檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及其專用抗體的製作方法

2023-10-23 22:39:57 2

專利名稱：：檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及其專用抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及其專用抗體。
背景技術：
：鄰丙烯基苯酚(2-propenylpheno1，商品名稱銀果)是山東省農業仿生應用工程研究中心開發研製的新型農用殺菌劑，已獲得了國家發明專利(ZI97121037.3)和農藥臨時登記(防治番茄灰黴病)，現已批量生產。它是以銀杏中的殺菌、抑菌活性化合物的化學結構為模板.經結構簡化後通過人工模擬化學合成得到，分子量為134，分子式為C^。0。田間藥效試驗證明，鄰丙烯基苯酚可有效防治草莓白粉病、番茄灰黴病、蘋果腐爛病、玉米大斑病等病害。但是殺菌劑用量過多，會在農產品中殘留，影響人的身體健康。目前，鄰烯丙基苯酚的分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法等。這些方法存在如下主要局限樣品前處理時間長，實驗設備昂貴，試劑等成本高；對於大量樣品的測定有一定的困難，尤其是在快速檢測果實中的農藥殘留量時，這些方法都顯得無能為力。
發明內容本發明的一個目的是提供一種檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒。本發明所提供的檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒，包括抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體或抗鄰烯丙基苯酚的多克隆抗體；所述單克隆抗體或多克隆抗體可以是以具有如下結構的抗原為免疫原得到的其中，所述抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體具體可以是由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細扭系mAb225tt分泌產生的。由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細胞系mAb225tt分泌產生的抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體也屬於本發明的保護範圍。本發明所提供的抗鄰烯丙基苯酚抗體，是用鄰烯丙基苯酚與對氨基苯甲酸衍生後的抗原免疫動物，然後從被免疫動物的血清中分離得到的。鄰烯丙基苯酚是小分子物質，不具備免疫原性，不能直接刺激動物產生抗體，要想製備鄰烯丙基苯酚的抗體，就必須把鄰烯丙基苯酚與相應大分子載體蛋白偶聯構建人工抗原，但因為其化學結構過於簡單在與蛋白連接前必須進行一步衍生才能繼續合成全抗原，並用此人工抗原免疫動物產生特異性抗體。本發明的另一個目的是提供一種製備鄰烯丙基苯酚抗原的方法。本發明所提供的製備鄰烯丙基苯酚抗原的方法，包括如下步驟1)將對氨基苯甲酸重氮化，得到重氮化對氨基苯甲酸；2)將所述重氮化對氨基苯甲酸與鄰烯丙基苯酚耦合，得到重氮化鄰烯丙基苯酚；3)將所述重氮化鄰烯丙基苯酚與載體蛋白偶聯，得到鄰烯丙基苯酚抗原。所述重氮化包括如下步驟將對氨基苯甲酸溶解於0.5-1.5MNaN02溶液中，對氨基苯甲酸在NaNO2溶液中的終濃度為67.6mM107.9mM，再向其中加入酸，反應，得到含有重氮化對氨基苯甲酸的溶液I;所述耦合包括如下步驟將鄰烯丙基苯酚溶解於甲醇中，得到溶液II，鄰烯丙基苯酚在溶液II中的終濃度為74.6mM111.9mM;將溶液I滴入溶液II中，反應3-5h，將pH值調至2-3，收集沉澱，即得重氮化鄰烯丙基苯酚。所述偶聯包括如下步驟將所述重氮化鄰烯丙基苯酚溶解於N,N-二甲基甲醯胺、二氧六環或二甲基亞碸中，再在避光條件下向其中加入N-羥基琥珀醯亞胺，再加入二環己基碳二亞胺，反應25h，取上清；將載體蛋白加入所述上清中，反應10-14h，得到鄰烯丙基苯酚抗原。