Dna抗體及其應用的製作方法
2023-10-23 22:23:32
專利名稱：Dna抗體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗體，尤其涉及一種利用DNA作為抗體的技術。
背景技術：
免疫學的技術關鍵是製備特異性強、親合力大、效價高的結合特異性抗原的抗體。由於每種抗原都有幾個抗原決定族，由它免疫動物產生的抗體是針對多種抗原決定族產生的多個抗體，稱為多克隆抗體。單克隆抗體則在此動物免疫基礎上，由該免疫動物的單個抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合所形成的雜交瘤細胞經無性繁殖而來的細胞群所產生的，是針對單個抗原決定族的，所以它的免疫球蛋白屬同一類別，質地純一，因此特異性強，親和性一致。多克隆抗體則省去了單克隆抗體製作中的後期大部分工作，在免疫動物後直接取血清純化即為多抗，但所得抗體混雜，交叉反應多，且每次製備時都需大量抗原免疫動物，耗時耗錢，無論是特異性、親和性都比單抗差許多，故多抗逐漸為單抗取代。
雜交瘤技術的主要優點在於它的兩大基本特點，第一、由分離的克隆產生的單克隆抗體是一種十分明確的化學製品而不是一種可隨每個免疫動物，甚至隨替同一動物的不同次採血而變化的不明確的非同質混合物。永久培養可無限制地提供化學結構完全相同的單克隆抗體。第二，雜交瘤技術是用不純抗原製備純抗體的理想方法。
雜交瘤-單克隆抗體技術和DNA重組技術所取得的成就促進了基因工程抗體技術的發展，最初出現的基因工程抗體是八十年代初報導的人鼠嵌合抗體(chimeric antibody)，隨後出現人改型抗體(reshaped human antibody)、小分子抗體、抗體融合蛋白等在基因水平經過改造的單克隆抗體。從八十年代未期進入九十年代初期，在(1)大腸桿菌直接表達有功能的抗體分子片段(2)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增抗體可變區基因以及(3)通過噬菌體表面表達系統(phage display〕進行高效篩選等技術發展的基礎上建立了抗體庫技術，可通過基因工程手段在原核細胞體系直接克隆到特異性抗體的基因並生產該特異抗體。這一革命性的進展對抗體的製備、改造及新型抗體的開發帶來了深刻的影響，標誌著抗體技術經歷了第一代抗體——血清多克隆抗體，第二代抗體——單克隆抗體，發展到了第三代抗體--基因工程抗體。
基因工程抗體技術包括兩部分內容；-是用DNA重組技術對已有的單克隆抗體進行改造，包括鼠單克隆抗體的人源化、小分子抗體及抗體融合蛋白的製備。二是用抗體庫技術篩選、克隆新的單克隆抗體。由於基因工程抗體技術尚處於發展階段。探索性較強，許多技術沒成熟規範化的操作程序，不同的實驗室往往採用不同的技術方法。
真正以基因工程的方式製備抗體，始於1989年底英國劍橋winter小組與scrips研究所lerner小組創造性的工作。他們採用PCR方法克隆機體全部的抗體基因並重組於原核表達裁體，以標記抗原即可篩選到相應抗體，當時稱為組合抗體庫技術。90年代初期，這一技術有了進-步的發展，即將抗體基因(vH或Fd)與單鏈噬菌體的外殼蛋白融合併表達於噬菌體表面，以固相的抗原吸附相對應的噬茵體抗體，經多次「吸附-洗脫-擴增」即可獲得所需抗體。這是抗體產生的又-次重大技術革命。首先該技術將抗體的基因型及表型密切連繫起來。表達的噬菌體抗體(亦可為分泌型)可供功能檢測，擴增噬菌體並抽提DNA即可獲得相應抗體基因，便於測序或進一步的基因操作。其次該技術容量大，效率高，一般建庫可達108，基本包容了抗體多樣性的信息。第三，「吸附-洗脫-擴增」過程將抗體的選擇與再次擴增有機地結合起來，每輪操作可使特異性抗體富集102-103倍。噬茵體抗體庫技術不僅擺脫了細胞融合等繁雜的操作，而且可不經免疫劑備抗體，為製備人源抗體開闢了新途徑，這一點已為實驗所證實。
