酶、Y-分泌酶的其它組分以及Notchl的 成神經細胞瘤系（SK-N-SH)上進行了初步實驗。用剝奪了葉酸、維生素 Β12和維生素 Β6的 培養基處理培養物（為了改變同型半胱氨酸的代謝），向培養基中加入不同濃度的SAM(以 平衡維生素剝奪的影響）。我們發現在剝奪了維生素 B的培養基中PS1和BACE表達增加， 並且在施用SAM後PS1和BACE表達顯著減少。在用Hpall/PCR對APP和PS1啟動子進行的 實驗中，我們發現PS1啟動子的CpG位點之一的甲基化有顯著差異。我們得出結論，可以通 過施用外源性SAM使PS1基因部分沉默。SAM的施用可以減少PS1表達，恢復有利於α-分 泌酶的代謝平衡。還用TgCRNDS株轉基因小鼠和相應對照進行了實驗；這些小鼠的特徵在 於存在人突變的APP基因，並因此可以在短時間內形成澱粉樣蛋白斑塊。用完全飲食或缺 少B族維生素的飲食餵養這些動物；再次，如在細胞中一樣，觀察到了 PS1和BACE表達的增 加。
[0010] 在兩個實驗模型中，基因表達的改變具有增加和β-分泌酶活性以及由此過 度產生Αβ的作用，與用對照飲食處理的動物相比，Αβ更快速地蓄積以形成老年斑。
[0011] 已經在下述出版物中報告了上述數據：
[0012] Fuso A. , Nicolia V. , Cavallaro R. A. , Ricceri L. , D' Anselmi F. , Coluccia P.，Calamandrei G.和Scarpa S. 2008.在小鼠中B族維生素剝奪誘導高同型半胱氨酸 血症和腦S-腺苷同型半胱氨酸、耗竭腦S-腺苷甲硫氨酸並且增加 PS1和BACE表達以 及澱粉樣蛋白 _β 沉積（B_Vitamin Deprivation Induces Hyperhomocysteinemia and Brain S-adenosylhomocsyteine, Depletes Brain S-adenosylmethionine, and Enhances PS1 and BACE Expression and Amyloid-β Deposition in Mice). Mice. Mol. Cell. Neurosci. 37 :731_746〇
[0013] Fuso A. , Cavallaro R. A. , Zampelli A. , D' Anselmi F. , Piscopo P. , Confaloni A.和Scarpa S. 2007.在成神經細胞瘤和成膠質細胞瘤細胞中通過同型半胱氨酸循環 的改變而差異地調節 分泌酶（Y_secretase is differe ntially modulated by alterations of Homocysteine cycle in neuroblastoma and glioblastoma cells). J.Alz.Dis. 11 :275-290。
[0014] Cavallaro R. A.，Fuso A.，D，Anselmi F.和 Scarpa S. 2006.通過 cDNA 微陣列 分析研究S_腺苷甲硫氨酸對CNS基因表達的影響（The effectof S-adenosylmethyonine on CNS gene expression studied by cDNA mycroarrays analysis). J. Alz. Disease. 9 ： 415-419。
[0015] Scarpa S.，Cavallaro R. A.，D' Anselmi F.和 Fuso A. 2006.通過甲基化使 基因沉默：對阿爾茨海默病的外遺傳幹預（Gene silencing through methylation:an epigenetic intervention on Alzheimer Disease) · J. Alz. Disease. 9 :407_414〇
[0016] Fuso A.，Seminara L.，Cavallaro R. A. , D，Anselmi F.和 Scarpa S. 2004.同 型半胱氨酸/S-腺苷甲硫氨酸循環的改變使DNA甲基化狀態失衡，隨後上調β-澱粉樣 蛋白產生（Homocysteine/S-adenosylmethionine Cycle Alterations Unbalance DNA Methylation Status with Consequent Up-regulation of Beta-amyloid Production). Mol. Cell. Neurosci. 28(1) ：195-204〇