其中所述N-羥基琥珀醯亞胺在反應體系中的終濃度可為47.8mM191.7mM;所述二環己基碳二亞胺在反應體系中的終濃度可為124.1mM489.5mM;所述載體蛋白在反應體系中的終濃度可為0.10mM~0.41mM。為了使效果更好，所述載體蛋白可以先在010"C條件下溶解於pH910的碳5酸鹽緩衝液中，再加入所述上清中。所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、蘭素蛋白(KLH)、卵清白蛋白(OVA)等。所述製備鄰烯丙基苯酚抗原的方法還可包括如下純化步驟將上述反應得到的鄰烯丙基苯酚抗原進行透析或過sephadexG-25柱以除去未聯結的鄰烯丙基苯酚及有機溶劑，然後冷凍乾燥以濃縮製備得到鄰烯丙基苯酚抗原。本發明的另一個目的是提供一種鄰烯丙基苯酚抗原。本發明所提供的鄰烯丙基苯酚抗原具有如下分子結構formulaseeoriginaldocumentpage6所述鄰烯丙基苯酚抗原具體可以是按照上述方法製備得到的。保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細胞系mAb225tt也屬於本發明的保護範圍。將上述任一所述的抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體和固相載體相偶聯得到的免疫親和吸附劑、或以所述免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱、或含有所述免疫親和吸附劑和所述免疫親和色譜柱的試劑盒、及其在分離純化鄰烯丙基苯酚中的應用也均屬於本發明的保護範圍。本發明的最後一個目的是提供一種檢測鄰烯丙基苯酚的方法。本發明所提供的檢測鄰烯丙基苯酚的方法，包括用前述任一試劑盒對待檢測樣品進行檢測的步驟。為取得更好的檢測效果，所述方法還可包括如下樣品前處理的步驟用丙酮提取待檢測樣品，取上清；將所述上清加入衍生液，反應，得到待測樣品液；所述衍生液是按照如下方法得到的將每35-45mg對氨基苯甲酸溶於0.5-1.5ml0.5-1.5MNaN0沖，再滴加O.5-1.5MHC1，反應，得到衍生液。詳細檢測方法如下1)取待檢測樣品(如植物組織)，用丙酮提取，取上清；將所述上清加入衍生液，反應，得到待測樣品液；2)用ELISA方法檢測待測樣品液；3)通過測定孔的吸光值來判定鄰烯丙基苯酚在果實中的殘留量，吸光值越小殘留量越大；也可通過孔中液體的顏色來判定鄰烯丙基苯酚在果實中的殘留量。也可以根據上述原理，利用本發明的鄰烯丙基苯酚抗體製備各種檢測鄰烯丙基苯酚含量的試劑盒，以便於現場快速檢測。本發明的鄰烯丙基苯酚抗原製備方法，利用重氮化方法對鄰烯丙基苯酚進行衍生，反應時間短，衍生率高，用於衍生的重氮化合物，可以提前製備，低溫可以保存12個月。本發明製備方法成本低，效果好，操作簡單，方便快捷。利用本發明方法得到的人工抗原免疫動物，可以快速高效地獲得CAH的單克隆抗體，且獲得的抗體的特異性好，檢測極限高。本發明的檢測鄰烯丙基苯酚的酶聯免疫試劑盒及檢測鄰烯丙基苯酚的方法，可用於檢測農產品(如植物組織)中鄰烯丙基苯酚的殘留量，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性好、靈敏度高、精確度強等特點，能夠現場監控且適合大量樣本的篩査。因此本發明檢測方法及其專用試劑盒將在農作物產品中鄰烯丙基苯酚藥物的殘留檢測中發揮重要作用。圖1為鄰烯丙基苯酚抗原的合成示意圖。圖2為鄰烯丙基苯酚人工抗原CAH-BSA的紫外掃描光譜照片。圖3為鄰烯丙基苯酚人工抗原CAH-0VA的紫外掃描光譜照片。圖4為非競爭性ELISA測定CAH單抗親和常數曲線。圖5為鄰烯丙基苯酚間接ELISA法標準曲線。圖6為鄰烯丙基苯酚樣品檢測照片，示不同時期採集的草莓果實樣品檢測顏色區別。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。鄰烯丙基苯酚購自山東京蓬生物藥業股份有限公司。實施例l、鄰烯丙基苯酚抗原(CAH抗原)的合成鄰烯丙基苯酚抗原的合成示意圖如圖1所示。一、鄰烯丙基苯酚免疫抗原(CAH-牛血清蛋白(BSA))的合成1、重氮化(1)取鄰烯丙基苯酚30mg，溶解在lml的甲醇中，蒸餾水稀釋至5mL，常溫下磁力攪拌。