以上所用的抗體都有一個共同特點，即都是蛋白質，不管是多克隆抗體、單克隆抗體還是基因工程抗體，其基本原理都是一致的即利用重輕鏈可變區與抗原表位的相對特異性結合，通過小鼠體內篩選富集特異性抗體產生細胞或體外構建工程抗體文庫並高效篩選生產特異性抗體的克隆的技術來製作各種特異抗體。
但是多抗、單抗和基因工程抗體其作為蛋白質的本質決定了其固有的缺點，因為在蛋白質水平上的各種操作如表達、分離、純化以及診斷都需要較長的周期、繁雜的程序和較高的成本，以下以單克隆抗體和基因工程抗體來說明1、周期長單克隆抗體製作中動物的免疫周期至少一月以上，融合與篩選鑑定加上細胞克隆化至少需一月，再加上腹水製備以及抗原抗體純化等如能在三月內製備一個足夠高特異和靈敏的單抗的話，已經是很順利了。基因工程抗體雖然周期相對單克隆抗體較短，但也需一月以上，且前提是足夠多樣化〔＞109〕的工程抗體庫構建已成功，只需用特異抗原來篩選特異抗體。抗體庫的構建繁雜，至少一個月。但基因工程抗體的特異性和親和力都不如單抗。
2、程序冗長、製備成本高單抗製備中的所需操作冗長繁多，如動物免疫中的抗原製備和純化、動物房準備和動物飼養都有一定要求，定期取血檢測血清抗體效價；融合方案中骨髓瘤細胞的準備、細胞的融合和篩選、雜交細胞的克隆化、陽性克隆的篩選和維持、特異性和效價的鑑定、腹水的製備和抗體的純化等，可見一個單抗的製備需多少操作，其中所需的細胞培養和蛋白純化等所需的試劑價格高昂，加上時間長，成本自然就高。基因工程抗體抗體庫構建繁雜，而且要建立一個多樣化庫〔＞109〕能夠真正代表脾細胞中數以億萬計的變化多端的抗體，確實是一個難題；再加上要從如許之多的抗體中篩選到少數幾個特異抗體，並且還要求特異性和親和性都高，以及抗原抗體的純化，這一切依然使其代價高昂，操作冗雜。單克隆抗體的其他不足1〕對免疫原性差的抗原很難得到特異抗體或雜交瘤細胞；針對免疫原性差的抗原唯一途徑是增加有用的抗體形成細胞數，可用改進免疫方案或改造抗原以提高其免疫原件。但這些手段頗複雜，因還不完全清楚抗體形成細胞或其前體是否能形成好的雜交細胞。現有的資料提示，克服弱免疫原性的唯一途徑是聯合技術，即要有足夠的適宜B細胞，然後令其與骨髓瘤親代細胞融合，研究者採用此方法將B細胞數濃集5-10倍，其優越性是減少了篩選量。但這樣改進還不足以達到常規地獲得抗弱免疫原雜交瘤。濃集技術的實用價值得進一步研究。
2〕生產小鼠和大鼠以外品系動物，特別是家免和人的單克隆抗體存在的因難。
3〕目前尚無成功的人源化單克隆抗體，故不易用於藥物。基因工程抗體技術的不足1〕抗體庫的多樣化要求高〔＞109〕，構建繁雜，構建成本很高。
2〕作為蛋白抗體，仍然存在生產純化中的一系列問題，以及蛋白分子素有的免疫原性等問題，而且基因工程抗體在原核細胞表達模擬親本抗體結構與功能，畢竟不如親本抗體的親和力和特異性。
3〕篩選困難，由一個未經免疫的初級抗體庫中篩選出理想的抗體肯定不是一件輕鬆的事情，對許多抗原都無法篩選出理想的抗體。
4〕在靶藥物篩選應用中，雖然人源化工程抗體可避免其免疫原性，但是抗體純度要求很高，且該人源化工程抗體庫不易構建和篩選。
發明內容