[0017] Scarpa S.，Fuso A.，D，Anselmi F.，Cavallaro R. A. 2003. S_ 腺苷甲硫氨酸使早 老蛋白1基因沉默：對阿爾茨海默病的治療？（S-adenosylmethionine :a treatment for Alzheimer disease ? )FEBS Letters 541 (1-3):145-148。
[0018] Fuso A.，Cavallaro R. A. , OrriiL· , Buttarelli F. R.和 Scarpa S. 2001.在肌肉 分化中通過S_腺苷甲硫氨酸使基因沉默（Gene silencing by S-adenosylmethionine in muscle differentiation) .FEBS Letters 508(3) :337_340。
[0019] US 2002/025926和US 2004/0048827中也提出SAM治療AD的用途。後一文獻證 明SAM幹擾β-分泌酶、早老蛋白1和2以及β-澱粉樣蛋白前體基因表達的能力。如下 報告，在所述專利申請後用標記的（氚化的）SAMe進行的研究證明該分子具有在口服施用 後到達中樞神經系統的能力。
[0020] 在US 5519058和CN 1099224中提出了 S0D在治療AD中的有益作用。
[0021] 在US 2003/129261和W0 2005/041996中公開了包含SAM和S0D以及數種活性成 分的藥物組合物，用於除AD之外的病症。
[0022] 發明概述
[0023] 現在已經發現，當S-腺苷甲硫氨酸與超氧化物歧化酶（S0D)組合施用時，其活性 可以令人驚訝地得到提高。這種酶不僅被證明能夠促進S-腺苷甲硫氨酸通過血腦屏障，而 且能與SAM協同地相互作用以減少由於維生素 B缺乏而引起過表達的PS1和BACE基因的 表達。
[0024] 因此，本發明的一個方面涉及包含S-腺苷甲硫氨酸或其衍生物和超氧化物歧化 酶的產品，該產品為用於在阿爾茨海默病治療中同時、分開或相繼施用的組合製劑的形式。
[0025] 由於SAM和S0D的毒性極低，所以劑量可在較大範圍內變化，並且將取決於多種因 素，例如患者的體重、性別和年齡。但是，一般來說，對於SAM，劑量可為200至2000mg/天， 對於S0D則可為50至lOOOrng/天。
[0026] SAM可以就此或以其穩定鹽的形式（例如甲苯磺酸鹽、丁烷二磺酸鹽、甲苯磺酸二 硫酸鹽、二甲苯磺酸二硫酸鹽或單甲苯磺酸二硫酸鹽）施用，優選口服施用。一種有利的施 用形式是在W0 2006/131382中描述的富含SAM的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) 細胞。
[0027] 通過發酵自釀酒酵母菌株獲得（如 申請人:提交的W0 2006/131382中描述）的 S0D，也可以支撐在麥醇溶蛋白薄膜上或者使用其它胃保護技術而口服施用。作為口服途徑 的替代，可以胃腸外施用，例如通過肌內注射，SAM和S0D。
[0028] 這些製劑的實例包括用丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物薄膜包衣的片劑、腸溶膠囊 (gastroresistant capsules)、微囊等。
[0029] SAM和SOD可以存在於同一劑量單位中或分開配製和施用：在此情況下，可以提供 以分開的劑型包含兩種藥物以及包含有關其相繼、同時或分開使用的說明書的試劑盒。
[0030] 附圖概述
[0031] 圖la和lb顯示SAM和S0D在小鼠中對由剝奪了維生素 B的飲食誘導的PS1和 BACE過表達的影響。
[0032] 圖2顯示在SK-N-BE系成神經細胞瘤細胞中S0D和穀胱甘肽（GSH)，單獨和與SAM 組合，對PS 1和BACE過表達的影響。
[0033] 圖3顯示口服施用SAM 400 μ g/天后在小鼠腦中氚標記的SAM的水平。
[0034] 圖4顯示在處理一周後對人成神經細胞瘤細胞中澱粉樣蛋白-β產生的測量。
