斜帶石斑魚瘦素LeptinA蛋白表達純化的方法及其應用的製作方法

2023-10-24 06:24:12 1

斜帶石斑魚瘦素Leptin A蛋白表達純化的方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了斜帶石斑魚瘦素Leptin A蛋白表達純化的方法及其應用，瘦素蛋白Leptin A表達純化的方法是將斜帶石斑魚瘦素Leptin A的編碼基因克隆至表達載體，得到重組表達質粒，轉化大腸桿菌，培養轉化的大腸桿菌，經誘導後收集菌體，純化、酶切，得到斜帶石斑魚瘦素Leptin A。本發明斜帶石斑魚瘦素Leptin A能夠影響斜帶石斑魚下丘腦細胞的NPY和AgRP1基因的表達，上調垂體細胞中促性腺激素LH-β的表達，豐富了魚類瘦素系統信號通路的理論，並可以用於製備魚類新型催產劑，具有誘導魚類生殖調控基因表達的作用。
【專利說明】斜帶石斑魚瘦素Leptin A蛋白表達純化的方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】，具體涉及一種斜帶石斑魚瘦素LeptinA的蛋白表達純化的方法及其應用。

【背景技術】
[0002]瘦素(Leptin)是一種由肥胖基因(Obese gene)編碼的分泌型蛋白質,通過受體介導，作用於靶組織，抑制食慾並參與調節能量代謝、神經內分泌和免疫反應等多種生理功能。瘦素基因蛋白LeptinA由161個胺基酸殘基組成，N端為20/21個胺基酸殘基的信號肽，第21位的丙氨酸為酶的水解位點，瘦素基因蛋白在分泌入血的過程中，去除其信號肽形成瘦素。成熟瘦素含141個胺基酸，分子量約16kDa，具有強親水性，單鏈、鏈內的二個半胱胺基酸殘基構成一個二硫鍵，是保持其穩定性和生物活性的關鍵部位。
[0003]瘦素具備激素的許多共同特徵，由分泌器官分泌入血，前體帶有信號肽，作用於下丘腦具有晝夜節律(晚上分泌多，白天分泌少)，脈衝性分泌等。瘦素只有在游離狀態下才具有活性，瘦素主要作用於中樞和外周兩個部分，影響機體的代謝。瘦素與神經內分泌系統之間形成了一個雙向閉合環路，一方面瘦素作用於下丘腦、胰腺、甲狀腺、腎上腺和性腺?』另一方面，又接受這些神經內分泌器官的負反饋調節，發揮其調節機體能量代謝的生理功能。
[0004]由於L印tin的受體存在於多種組織上，瘦素可在生殖軸的不同水平對生殖活動予以調節，這些發現說明，瘦素與機體的生長發育和生殖有密切的關係。Leptin除具有調控動物機體能量代謝平衡、脂肪的沉積和體重的生物學作用外，對動物初情期的啟動和正常發情周期的維持生殖器官和生殖腺的發育也具有非常重要的調節作用。
[0005]瘦素還可通過與下丘腦神經肽(NPY)神經元上受體結合而調控GnRH神經元的功能。NPY對生殖調節具有雙重作用正常雌激素情況下，下丘腦NPY促進GnRH分泌，低雌激素時NPY抑制GnRH分泌。瘦素啟動初情期可能通過抑制下丘腦NPY的基因表達與釋放，因性成熟前雌激素水平低，NPY抑制GnRH mRNA表達，瘦素通過NPY的介導，啟動GnRH神經元活動。同時發現禁食後LH分泌降低，而瘦素能抑制NPY mRNA的表達，促進LH分泌，提示NPY可能是能量平衡和生殖調節的聯繫通道，瘦素作為性成熟信號協同促性腺激素生長激素軸，與葡萄糖、胰島素、丙炔黑色皮質素(POMC)基因產物、神經肽Y(NPY)相互作用，刺激、調節GnRH的分泌，從而引起促性腺激素、性腺激素分泌，導致生殖系統的發育和青春期啟動。
[0006]在水產養殖業上，可以利用瘦素水平調控魚類攝食，從而控制魚類脂肪含量，提高水產品的適口性及營養價值；通過遺傳育種手段，培育瘦型或肥胖型魚類模型，以用於動物和人類肥胖的深入研究；另外，通過控制魚類體內瘦素水平增強魚類免疫力，提高魚類生產性能；研發瘦素產品，提高魚類生產性能並應用於相關的魚類疾病治療。
[0007]