由此可見，作為蛋白質的抗體所固有的矛盾是無法解決的，本發明創造性地提出DNA抗體的概念，即用具有特異性結合抗原活性的DNA分子用作抗體，主要解決蛋白診斷中由於抗原的千變萬化總是缺乏相應抗體以及抗體作為蛋白質不易研發、篩選、生產、純化與保存引起的成本高、周期長等一系列問題。
在研究DNA與蛋白的相互作用中，發現DNA與蛋白及其他大分子之間普遍存在著特異性的結合與互作，創造性的提出了DNA抗體的概念，意圖解決蛋白質抗體中存在的固有問題，創造出了三種DNA抗體文庫構建以及其高效篩選方法，以最終獲得DNA抗體。
上述的DNA抗體，按照以下步驟製備1)三種DNA多樣化工程抗體庫的構建；2)DNA抗體庫的篩選；3)DNA抗體的標記與擴增。
本發明創造性地提出DNA抗體的概念，即用具有特異性結合抗原活性的DNA分子用作抗體，主要解決以往蛋白抗體所固有的缺陷，以及由於抗原的多樣性總是缺乏相應抗體以及抗體作為蛋白質不易研發、篩選、生產、純化與保存引起的成本高、周期長等一系列問題，因為在蛋白組學和基因功能研究以及各種免疫學科研實踐中，經常會產生許多各種各樣的抗原需要臨時得到相應特異性抗體，而無論是單克隆抗體還是基因工程抗體的製作周期相當長，生產純化過程繁多，成本很高，大大限制了科研開發工作的進度和質量，從這種意義上講，DNA抗體的製作周期短，成本低，生產出來後，客戶甚至可以自己生產擴增，故將大大促進當今世界基因功能組學和蛋白質組學的發展進程。
而且由於蛋白質抗體分子量過大，免疫原性強，所以不易進入細胞，且不易用於靶藥物；而DNA抗體分子小，免疫原性低，易穿透組織，恰好解決了這些缺點。
而且DNA抗體在保證其一定的特異性和親和性的前提下，其各式各樣的抗體庫非常容易構建，且其篩選簡單易行，因為篩選是通過結合——洗脫—-PCR富集過程進行的，周期很短，而且DNA抗體的保存與複製擴增更加簡單，成本相當低廉；加上其易標記，分子小，經過進一步的優化，更可以提高其特異性和靈敏性；其小分子還可以避免免疫原性，成為抗體與核酸藥物的首選靶藥物。
最主要的是，通過DNA抗體，可以把對蛋白質的診斷和分析，轉移到對DNA的診斷和分析上來，從而為蛋白質組學帶來一個嶄新的技術平臺。譬如把對蛋白水平上的消減雜交轉移到基因水平上的消減雜交。可以說，DNA抗體將會為蛋白質的診斷打開一個全新的局面，其應用意義和前景是現在所無法預估的。三種抗體的優劣性比較
具體實施例方式
一、DNA抗體技術的基本原理針對各種核酸尤其是DNA的單克隆抗體的產生，暗示對於不同構象和序列的單鏈或雙鏈DNA，都有一個特異性結合的具不同構象和序列的抗體多變區或抗原結合位點的存在，反過來，這一切意味著對於各種不同蛋白的抗原表位，都應有一種可特異結合它的DNA單鏈或雙鏈DNA序列的存在。對核酸和蛋白相互作用的廣泛研究表明，體內存在各式各樣與DNA特異性相互作用的蛋白和酶，以及RNA對蛋白和酶的特異調控無不顯示了核酸序列和蛋白間的特異性相互作用的普遍存在。一般而言，DNA與蛋白質的特異性識別在於鹼基和胺基酸的氫鍵、靜電荷力、序列骨架構象之間的吻合、範德華力等的綜合作用。研究顯示，蛋白DNA結合位點的胺基酸突變會使這種特異性結合降低三個數量級。