(2)取對氨基苯甲酸40mg，溶解在lml、1MNaN02中，再滴加1MHC1，澱粉碘化鉀試紙變藍時終止反應。(3)將步驟(2)得到的溶液緩慢滴加至不斷攪拌的步驟(1)得到的溶液中，4°C，12h後反應完全，pH值調至2-3時，有大量磚紅色沉澱析出，將沉澱離心；將沉澱溶解於蒸餾水中，調節pH值，當pH值為8-9時沉澱完全溶解，pH值為2-3時沉澱析出，過濾，收集沉澱；用lMHC1、蒸餾水衝洗沉澱三次，冷凍抽乾，得到磚紅色粉末，即為重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)。2、與牛血清蛋白(BSA)偶聯(1)取步驟l得到的重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)10mg，溶解在lml的N，N-二甲基甲醯胺中，常溫下磁力攪拌，得到溶液I。(2)向溶液I中加入IOmg的N-羥基琥珀醯亞胺，在避光下磁力攪拌，再加15mg二環已基碳二亞胺，4t下攪拌4h，離心，取上清液。(3)將30mgBSA用2mlpH為9.5的碳酸鈉緩衝液在4'C下攪拌溶解，得到BSA溶液。(4)將BSA溶液加入(2)中得到的上清液中，4'C下反應12h;將反應得到的液體裝入透析袋中，用PB透析液透析4d，每d換三次透析液，得到CAH-牛血清蛋白(BSA);分裝，經-40。C冷凍後，真空乾燥，放-20。C冰箱中。二、鄰烯丙基苯酚包被抗原(CAH-卵清蛋白(OVA))的合成1、重氮化(1)取鄰烯丙基苯酚30mg，溶解在lml的甲醇中，蒸餾水稀釋至5mL，常溫下磁力攪拌。8在lml、1MNaN02中，再滴加1MHC1，澱粉碘化鉀試紙變藍時終止反應。(3)將步驟(2)得到的溶液緩慢滴加至不斷攪拌的步驟(1)得到的溶液中，4°C，12h後反應完全，pH值調至2-3時，有大量磚紅色沉澱析出，將沉澱離心；將沉澱溶解於蒸餾水中，調節pH值，當pH值為8-9時沉澱完全溶解，pH值為2-3時沉澱析出，過濾，收集沉澱；用lMHC1、蒸餾水衝洗沉澱三次，冷凍抽乾，得到磚紅色粉末，即為重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)。2、與卵清蛋白(OVA)偶聯(1)取步驟1得到的重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)10mg，溶解在1ml的N，N-二甲基甲醯胺中，常溫下磁力攪拌，得到溶液I。(2)向溶液I中加入IOmg的N-羥基琥珀醯亞胺，在避光下磁力攪拌，再加15mg二環已基碳二亞胺，4X:下攪拌4h，離心，取上清液。(3)將30mg卵清蛋白(OVA)用2mlpH為9.5的碳酸鈉緩衝液在4。C下攪拌溶解，得到OVA溶液。(4)將OVA溶液加入(2)中得到的上清液中，4。C下反應12h;將反應得到的液體裝入透析袋中，用PB透析液透析4d，每天換三次透析液，得到CAH-牛血清蛋白(BSA);分裝，經-40。C冷凍後，真空乾燥，放-20r冰箱中。三、CAH-BSA免疫抗原、CAH-0VA包被抗原的鑑定將鄰烯丙基苯酚(AP)的免疫抗原CAH-BSA和包被抗原CAH-OVA及重氮化鄰烯丙基苯酚(CAH)進行紫外掃描，結果如圖2和圖3所示。結果表明，CAH-BSA和CAH-0VA的吸收峰，與AP、BSA和OVA的吸收峰相比，發生了明顯的變化，表明人工抗原CAH-BSA和CAH-OVA的偶聯是成功的。實施例2、製備鄰烯丙基苯酚單克隆抗體及其鑑定一、單抗的製備(一)雜交瘤細胞系的建立1、動物免疫將免疫原CAH-BSA溶於0.5mL生理鹽水中，加入等體積的完全佐劑後製成免疫原乳化劑，免疫6周齡雌性Balb/c小鼠。4周後行第二次免疫，再兩周後行第三次免疫，均使用加入等體積的不完全佐劑後製成免疫原乳化劑。在第三次免疫後第10d間接ELISA測定小鼠血清中抗體效價，效價高者進行下一步細胞融合。2、細胞融合無菌取材免疫過CAH-BSA的Balb/c小鼠脾臟，製成脾細胞懸浮液。分別吸取含lX108個脾細胞和2X107個骨髓瘤細胞的懸浮液，移至50mL離心管中。加不完全培養液，使細胞液總體積為30mL。