【發明內容】

[0008]本發明的目的在於提供一種斜帶石斑魚瘦素LeptinA的蛋白表達純化的方法。
[0009]本發明的另一目的在於提供一種斜帶石斑魚瘦素LeptinA的應用。
[0010]本發明所採取的技術方案是:
斜帶石斑魚瘦素Leptin A蛋白表達純化的方法,包括以下步驟:
(1)斜帶石斑魚肝臟總RNA的提取；
(2)Leptin A cDNA的克隆:將上述提取的RNA進行反轉錄PCR合成第一鏈cDNA ;再以合成的cDNA為模板以SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2為引物，PCR擴增，獲得L印tin A的cDNA片段，並將其連入pTZ57 R/T載體中，進行擴大培養；
(3)斜帶石斑魚LeptinA原核表達載體的構建:
以含L印tin A cDNA片段的pTZ57 R/T重組質粒為模板，以SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4為引物，進行PCR擴增；PCR產物、pQE-30 UA載體分別經!,Hind III雙酶切後，進行連接，獲得LeptinA原核重組表達載體pQE30_Leptin A ；
(4)Leptin A重組基因的表達:
將重組表達載體pQE30-Leptin A轉化宿主大腸桿菌M15,獲得可表達重組外源蛋白Leptin A的重組菌；挑取陽性重組單克隆菌進行擴大和誘導培養，收集菌液，離心獲得菌體；
(5)Leptin A重組蛋白的純化:
將上述收集的菌體裂解、離心，收集沉澱，沉澱即為L印tin A重組蛋白的包涵體；再將包涵體洗滌乾淨，離心去上清，將沉澱中加入鹽酸胍裂解液，抽提得到可溶的LeptinA重組蛋白溶液，直接上樣經固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白，即可。
[0011]進一步的，上述步驟(4)中所述的擴大和誘導培養具體為:將挑取的陽性重組單克隆菌落接種至3 ml含Amp抗性的培養基中，37°C，200 rpm，振蕩培養12?16h ;按照1:100體積比接種到200ml含有Amp抗性的LB液體培養基中，30°C，200 rpm,培養至0D_達到0.4 ;加入IPTG至總濃度為0.8 mM,對重組菌誘導表達7h ;可以獲得最大的可溶性重組蛋白表達量。
[0012]進一步的，上述步驟(5)中所述的菌體裂解、離心的具體操作為:將收集的菌體用Bug Buster Master Mix混勻重懸,收菌後可以免除細胞破碎,室溫下將重懸的細胞液孵育
10?20min ;4°C下 16，OOOg 離心 20min,所得沉澱重懸於 Bug Buster Master Mix,吸打潤旋，重懸沉澱，潤旋I min ;4°C,5, OOOg離心15 min,移去上清,收集沉澱,沉澱即為包涵體。