DNA抗體技術基本上由三部分組成三種DNA多樣化工程抗體庫的構建；DNA抗體庫的篩選；DNA抗體的標記與擴增。二、DNA抗體具體技術路線1〕三種多樣化隨機DNA序列工程抗體庫〔雙鏈DNA隨機序列庫、單鏈DNA隨機序列庫、雜化雙鏈DNA隨機序列庫〕的構建DNA序列庫的多樣化是高效篩選出特異抗體的前提，故其DNA抗體庫的構建是很重要的。通過構建雙鏈DNA隨機序列庫、單鏈DNA隨機序列庫、雜化雙鏈DNA隨機序列庫來達到構建足夠量的多樣化隨機DNA序列的目的。對於雜環雙鏈DNA，由於柄環狀結構〔Stem-loop structure〕可穩定該分子結構並暴露可變序列，從而增加親和性和抗體的穩定性。而多價抗體比單價抗體更具親和力。先篩選出多個單價抗體，再試圖通過一序列聯起來形成雙價或多價抗體，兩單價抗體較靈活的連接在一起。考慮到其分子體積小，故抗原構象可能對單價抗體無多大影響，但對雙價抗體應有影響。
設計隨機序列5』-ggggggggggggatccaac-N59-CTGCAGGTCGACGCAT-3』及兩端帶特定引物(F1)ggggggggggggatccac和(R1)atgcgtcgacctgcag以供克隆；可PCR擴增克隆到T載體文庫構建得到隨機序列代表庫以保存備用。
用兩端引物F1和R1擴增12個循環，(94℃，15s；55℃，15s；72℃，15s)，即可得到雙鏈DNA隨機序列庫；以雙鏈DNA隨機序列庫為模板再用其中一條引物如F1引物做不平橫PCR擴增45個循環，(94℃，15s；55℃，15s；72℃，15s)，通過8％的PAGE膠分離純化，就可得到單鏈DNA隨機序列庫；以此單鏈DNA隨機序列庫為模板，在其3末端加oligo(dC)，75度中放10分鐘以去除單鏈DNA構象，並滅活末端轉移酶，在4度重新退火形成雜化雙鏈，通過8％的PAGE膠純化可分別得到雜化雙鏈隨機DNA序列、單鏈隨機DNA序列庫。
為便於在篩選過程中高效富集具特異性結合抗原活性的雜化雙鏈DNA，亦可採用另一種構建雜化雙鏈DNA隨機序列庫的方案，即在同一條DNA單鏈上自身摺疊形成柄環狀雜化雙鏈結構設計隨機序列5』-ggggggggggggggggatccaac-N50-cccccccccccccggggggggggggg -N50-CTGCAGGTCGACGCAT-3』，其中cccccccccccccggggggggggggg序列有利於雜化雙鏈構象的形成，即由該序列連接其兩邊隨機DNA序列並摺疊而成。同樣通過PCR富集，然後不平橫PCR並跑膠純化雜化雙鏈帶。
2〕多樣化隨機DNA序列抗體庫的篩選特異性抗原的準備將已純化好的抗原如在(100mM PIPES pH6.9，1mMEGTA，0.5mM MgSO4；100uL)溶液中包被在15個微孔板〔用於蛋白包被，購於Corning公司〕中過夜，另15個微孔板用以包被BSA或脫脂奶粉用於預雜交，一共以備15輪篩選之用，每孔約1-10ug。用PBS〔含0.1％Tween-20〕洗去多餘的抗原，用3％BSA或5％的脫脂奶粉在PBS中封閉微孔板30分鐘，用PBS〔含0.1％Tween-20〕洗三次，用篩選緩衝液(100mM PIPES pH6.9，1mM EGTA，5mM MgSO4，100mM NaCl〕洗一次。
預雜交用以上準備好的三種DNA隨機序列庫10ug在包被BSA或脫脂奶粉的微孔板中預雜交在篩選緩衝液中結合30分鐘。
雜交結合取已預雜交好的DNA隨機序列，轉移至包被好特異性抗原的微孔板中在篩選緩衝液中雜交，4℃，30分鐘。
清洗用篩選緩衝液洗去非特異未結合的隨機DNA序列，洗三次，每次30分鐘。
注意對不同的的抗原，應摸索其最佳的結合雜交與清洗條件。
3〕特異性DNA抗體的洗脫與PCR富集用等體積苯酚抽提獲取DNA，離心後吸取上清〔DNA部分〕，用乙醇和乙酸鈉沉澱DNA，以此DNA為模板，先用F1和R1引物PCR擴增富集雙鏈DNA，然後以其為模板不平橫PCR擴增單鏈DNA序列，用此單鏈DNA序列為模板在其末端加oligo-dC，75度去除構象、4度復性，以上皆跑PAGE膠純化相應富集了的雙鏈DNA、單鏈DNA序列、雜化雙鏈DNA序列。其PCR與不平橫PCR反應體系同。