[0035] 圖5顯示SAM和S0D對用維生素 Β剝奪飲食處理的小鼠的紅細胞和腦中氧化狀態 的影響。
[0036] 現在藉助於下述舉例說明性藥理學試驗更詳細地描述本發明。
[0037] 實施例1 -基因表達
[0038] 具體來說，測試藥理學濃度（400 μ g/天）的SAM對TgCRND8小鼠和相應的野生型 對照的作用。
[0039] 基因表達通道
[0040] 從細胞培養物和均漿的腦中提取RNA，併合成CDNA。0. 5 μ g總CDNA用於每個實時 反應，使用SYBR-Green試劑在0pticon2 DNA Engine (MJ Research)上進行。通過標準線 性擴增曲線，先前已經確定了每對引物的擴增效率。將實驗樣品與特定基因的標準曲線比 較來確定存在於標準反應中的特定cDNA的量。標準獲自通過陽性對照擴增的高度純化的 PCR產物。將總cDNA水平相對於β-肌動蛋白對照（管家基因）標準化。
[0041] 結果表明，SAM也可以體內逆轉由剝奪性飲食誘導的PS1和BACE過表達（圖1)， 並且甚至可以使其減至比對照飲食還低的水平。
[0042] 由於同型半胱氨酸代謝與甲基化和氧化還原反應兩者均有關，所以我們測試了 各種抗氧化劑對兩種基因表達的影響。用SK-N-BE系成神經細胞瘤細胞獲得的第一數據 表明，S0D和穀胱甘肽（GSH)兩者均抑制由維生素剝奪誘導的PS1和BACE過表達，儘管 比SAM的抑制程度低。但是，有趣的是注意到，當一起施用S0D和SAM時，它們呈現協同效 應（圖2)，其進一步使兩種基因的表達減至比單獨用SAM觀察到的水平更低的水平（低 15-20% ) 〇
[0043] 實施例2 - SAM攝取
[0044] 在細胞和小鼠上進行實驗以證明SAM跨過血腦屏障。
[0045] 對於細胞培養物，將100 μ M SAM加至F14細胞培養基（根據試驗設計，完全培養 基或剝奪維生素 B的培養基）中，在96小時後終止培養。
[0046] 對於小鼠，通過飼餵探測針（probe needle)而口服施用400 μ g/天的SAM，並在2 個月後處死動物；根據試驗設計，用完全飲食或剝奪了維生素 B的飲食餵養動物。通過具有 Varian HPLC系統的HPLC來分析SAM水平。將細胞和勻漿的腦在蒸餾水中裂解，並用1.5M PCA沉澱大分子。在實驗樣品之前和之後計算了標準SAM曲線。對於氚標記的SAM的分析， 如上所述處理細胞，但是處理小鼠4天以使放射性藥物暴露最小化。將細胞和勻漿的腦在 蒸餾水中裂解。對裂解的腦的一部分進行超聲處理，並進行離心以分離膜和細胞器；另一部 分在超聲處理後用高氯酸（PCA)處理，從而分離大分子。用β計數器通過閃爍法來測量放 射性SAM的攝取。
[0047] 發現SAM的胞內水平由1 μ Μ(對照）增至2. 5-3 μ M。為了確定這種增長是否是由 於外源性SAM的攝取引起的而不是在該分子的升高胞外濃度存在下內源儲備物的增加，用 放射性SAM進行了試驗。將100 μ Μ氚標記的SAM (SAM [3H])加至SK-N-BE細胞培養物中， 通過細胞裂解物和放射性計數來評價攝取。在細胞裂解物中得到1. 5 μ Μ的SAM放射性計 數；此值相當於使用非氚標記的SAM得到的值的1至2. 5倍增加，清楚地表明該胞內增長是 由於外源性SAM的攝取引起的。
[0048] 在用400 μ g/天SAM 口服處理的小鼠的腦裂解物中發現了 SAM水平的類似增長； 再次，用400和800 μ g/天濃度的SAM[3H]進行了另外的試驗。在用400 μ g SAM處理的小 鼠中，總腦裂解物中增長的放射性相當於〇. 5ngSAM/腦，而在用800 μ g SAM處理的小鼠中 為 lng SAM/ 腦（圖 3)。
[0049] 也對總腦裂解物的一部分進行超聲處理，並離心獲得澄清裂解物（細胞質），該澄 清裂解物的再一部分用高氯酸（PCA)沉澱以除去蛋白質（可溶性裂解物）。有趣的是注意 至IJ，得自用800 μ g SAM處理的小鼠的可溶裂解物顯示相當於0. 5ng SAM的放射性水平（而 總裂解物和澄清裂解物呈現更高的水平），說明鍵合外源性SAM的過量甲基官能團與其它 細胞分子綴合。
[0050] 實施例3 -成神經細胞瘤細胞系中的澱粉樣蛋白產生
[0051] 方法：培養基和細胞培養物