[0013]進一步的，上述步驟(5)中所述洗滌的具體操作為:將包涵體重懸於經1:10稀釋的Bug Buster Master Mix中，體積為原培養液體積的一半,潤旋混勻，離心；取沉澱再加入相同稀釋的Bug Buster Master Mix重複潤旋2次，於4°C, 16，000 g離心15min並去除上清。
[0014]進一步的，上述步驟(5)中所述的鹽酸胍裂解液的pH為7.8，含500mmol/L NaCl。
[0015]斜帶石斑魚瘦素L印tin A蛋白在製備魚類餌料中的應用。
[0016]斜帶石斑魚瘦素L印tin A蛋白在製備魚類催產劑中的應用。
[0017]本發明的有益效果是:
本發明利用硬骨魚基因組資料庫結合分子生物學方法設計了特異性引物，PCR擴增克隆得到L印tinA基因的ORF序列，並構建表達載體，轉化到大腸桿菌中培養，可大量表達斜帶石斑魚瘦素LeptinA基因所編碼的蛋白。本發明斜帶石斑魚瘦素LeptinA能夠影響斜帶石斑魚下丘腦細胞的NPY和AgRPl基因的表達，上調垂體細胞中促性腺激素LH- β的表達，豐富了魚類瘦素系統信號通路的理論，並能有效促進產生的新型魚類催產劑。
[0018]通過對培養時間、誘導時間和溫度等條件的摸索和優化，使得到的蛋白的表達量較高，LeptinA處於不溶狀態,純化時要經過變性,復性,得到可溶的LeptinA重組蛋白；優化了重組蛋白的純化條件後，表達產物的超聲裂解液經固定化金屬配體親和層析，得到的蛋白純度在90%以上。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖I為斜帶石斑魚L印tinA成熟肽編碼序列PCR擴增產物電泳結果，其中，M為DS2000 DNA Marker, NC為陰性對照，I為帶酶切位點的L印tinA核苷酸片段；
圖2為斜帶石斑魚LeptinA基因的重組表達質粒構建圖；
圖3為斜帶石斑魚L印tinA重組蛋白表達的SDS-PAGE分析圖，其中，M為蛋白分子量標準，I為未誘導總菌，2為誘導後蛋白上清部分，3為誘導後蛋白沉澱部分；
圖4為斜帶石斑魚LeptinA重組蛋白的Western Blotting驗證，I為未誘導總菌,2為誘導後蛋白上清部分，3為誘導後蛋白沉澱部分；
圖5為斜帶石斑魚LeptinA重組蛋白純化過程的檢測圖，其中，M為蛋白分子量標準，
I:未誘導總菌蛋白；2 :誘導蛋白上清部分；3 ：ffashing Buffer過柱；4 ：Binding Buffer過柱；5 :誘導蛋白沉澱部分；6 :Elution Buffer I 過柱（100 mM 咪唑）；7 ：Elution Buffer2過柱（150 mM咪唑）；
圖6為斜帶石斑魚LeptinA對下丘腦細胞中的攝食因子表達的影響，LeptinA對攝食因子NPY和AgRPl的基因表達顯著下調，*表示與對照組有顯著性差異（P〈0. 05)，LEP表示LeptinA ；
圖7為斜帶石斑魚LeptinA對垂體細胞中的促性腺激素表達的影響，LeptinA對促黃體生成激素LH- β的mRNA水平表達顯著上調，*表示與對照組有顯著性差異（P〈0. 05)，LEP表不 LeptinA0