4〕如上重複預雜交—雜交—清洗—洗脫-PCR富集的過程達15輪，最後得到三種特異性結合抗原的DNA序列〔單鏈DNA序列、雙鏈DNA、雜化雙鏈DNA序列〕。
5〕特異性DNA抗體的測序、保存與擴增一邊構建PCR-T克隆挑10個測序，選取看看哪種序列最多的幾個克隆，一邊直接送測序選取最高峰者作為DNA序列，如峰高明顯、背景較低，意味著該DNA抗體較特異、相對其他DNA隨機序列親和力較高。所得的克隆或DNA序列可用來作為模板保存，以備直接用來製備並標記DNA抗體。
有時候需要幾種DNA抗體的混合物，它們互相結合成的一種構象才能高效特異穩定結合抗原分子，故一般以篩選出來的序列作為模板直接進行擴增而無需分離出個別的序列；對於該特異序列混合物的保持，可利用結合在固相上的引物合成固定的模板，從而可以反覆使用，又不會顯著改變原DNA隨機序列的組成比例。當然，可以進一步篩選出單純的幾種序列，通過測序確定其最終組成。
6〕DNA抗體的標記和生產用以上篩選出來的特異性DNA序列為模板，以帶標記〔如地高辛、生物素、放射性元素如P32〕引物PCR擴增已篩選出來的特異性DNA序列，通過PAGE膠純化製備出相應的三種DNA抗體。如用地高辛或生物素標記，用二抗擴大信號也可。或直接用膠體金、放射性元素或其他可直接顯色或螢光激發標記〔注意用來標記的分子要儘可能小〕。
7〕DNA抗體特異性鑑定選取血清和類似抗原作對照，比較該特異DNA抗體對特異抗原及非特異抗原之間交叉反應的程度。方法可用ELISA、IFA法等。
8〕DNA抗體親和力鑑定親和力表示抗體與抗原結合的緊密程度，以親和常數表示。方法可用ELISA或RIA競爭結合試驗等。
9〕DNA抗體抗原結合位點序列的鑑定利用光化學交聯、蛋白酶切以及胺基酸測序來確定與該DNA抗體特異結合的抗原表位序列。
將抗原與DNA抗體混合在TE溶液中〔選用不同濃度NaCl〕，在冰上孵育20分鐘，以0.25ml轉移至矽化玻璃板上，在15瓦的滅菌紫外燈下〔距離8cm〕照射20分鐘，紫外照射可導致特異性結合的複合物中分子間的交聯，因此可增強DNA抗體的親和力和特異性。加TCA至終濃度10％，離心把蛋白抗原和DNA抗體的交聯複合物和其餘蛋白抗原沉澱下來，其餘未結合DNA部分不會沉澱下去。用10％TCA洗一次，用預冷丙酮洗三次，空氣乾燥。加8M尿素0.2ml至沉澱，用超聲儀溶解沉澱〔每次超聲10秒，最大功率，三次〕，待溶解後，繼續加NH4HCO3至終濃度2M尿素、0.1MNH4HCO3。按1∶25〔胰酶∶蛋白抗體複合物〕的質量比加入胰酶，37＂C，消化24小時。消化產物過離子交換柱，選取放射性最高的部分〔即DNA抗體特異結合的抗原表位肽段或胺基酸序列〕去測序〔注意該DNA抗體用放射元素P32標記〕。
10〕DNA抗體親和性和特異性及檢測靈敏度的提高a、通過增加篩選輪數從三種DNA隨機抗體庫中篩選出幾種特異性和親和性較高的抗體，由於每種DNA抗體所特異識別的是不同的抗原表位，可以聯合應用來提高特異性。如要提高DNA抗體的檢測靈敏度，可用P32標記該抗體。
b、每一種抗原的DNA抗體的產生，都必需同時給出一個最佳的結合和清洗條件，以提高該DNA抗體對特異抗原的特異性和親和力，並降低非特異性背景。
c、可用紫外交聯與蛋白酶切來確定該DNA抗體結合位點是否該抗原的特異性非保守序列，並且可以通過測序直接分析其結合的抗原表位的胺基酸序列。