充分混勻後，於IOOOxg離心7min，將上清棄盡。輕輕彈擊管底，使沉澱細胞鬆散成均勻糊狀。將離心管底部浸入37'C溫水中，一隻手均勻轉動離心管，另一隻手用lmL移液管將lraL50%PEG溶液沿離心管壁移入轉動的離心管。從移入到移完的時間控制在60s左右，然後立即將細胞懸浮液全部吸入吸管(時間控制在30s左右)，靜置30s後，再將其吹入離心管內(時間也控制在30s左右)。在5min內加入25mL不完全培養液以稀釋PEG，使PEG失去促融作用。於8000g離心7min，棄去上清。加入10mLHAT培養液，輕輕吹吸沉澱細胞，使其懸浮並混勻。將細胞懸浮液加入已鋪有飼養細胞的96孔培養板中，每個孔O.1mL。然後將培養板置於37。C和5%0)2的培養箱內培養。將融合後的細胞懸浮於HAT培養液中，置於37^和5%C02的培養箱內培養。根據情況每23d更換培養液一次，換液時吸去1/22/3培養液，再加入等量新鮮培養液。所用的培養液應按培養的時間不同而有所不同在融合後7d內用HAT培養液；第714d改用HT培養液；第14d以後則用普通的完全培養液。3、間接免疫酶聯吸附實驗(ELISA)篩選陽性雜交瘤細胞在細胞融合後第7d，每次換液收集雜交瘤細胞培養液，然後採用間接ELISA方法對每個細胞培養孔的培養液進行陽性雜交瘤細胞株的篩選。具體操作如下(1)包被用包被緩衝液將包被抗原稀釋至最佳工作濃度(2.5pg/mL)，用移液槍準確移至酶標板，每個孔IOOuL，置溼盒中於37'C溫育1h。(2)封閉棄去酶標板孔內的液體。每個孔加入封閉液150uL，置溼盒中於37'C溫育lh後，用洗滌緩衝液洗滌3次，每次90s(簡稱洗滌，下同)，然後拍幹。(3)加待測培養細胞上清樣品用抗體稀釋液將培養細胞上清樣品倍比稀釋後加入酶標板，每個孔IOOuL，每個濃度梯度設3個重複。37。C溫育lh後，洗滌，拍幹。(4)加酶標二抗用抗體稀釋液將酶標二抗(羊抗鼠IgG/服P)稀釋到工作濃度(1:5000)，加入酶標板，每個孔100nL，置於37。C溫育lh後，洗滌，拍幹。(5)加底物溶液向各酶標孔加新鮮配製的0PD底物使用液100uL，37"C溫育1530min。(6)終止反應每個孔加終止液50uL，終止底物顯色反應。(7)判定結果用酶標儀於492nm波長下測定各個孔內溶液的吸光值(OD艦)，若待測孔0D492大於或等於陰性對照孔的2.l倍，即認為是陽性值，從而得出血清的效價。其中，包被緩衝液的組成為0.85mol/L、pH9.6的碳酸緩衝液；封閉液的組成為用包被緩衝液配製成1%(質量百分含量)的明膠；洗滌緩衝液的組成為含0.05%(質量百分含量)Tween-20的0.01mol/LPBS(pH7.4);抗體稀釋液的組成為含0.01%(質量百分含量)Tween-20、0.1%(質量百分含量)明膠的0.01raol/LPBS(pH7.4);0.01mol/L磷酸緩衝液(PBS):pH7.4，配方為8.00gNaCl，0.20gKC1，0.20gKH2P04，1.15gNa2HP04'12H20;加蒸餾水至1000mL。結果，篩選得到分泌鄰烯丙基苯酚單克隆抗體的陽性細胞株。4、陽性雜交瘤細胞的克隆化採用有限稀釋法對篩選的陽性細胞株進行克隆，具體步驟如下於克隆前一天製備飼養細胞。將待克隆的雜交瘤細胞用加樣器反覆吹打均勻後，轉至24孔細胞培養板中，並進行細胞計數。根據計數結果，對細胞懸浮液做適當稀釋。取250個活細胞懸浮於4.6inL(終體積)培養液中(此時平均每0.1mL溶液中含5個細胞)，接種96孔培養板，每個孔0.1mL，共36個孔。將4mL培養液加入到餘下的1.0mL細胞溶液中(此時平均每O.1mL溶液中含l個細胞)，將此細胞液接種至其次的36孑L，每個孔0.1mL。向剩餘的1.4mL細胞懸浮液中補加培養液1.4mL(此時平均每O.lmL溶液中含0.5個細胞)。混勻後，將其接種於剩餘的24孔，每個孔0.1mL。將培養板置於37°(3和5%0)2孵箱中培養。適時進行換液和檢測。有多孔陽性時，應儘可能取單克隆孔進行再次克隆，直至所有細胞孔的培養液均為陽性。最後獲得穩定分泌單克隆抗體的細胞株，其分類命名為小鼠雜交瘤細胞系mAb225tt，該細胞株已於2009年2月26日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo.2905。