[0052] 將成神經細胞瘤SK-N-BE人細胞系維持在具有10% FCS的F14培養基中，並轉移 至完全分化培養基（對照培養基，具有1 % FCS+10 μ Μ視黃酸）或轉移至缺少葉酸、維生素 Β12和維生素 Β6的分化培養基（Β缺乏）。每隔一天對培養物進行再餵養，並96天後終止。
[0053] 動物和飲食
[0054] 在約3周齡時，將小鼠有系統地分配至對照飲食組或不足飲食組，隨意獲取食物 和水。對照（ΑΙΝ-93Μ ;飲食A :葉酸mg 1. 98 ;維生素 Β12 mgO. 025 ;維生素 Β6 mg 7)和實驗 飲食（AIN-93M B ;飲食B，缺少葉酸、維生素 B12和維生素 B6)購自Mucedola(義大利）。兩種 飲食均含有1 %磺胺噻唑以便藉助於腸細菌抑制葉酸生成，並確保唯一的葉酸來源是飲食。 而且，其它三個動物組接受SAM (800 μ g/天）或SOD (10U/天）或兩種藥物（SAM400 μ g/天 和SOD 5U/天）的組合。處理一周後，將小鼠麻醉並處死，得到腦和血液。通過心穿刺將血 液收集於含有EDTA 2g/dl的試管中，並立即離心，分離出血漿和紅細胞，然後貯存於-80°C 下。用PBS灌注腦，然後移出。
[0055] 澱粉樣蛋白分析
[0056] 用 50mM TRIS-HC1 pH 7.4、150mM NaCl、0. 2 % Nonidet P-40、l % CHAPS, 2mM EDTA、PMSF(200 μ M)、亮抑酶肽（1 μ M)、抑胃酶肽A(1 μ M)和鈣蛋白酶抑制劑 1(5 μ M)對勻漿的腦進行裂解。蛋白質提取物使用Α β 1-42免疫測定試劑盒（BioSource International, Belgium)用於 ELISA 試驗；ELISA 試劑盒保證在 10pg/mL(1-42)之前的良 好線性靈敏性。所有測量均進行一式三次。
[0057] 統計分析
[0058] 計算單向AN0VA，並使用Bonferroni事後檢驗來評價所報告的任何顯著性差異 (p〈0. 05)。
[0059] 結果
[0060] 從圖4中所報告的數據，SAM與SOD之間的協同作用是顯而易見的，並被下文報告 的統計分析所確證（總是參考圖4)。
[0061] B def.相對於 Ctrl :ρ〈0· 001
[0062] B def.+SAM 和 B def.+SOD 相對於 B def. :ρ〈0·001
[0063] B def.+SAM+SOD 相對於 B def. :ρ〈0·001
[0064] B def. +SAM+S0D 相對於 B def. +SAM 和 B def. +S0D :p〈0. 001。
【權利要求】
1. s-腺苷甲硫氨酸（SAM)和超氧化物歧化酶（SOD)組合在製備用於治療阿爾茨海默病 的藥物中的用途。
2. 如權利要求1所要求的用途，其中所述藥物抑制PS1和BACE的過表達。
3. 如權利要求1或2所要求的用途，其中所述藥物是口服施用的。
4. 如權利要求1的用途，其中所述藥物為產品，其以用於在阿爾茨海默病治療中同時、 分開或相繼施用的組合製劑的形式包含（i)S-腺苷甲硫氨酸和（ii)超氧化物歧化酶作為 唯一的活性成分。
5. 如權利要求4所要求的用途，其中S-腺苷甲硫氨酸為甲苯磺酸鹽、丁烷二磺酸鹽、 甲苯磺酸二硫酸鹽、二甲苯磺酸二硫酸鹽或單甲苯磺酸二硫酸鹽的形式，或包含於富含SAM 的釀酒酵母細胞中。
6. 權利要求1的用途，其中SAM以200至2000mg/天的劑量施用，SOD以50至lOOOmg/ 天的劑量施用。
7. 產品，包含（i)S-腺苷甲硫氨酸或其衍生物和（ii)超氧化物歧化酶作為唯一的活性 成分，所述產品為用於在阿爾茨海默病治療中同時、分開或相繼施用的組合製劑的形式。
8. 如權利要求7所要求的產品，其中SAM為甲苯磺酸鹽、丁烷二磺酸鹽、甲苯磺酸二硫 酸鹽、二甲苯磺酸二硫酸鹽或單甲苯磺酸二硫酸鹽的形式，或包含於富含SAM的釀酒酵母 細胞中。
【文檔編號】A61P25/28GK104189895SQ201410384204
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2009年2月25日 優先權日:2008年2月29日
【發明者】S·斯卡爾帕, A·富索, R·達米亞尼, M·羅西尼 申請人:諾西斯有限公司