d、可改變一系列條件以加大DNA抗體的濃度，從而加強DNA抗體與該抗原的親和力，應可以降低該抗原的最低檢測濃度。
e、可用紫外照射使特異性結合的DNA抗體與抗原之間產生交聯，SDS與鹽洗滌去非特異結合的DNA抗體，並且用標記引物原位PCR富集顯色來進一步提高該DNA抗體檢測的靈敏度和特異性。
f、通過把單價抗體改造成多價抗體，應可成倍增加抗體親和力和特異性。
g、重新構建DNA抗體文庫，如換用另一種DNA抗體文庫，增加隨機序列的長度等。
h、柄環結構與多價DNA抗體可提高其DNA單價抗體的親和性和特異性，雜化雙鏈的柄環結構可穩定並適當調節DNA抗體中抗原結合部位的構象，從而更好的和抗原特異結合；而通過把多個單價DNA抗體聯結成多價抗體，都會成倍增加DNA抗體的親和性和特異性。
i、對於雜化雙鏈DNA序列抗體庫，中間的GC序列可試用AT序列。四、應用該DNA抗體技術可廣泛應用於免疫印記、免疫組化、蛋白水平上的特異性基因調控、蛋白追蹤、抗體靶藥物篩選、親和層析、蛋白消減雜交等免疫學領域。
在免疫印記、免疫組化、蛋白水平上的特異性基因調控與蛋白追蹤、抗體靶藥物篩選的領域的應用，該DNA抗體的使用基本類似一般的抗體的使用方法。由於DNA的容易獲得，無論在時間上，還是在成本上，以上應用都被大大簡化了。如親和層析，如用蛋白抗體來作親和柱，其價格之高，有目共睹，而且如要自己做親和柱，從抗體的製備到親和柱子，這是一個漫長而又成本很高的過程。
而且DNA抗體同樣可如同其他抗體一樣應用於各領域(1)免疫原性組織相容性抗原或分化抗原，(2)分化抗原、腫瘤抗原或其他細胞表面抗原，這些抗原缺乏多形性，在同種系統中無免疫原性，但在異種免疫中卻可以被識別。(3〕病毒和細菌抗原；〔4)各種蛋白質、核酸和糖表面的單一抗原決定族。這類抗體使我們能夠鑑定和分離細胞亞群、區分細胞發育的不同階段、更為精確地進行組織分型、提純較小的表面抗原、精細地鑑定微生物以供診斷和流行病學研究，以及對各種生物大分子進行更可靠的各種免疫學分析和診斷。
蛋白消減雜交是一種新的在蛋白水平上系統尋找蛋白表達差異的方法，由於這些在病理細胞和正常細胞間有表達差異的蛋白之間必然存在某種信號通路或聯繫，從而為細胞內系統各種複雜的信號通路和大分子相互作用提供了直接在蛋白水平上的真實數據。以往研究基因的表達差異，大部分都是在RNA水平上，由於忽略了其轉錄後修飾、翻譯水平和翻譯後水平的變化，故不能真實的反映其最終在蛋白水平上的變化；至於在蛋白水平上的差異顯示的研究，由於蛋白操作的困難，現在多半是用抗體晶片的方法，只能尋找已知蛋白的表達差異變化，無法尋找到新的蛋白，而且目前抗體晶片成本極高，其使用要求精密儀器，普通科研院所買不起，並且抗體晶片所含抗體數量有限，遠遠不如基因晶片的數量，並不能真正達到高通量篩選的目的。而本方法卻通過把在蛋白水平上的表達差異，通過DNA抗體轉移至DNA水平上的差異顯示，從而簡捷的達到了開放式的高通量篩選表達差異蛋白的目的，為蛋白相互關係的系統研究和基因功能的系統探索提供了一條捷徑，而且該技術普遍適用於各大中小科研院所及公司。蛋白消減雜交技術其基本原理是通過DNA隨機序列抗體庫進入細胞體內結合特異性抗原蛋白分子，如果某蛋白分子有表達數量差異，那麼其結合的特異性DNA序列也會表現出相應的數量變化來，從而把在蛋白水平上的消減雜交轉移到對DNA序列的消減雜交上來。
1〕以上3種DNA隨機序列庫與經過處理固定了的對照細胞和靶細胞〔活體〕〔細胞數量以及其他條件儘可能一致〕孵化，在一定條件下該DNA隨機序列庫將進入細胞並特異性結合其對應分子，然後洗去未進入細胞序列或非特異結合細胞蛋白的DNA抗體。