(二)體外培養法製備單抗將已經建立的雜交瘤細胞CGMCCNo.2905置於細胞培養基中，置於37"C和5%C02孵箱中培養，每隔2d換一次細胞培養液，待細胞濃度大於105mg/ml時停止換液，持續培養到細胞全部死亡。收集培養上清，1500rpm，離心10分鐘，上清含有高水平的單克隆抗體，-20。C保存備用。所述細胞培養基為向DMEM培養基中添加胎牛血清，使胎牛血清在細胞培養基中的終濃度為20%(體積百分含量)，所述細胞培養基的pH為7.4。(三)體內誘生腹水法製備單抗抗體的大量製備採用體內誘生法。將液體石蠟(0.5mL/只)注入健康的Balb/c雌性小鼠腹腔內，12周後備用。將擴大培養的陽性克隆雜交瘤細胞吹落，於IOOOxg離心5min後收集細胞，棄上清。用不完全培養液將細胞懸浮，混勻，將細胞濃度調整至K)6個/mL。向已進行石蠟處理的小鼠腹腔內注射lmL/只的上述雜交瘤細胞。79d後收集腹水，於3000xg離心10min，棄脂肪層和細胞層，收集中間澄清層，置於-7(TC凍存。(四)單抗的純化步驟l:腹水的預處理(二氧化矽吸附法)取小鼠腹水，用等體積的巴比妥緩衝液稀釋。加二氧化矽粉末，室溫下不時搖動30min。於2000xg離心20min，即得澄清的腹水。步驟2:辛酸-硫酸銨沉澱法純化IgG向一份預處理過的腹水中加入2倍腹水體積的0.06mol/L乙酸緩衝液(pH5.0)。用O.1mol/LHC1調pH值至4.8。於室溫下攪拌，並在30min內逐滴加入辛酸(每lmL稀釋前的腹水加33uL辛酸)。在4i:靜置2h後，於15000Xg離心30min。棄沉澱，上清液經砂芯漏鬥過濾。向溶液中加入1/10腹水體積的0.1mol/LPBS，用1mol/LNaOH調pH值至7.4。將腹水置於4。C冰浴中，在30min內加入0.277g/mL的(NH4)2S04，使其飽和度達45%。靜置1h以上後，於10000xg離心30min。棄上清，將沉澱溶於適量的PBS(含137mmol/LNaCl、2.6mmol/LKC1和0.2mmol/LEDTA，pH7.4)中。在4。C於PBS中透析過夜。於10000Xg離心30min後，除去不溶性沉渣，澄清液即為初級純的抗體。步驟3:親和層析純化IgG抗體的進一步純化採用HiTrapProteinGHP親和層析柱進行。具體操作如下用10倍柱體積(約10mL)的結合緩衝液(20mmol/L磷酸鹽，pH7.0)平衡層析12柱。用直徑為0.45iim的過濾器過濾樣品以除去不溶物，然後與結合緩衝液按l:l(V/V)混合。然後用注射器進樣，再用IO倍柱體積(約IOmL)的結合緩衝液衝洗，以除去未結合雜蛋白。之後用25倍柱體積的洗脫緩衝液(0.lmol/L甘氨酸-鹽酸，pH2.7)洗脫樣品。收集洗脫液(收集試管事先加有1mol/LpH9.0的Tris-HC1中和液，其用量為IOO^L/mL收集液)。於5mmol/LPBS中充分透析，然後濃縮備用o體外培養法製備的單抗不做純化，直接做如下鑑定實驗。二、鄰烯丙基苯酚單克隆抗體的鑑定(1)抗體與類似物交叉反應用競爭性ELISA測定鄰烯丙基苯酚與其結構或功能類似物之間的交叉反應。將Mabs進行濃度稀釋後，以等體積分別與系列倍比稀釋的類似物混勻後，室溫反應15min。然後加至已包被處理的酶標板中。用於ELISA分析的包被抗原濃度為50.0pg/mL，抗體濃度為25ng/mL。其餘步驟同間接免疫酶聯吸附實驗(ELISA)篩選陽性雜交瘤細胞的實驗步驟。根據0D492值繪製標準曲線，計算各類似物的抑制率，結果見表l。表1、抗體與鄰烯丙基苯酚及其結構類似物或相關物質的交叉反應tableseeoriginaldocumentpage13a,競爭物濃度達到10,000ng/mL，無抑制檢出。(2)抗體類型檢測用Pierce公司的單抗類型檢測試劑盒對CAH單抗類型進行檢測，通過0D值來進行判斷。結果如表2。結果表明抗體為IgGl類，表2、CAH單抗類型輕鏈為K型。