2〕用苯酚氯仿裂解細胞並抽提蛋白質，取上清〔含DNA序列〕DNA，用真空乾燥機濃縮DNA或酒精沉澱DNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA隨機序列庫。
3〕對靶細胞和對照細胞的隨機DNA序列庫進行消減雜交〔用試劑盒〕後，注意在消減之前加一已標記內對照序列以檢測消減雜交效果；PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫並測序，選取幾個到幾十個克隆，用標記引物擴增製備相應類型的DNA抗體，並用血清檢測其特異性，去掉非特異結合血清的DNA序列。
4〕用此DNA抗體在該細胞內標記結合相應蛋白分子並形成複合物，先用紫外照射數十分鐘以形成共價交聯，然後跑SDS-PAGE膠分離檢測已標記DNA-蛋白複合物，切下條帶，純化測序。或者如非膜蛋白，而且紫外照射形成交聯複合物的效率低下，可溫和裂解，並用相應的引物-cellulose進行親和層析來分離純化DNA-蛋白複合物，亦可跑PAGE膠分離純化，測序獲得蛋白序列。
5〕如是膜蛋白，先用紫外照射交聯DNA分子和抗原分子，跑SDS-PAGE膠分離純化已標記DNA-蛋白複合物，切下條帶，純化測序。或如上用親和層析。五、具體製備實施例子微管蛋白為抗原篩選其特異性DNA抗體1〕選用單鏈DNA隨機序列工程抗體庫來進行微管蛋白的DNA抗體篩選設計隨機序列5』-ggggggggggggatccaac-N59-CTGCAGGTCGACGCAT-3』及兩端帶特定引物(F1)ggggggggggggatccac和(R1)atgcgtcgacctgcag以供克隆；可PCR擴增克隆到T載體文庫構建得到隨機序列代表庫以保存備用。N59指59個核甘酸組成的隨機序列。
用兩端引物F1和R1擴增12個循環，(94℃，15s；55℃，15s；72℃，15s)，即可得到雙鏈DNA隨機序列庫；以雙鏈DNA隨機序列庫為模板再用其中一條引物如F1引物做不平橫PCR擴增45個循環，(94℃，15s；55℃，15s；72℃，15s)，通過8％的PAGE膠分離純化，就可得到單鏈DNA隨機序列庫；2〕多樣化隨機DNA序列工程抗體庫的篩選將已純化好的微管蛋白抗原加在(100mM PIPES pH6.9，1mM EGTA，0.5mM MgSO4；100uL)溶液中包被在20個微孔板〔用於蛋白包被，購於Corning公司〕中過夜，另20個微孔板用以包被BSA或脫脂奶粉用於預雜交，一共以備20輪篩選之用，每孔約1-10ug。用PBS〔含0.1％Tween-20〕洗去多餘的抗原，用3％BSA或5％的脫脂奶粉在PBS中封閉微孔板30分鐘，用PBS〔含0.1％Tween-20〕洗三次，用篩選緩衝液(100mM PIPES pH6.9，1mM EGTA，5mM MgSO4，100mM NaCl)洗一次。
預雜交用以上準備好的單鏈DNA隨機序列庫10ug在包被BSA或脫脂奶粉的微孔板中預雜交，在篩選緩衝液中結合30分鐘。
雜交結合取已預雜交好的DNA隨機序列，轉移至包被好特異性抗原的微孔板中在篩選緩衝液中雜交，4℃，30分鐘。
清洗用篩選緩衝液洗去非特異未結合的隨機DNA序列，洗三次，每次30分鐘。
注意對不同的的抗原，應摸索其最佳的結合雜交與清洗條件。
3〕特異性DNA抗體的洗脫與PCR富集用等體積苯酚抽提獲取DNA，離心後吸取上清〔DNA部分〕，用乙醇和乙酸鈉沉澱DNA，以此DNA為模板，如上先用F1和R1引物PCR擴增富集雙鏈DNA，然後以其為模板不平橫PCR擴增單鏈DNA序列，跑8％的PAGE膠純化。
4〕如上重複預雜交—雜交—清洗—洗脫-PCR富集的過程達20輪，最後得到特異性結合抗原的DNA序列。
5〕特異性DNA抗體的測序
把以上所篩選得到的特異DNA抗體作為模板，以F1和R1來擴增所得PCR產物構建入T載體，隨機挑選20個克隆測序，作同源性比較。所得的克隆或DNA序列可用來作為模板保存。測序篩得以下序列〔不含引物序列〕ATGCTCGCGCCTGCTGTGTTGTTGCTTGGTTTGGTCTTTTTTTGGTTTGTTTTGGGTT；GAATTCGTTTGTGTGCGGAGGTGGTTGTTTGTTTTTTTGTTTCTTTGTTTTGTTTG；AGATATGGTTTTGTTGTGCGTTATGTTGTGTTTTTGGGGTCTCTTTTTGGGTGTTTTGT；TTGGTGGGTTGTAGGCAGGCGTGGGCACTGTTTGAGAAGGACGTGTTTGGTCTAT；6〕DNA抗體的標記和擴增用以上篩選出來的特異性DNA序列為模板，以帶標記〔如地高辛、生物素、放射性元素如P32〕引物PCR擴增已篩選出來的特異性DNA序列，通過PAGE膠純化製備出相應的DNA抗體。
7〕DNA抗體特異性鑑定親和力鑑定由於微管蛋白是從小牛腦裡純化出來的，故選取小牛血清和類似抗原如肌動蛋白、纖維蛋白作為非特異抗原對照，比較該特異DNA抗體對特異抗原及非特異抗原反應的特異性；同時選用篩選之前的單鏈DNA隨機序列作對照，比較篩選所得特異DNA抗體序列和篩選之前的隨機DNA序列對微管蛋白的特異結合。用ELISA方法進行檢測，結果表明篩選所得特異DNA抗體對微管蛋白的結合力顯著大於篩選之前的隨機序列，也顯著大於對非特異抗原的結合。同時，對於非特異抗原的結合，特異DNA抗體和篩選之前的DNA隨機序列沒有明顯差別。
8)親和力鑑定親和力表示抗體結合抗原的能力，用DNA抗體—抗原複合物的解離常數(KD)的倒數來表示。KD為引起50％最大效應時(50％受體被佔領)的摩爾濃度。以上DNA抗體解離常數為20-45uM。通過提高DNA序列抗體濃度，可以提高親和力。
權利要求
1.一種DNA抗體，其特徵在於其按照以下步驟製備1)DNA多樣化抗體庫的構建；2)DNA抗體庫的篩選；3)特異性DNA抗體的標記與擴增。
2.按權利要求1所述的DNA抗體，其特徵在於所述的DNA多樣化抗體庫的構建包括雙鏈DNA隨機序列庫、單鏈DNA隨機序列庫、雜化雙鏈DNA隨機序列庫的構建。
3.按權利要求1所述的DNA抗體，其特徵在於DNA抗體庫的篩選包括把DNA抗體庫的隨機DNA序列與抗原進行特異性雜交結合後，洗脫非特異結合的隨機DNA序列，並對特異性DNA抗體進行洗脫和PCR富集。
全文摘要
本發明公開了一種DNA抗體。所述的抗體按照以下步驟製成1)三種DNA多樣化工程抗體庫的構建；2)DNA抗體庫的篩選；3)DNA抗體的標記與擴增。本發明創造性地提出DNA抗體的概念，即用具有特異性結合抗原活性的DNA分子用作抗體，主要解決蛋白診斷中由於抗原的千變萬化總是缺乏相應抗體以及抗體作為蛋白質不易研發、篩選、生產、純化與保存引起的成本高、周期長等一系列問題。
文檔編號C07K16/00GK1482258SQ0313986
公開日2004年3月17日 申請日期2003年7月18日 優先權日2003年7月18日
發明者文劍, 文 劍 申請人:文劍, 劉輝, 文 劍