抗體類型輕鏈類型IgGlIgG2aOD值1.3350.083IgG2bIgG3IgA0.0680.2180.097IgM0.058K2.0810.126(3)親和常數檢測用非競爭ELISA方法測定抗體的親和常數，包被抗原稀釋的倍數依次為1:2000，1:4000，1:8000,1:16000，抗體從1:1000倍開始2倍稀釋至1:1024000。用得到的OD值和抗體濃度製作曲線(圖4，其中BO和B分別為沒有CAH和有CAH時的OD值)。再根據公式計算得出CAH單抗的親和常數，計算公式為K=(n-1)/2(n[Ab，]-[Ab])，其中n為抗原的稀釋比，[Ab，]代表抗原濃度較高的吸收值Amax的一半、[Ab]代表抗原濃度較低的吸收值Amax的一半。最後計算得出CAH單抗的親和常數為4.47X109M—'，說明CAH單抗與CAH的結合能力很強。實施例3、製備鄰烯丙基苯酚多克隆抗體(1)取8-10周齡的Balb/C雌性小白鼠為實驗動物。實驗免疫劑量基礎免疫為0.25-2.0mg/kg，加強免疫劑量為0.5-2.0mg/kg。(2)基礎免疫用無菌水稀釋實施例1中得到的CAH-BSA免疫抗原，無菌過濾器過濾後加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，直到滴入水中不擴散。用乳化好的免疫抗原採用背部皮下多點注射動物，注射0.2mL。(3)加強免疫採用不完全弗氏佐劑乳化免疫抗原，方法同(2)。每隔3-4周進行加強免疫，腹腔與背部輪換注射，從第三次免疫開始，每次免疫後第8-10d，從小鼠眼眶採血，測效價，待效價大於l:10000後，採血，分離出抗血清，即得抗體。實施例4、多克隆抗體的抗體抑制試驗1)CAH-OVA包被抗原溶液的配製取CAH-OVA包被抗原，完全解凍後取8"L，用包被液(1.5gNa2C03，2.93gNaHC03,加1000mL蒸餾水，pH為9.6)按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、141:8000、1:16000、1:32000、1:64000進行稀釋。96孔酶聯板用蒸餾水洗滌後，每孔加入所配的包被抗原液100uL，於37"C溫箱中溫育3h。2)配製CAH的標樣溶液取實施例1中製得的重氮化鄰烯丙基苯酚(即CAH)作為標準品，用樣品稀釋液(8.0gNaCl，0,2gKH2P04,2.96gNa2HP0412H20，1mlTween-20，1g明膠，加IOOOmL蒸餾水，pH為7.5)配成2000ng/mL供試標樣溶液，以樣品稀釋液作對照即Ong/mL。取出酶聯板，棄去孔內液體，用洗滌液(8.0gNaCl，0.2gKH2P04，2.96gNa2HP0412H20，1ralTween-20，加1000mL蒸餾水)洗4次後甩幹，每孔加入50uL標準品。3)CAH抗血清稀釋液的配製取實施例3的小白鼠抗血清，用樣品稀釋液依次按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000進行稀釋。每孔加入50uL抗血清稀釋液，於37、C溫箱中溫育30min。棄去孔內液體，用洗滌液洗4次後甩幹。4)酶標二抗反應每孔加入經1:2000稀釋的用常規方法製備的HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)樣品稀釋液溶液IOOuL，放入37'C溫箱中溫育30min。用洗滌液洗滌4次，甩幹。5)顯色每孔加入底物0PDH202溶液100uL，37。C溫箱中溫育10min後用50uL2MH2S04終止反應。在酶聯儀上測定492nm波長下的吸光度值。實驗設3次重複，結果取平均數，數據如表3所示。表3、CAH抗1tableseeoriginaldocumentpage15主(f表示無CAH，lb表示2000ng/mlCAH由表3可以看出，當包被抗原與抗血清濃度適宜時，就有抑制現象，即2000ng/mL孔與0ng/mL孔的吸光度度值有差別，2000ng/mL孔吸光度值小，0ng/mL孔吸光度值高；當包被抗原稀釋度為1:8000，抗血清稀釋度為1:32000時，零水平與標準品的吸收值之差最大，此時抑制為最好。說明，本發明的抗原能製備出抑制較好、檢測極限較高的抗體。實施例5、建立鄰烯丙基苯酚標準曲線1)配製包被抗原稀釋液取CAH-OVA包被抗原，完全解凍後取luL，用包被液按1:8000稀釋。2)配製鄰烯丙基苯酚標準溶液取鄰烯丙基苯酚標樣配製成0.5[Xg/mL的標準溶液，從中取出40uL，加入1.96mL的樣品稀釋液中，即得10ng/mL標準樣溶液，再依次配成5ng/mL、4ng/mL、3ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL及0.0ng/mL共10個濃度。3)配製抗血清稀釋液取小鼠抗血清，用樣品稀釋液按l:32000稀釋。4)點板，將96孔酶聯板用蒸餾水洗滌後，每孔加入所配的包被抗原稀釋液100ixL，於37'C溫箱中溫育3h。取出酶聯板，棄去孔內液體，用洗滌液洗4次後甩幹，每孔加入經系列稀釋的鄰烯丙基苯酚各濃度標準液50UL，再加入抗血清稀釋液50uL。放37。C溫箱中溫育30min。棄去孔內液體，用洗滌液洗4次後甩幹。5)加酶標二抗每孔加入經1:1000稀釋的服P-山羊抗小鼠IgG(H+L)樣品稀釋液溶液100uL,放入37"C溫箱中溫育30min。用洗滌液洗滌4次，甩幹。6)顯色每孔加入底物OPD-仏02溶液100ixL，37。C溫箱中溫育10min後用50uL2MH2S04終止反應。在酶聯儀上測定492nm波長下的吸光度值。實驗設3次重複，結果取平均數，所得數據換算即得如圖5所示的標準曲線，圖中曲線的橫坐標為鄰烯丙基苯酚各濃度(ng/mL)的自然對數，縱坐標用鄰烯丙基苯酚各濃度吸光度值的logit值表示。Logit值的計算方法如下B/B0BLogit(B/B0)=ln-=ln-l-B氾OBO-B其中BO是Ong/ml孔的吸光度值，B是其它濃度的吸光度值。)本發明的抗原及由其得到的單克隆抗體或多克隆抗體可用於檢測農作物組織(如果實)中鄰烯丙基苯酚殘留。實施例6、草莓果實中鄰烯丙基苯酚殘留的測定1)20g草莓果實用搾汁機搗碎後加50mL丙酮離心，取上清液，重複三次合併上清，減壓濃縮至2mL加入提前製備好的衍生液lOOuL(衍生液的配製方法為取對氨基苯甲酸40mg，溶解在lml、1MNaN02中，再滴加1MHC1，澱粉碘化鉀試紙變藍時終止反應，得到衍生液)，得到待測樣品液；2)取CAH-OVA抗原，用包被液按l:8000稀釋，將96孔酶聯板用蒸餾水洗滌後，每孔加入所配CAH-OVA抗原稀釋液100uL，於37。C保溫3h;3)取小鼠抗血清，用樣品稀釋液1:32000稀釋，得抗血清稀釋液；4)取出酶聯板，棄去孔內液體，用洗滌液洗4次後甩幹，加入待測樣品液50uL，再加入50uL抗血清稀釋液，對照加入100uL水，放37。C保溫箱中保溫30min;5)棄去孔內液體，用洗滌液洗4次後甩幹後，每孔加入經1:2000稀釋的服P-山羊抗小鼠IgGlOOuL，放入37。C保溫箱中保溫30min;6)酶聯板用洗漆液洗滌4次甩幹後，每孔加入底物0PDH2(V溶液10uL，37t:保溫箱中保溫10min後用50uL2M}12504終止反應。實驗設3次重複。結果如圖6所示，不同取樣時間的草莓果實提取液的孔顏色有梯度變化。圖中1號孔為空白對照，即未施藥草莓果實提取後的測定結果。從28號孔，分別為15d、13d、11d、9d、7d、5d、3d、0d採集的草莓果實樣品提取後檢測的結果。可以肉眼觀察到，隨著採樣時間的延長，果實中鄰烯丙基苯酚的含量遞減，該方法可以追蹤分析樣品中鄰烯丙基苯酚殘留量的動態變化，準確反應樣品中藥劑的含量。實施例7、添加回收實驗將不含鄰烯丙基苯酚的草莓按照實施例6的方法進行樣品前處理後，添加鄰烯丙基苯酚，使其終濃度分別為0.16pg/g、0.31ng/g、0.63嗎/g、1.25pg/g、2.50嗎/g、5.00pg/g。用上述單克隆抗體及包被原進行實驗，具體的實驗方法如下1)取CAH-0VA抗原，用包被液按l:8000稀釋，將96孔酶聯板用蒸餾水洗滌後，每孔加入所配CAH-OVA抗原稀釋液100uL，於37。C保溫3h;2)取單克隆抗體，用樣品稀釋液l:32000稀釋，得單抗工作液；3)取出酶聯板，棄去孔內液體，用洗滌液洗4次後甩幹，加入待測樣品液50uL，再加入50yL單抗工作液，對照加入IOOuL水，放37。C保溫箱中保溫30min;4)棄去孔內液體，用洗滌液洗4次後甩幹後，每孔加入經1:2000稀釋的服P-山羊抗小鼠IgGlOOnL，放入37'C保溫箱中保溫30min;5)酶聯板用洗滌液洗滌4次甩幹後，每孔加入底物OPDH202溶液100^L，37。C保溫箱中保溫10min後用50uL2MH2S(X終止反應。每個實驗重複3次，統計回收率。結果如表4所示。表4、鄰烯丙基苯酚草莓添加樣品的回收率鄰烯丙基苯酚添加濃度(pg/g)平均回收率添加檢測值aC%,n=3)0.160.14±0.04880.310.28±0.11卯0.630.52±0.13831.251.05±0.05842.502.39±0.07955.004.64±0.0393數據來自三次重複平均值；±標準偏差權利要求1、一種檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒，包括抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體或抗鄰烯丙基苯酚的多克隆抗體；所述單克隆抗體或多克隆抗體是以具有如下結構的抗原為免疫原得到的。2、根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體是由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細胞系mAb225tt分泌產生的。3、由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細胞系raAb225tt分泌產生的抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體。4、一種鄰烯丙基苯酚抗原，其分子結構如下5、一種製備鄰烯丙基苯酚抗原的方法，包括如下步驟:1)將對氨基苯甲酸重氮化，得到重氮化對氨基苯甲酸；2)將所述重氮化對氨基苯甲酸與鄰烯丙基苯酚耦合，得到重氮化鄰烯丙基苯酚；3)將所述重氮化鄰烯丙基苯酚與載體蛋白偶聯，得到鄰烯丙基苯酚抗原。6、保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細胞系mAb225tt。7、將權利要求3所述的抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體和固相載體相偶聯得到的免疫親和吸附劑或以所述免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱或含有所述免疫親和吸附劑、所述免疫親和色譜柱的試劑盒。8、權利要求7所述的免疫親和吸附劑、所述免疫親和色譜柱、所述試劑盒在分離純化鄰烯丙基苯酚中的應用。9、一種檢測鄰烯丙基苯酚的方法，包括用權利要求1或2中所述試劑盒對待檢測樣品進行檢測的步驟。10、根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述方法包括如下樣品前處理的步驟用丙酮提取待檢測樣品，取上清；將所述上清加入衍生液，反應，得到待測樣品液；所述衍生液是按照如下方法得到的將每35-45mg對氨基苯甲酸溶於0.5-1.5ml0.5-1.5MNaN02中，再滴加0.5-1.5MHC1，反應，得到衍生液。全文摘要本發明公開了一種檢測鄰烯丙基苯酚的試劑盒及專用抗體。該試劑盒包括抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體或抗鄰烯丙基苯酚的多克隆抗體。所述抗鄰烯丙基苯酚的單克隆抗體是由保藏號為CGMCCNo.2905的小鼠雜交瘤細胞系mAb225#分泌產生的。本發明的檢測鄰烯丙基苯酚的酶聯免疫試劑盒及檢測鄰烯丙基苯酚的方法，可用於檢測農產品(如植物組織)中鄰烯丙基苯酚的殘留量，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性好、靈敏度高、精確度強等特點，能夠現場監控且適合大量樣本的篩查。因此本發明檢測方法及其專用試劑盒將在農作物產品中鄰烯丙基苯酚藥物的殘留檢測中發揮重要作用。文檔編號G01N33/577GK101498728SQ200910079260公開日2009年8月5日申請日期2009年3月5日優先權日2009年3月5日發明者劉西莉,劉鵬飛,夏源源,曹永松,李健強,王保民,羅來鑫申請人:中國農業大學