【具體實施方式】
[0020]斜帶石斑魚瘦素L印tin A蛋白表達純化的方法
(1)斜帶石斑魚肝臟總RNA的提取；
(2)Leptin A cDNA 的克隆；
2.1 cDNA第一鏈的合成：將上述提取和肝臟總RNA進行DNAase I處理去除基因組DNA汙染後，與RNA Oligo dT混合，進行反轉錄PCR，合成第一鏈cDNA ；
2.2斜帶石斑魚L印tinA cDNA全序列的克隆：以合成的第一鏈cDNA為模板，以SEQID NO: I (ATGGACTACACTCTGGCCCTG), SEQ ID NO: 2 (TCAGCAAGTCTCAAGATGGTCC)為引物，進行PCR擴增，獲得L印tin A的cDNA片段，並將其連入pTZ57 R/T載體中，進行擴大培養；
(3)斜帶石斑魚LeptinA原核表達載體的構建
3.I目的片段的擴增：以含L印tin A cDNA片段的pTZ57 R/T重組質粒為模板，以SEQ ID NO:3 (GGATCCGCTCCTCTGCCAGTGGAGGTG)和 SEQ ID NO:4 (AAGCTTTCAGCAAGTCTCAAGATGGTCC)為引物，進行PCR擴增；
3.2酶切、連接：將上一步獲得的PCR產物、pQE-30 UA載體分別經及I、Hind III雙酶切後，進行連接，獲得LeptinA原核重組表達載體pQE30_Leptin A ；
(4)Leptin A重組基因的表達
4.I :重組表達載體pQE30-Leptin A轉化宿主大腸桿菌Ml5,獲得可表達重組外源蛋白Leptin A的重組菌；
4.2 :挑取陽性重組菌單克隆菌落至3 ml含有Amp抗性的培養基中，37°C，200 rpm，振蕩培養12?16h ;按照1:100體積比接種到200ml含有Amp抗性的LB液體培養基中，30°C，200 rpm,培養至OD6tltl達到O. 4 ;加入IPTG至總濃度O. 8 mM,對重組菌誘導表達7h ;可以獲得最大的可溶性重組蛋白表達量，收集菌液，離心獲得菌體；
(5)Leptin A重組蛋白的純化
5.I收集包涵體：將上述收集的菌體用Bug Buster Master Mix混勻重懸,收菌後可以免除細胞破碎，室溫下將重懸的細胞液孵育10?20min ;4°C下16，OOOg離心20min，所得沉澱重懸於Bug Buster Master Mix,吸打潤旋，重懸沉澱，潤旋I min ;4°C, 5，OOOg離心15 min,移去上清,收集沉澱,沉澱即包涵體；
5. 2獲得可溶性目的蛋白：將包涵體重懸於經1:10稀釋的Bug Buster Master Mix中，體積為原培養液體積的一半，潤旋混勻，離心；取沉澱再加入相同稀釋的Bug BusterMaster Mix重複潤旋2次,於4°C, 16，000 g離心15min並去除上清；將沉澱中加入鹽酸胍裂解液洗滌，這樣抽提得到可溶的L印tinA重組蛋白溶液，直接上樣經固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白，即可。
[0021]優選的，所述鹽酸胍裂解液的pH為7. 8，含500mmol/L NaCl。
[0022]優選的，所述洗脫過程中的洗脫液為100?150mM咪唑洗脫液，最優選為150 mM咪唑洗脫液。
[0023]優選的，所述誘導過程中的IPTG濃度為O. 8 mM。
[0024]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。
[0025]實施例I斜帶石斑魚L印tinA的基因克隆
I、斜帶石斑魚肝臟總RNA的提取
取斜帶石斑魚(母coioiofes),體長30?40 cm,體重約I?I. 5kg,以冰浴麻醉約2min後，殺魚取樣，分離出肝臟組織，於液氮中速凍後，存放於_80°C冰箱備用。採用Trizol試劑法提取獲得斜帶石斑魚肝臟總RNA，其



OD260/280 " I. 90ο
[0026]2、Leptin A cDNA 的克隆 cDNA第一鏈的合成
取10 Pg斜帶石斑魚肝臟總RNA樣品進行DNAase I處理以去除基因組DNA的汙染，與RNA Oligo dT混合，進行反轉錄PCR，所得的產物置於_20°C保存備用。
[0027]斜帶石斑魚L印tinA基因cDNA全序列的克隆
根據紅鰭東方飩和黑青斑河豚的Leptin A序列，在Leptin A開放讀碼框兩端設計引物上遊序列如SEQ ID NO: I (ATGGACTACACTCTGGCCCTG)，下遊引物序列如SEQ ID NO: 2(TCAGCAAGTCTCAAGATGGTCC),以上述合成的第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增片段大小為500 bp。所得PCR產物上樣進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以低電壓電泳分離DNA片段，從凝膠中純化回收目的產物。將純化後的目的產物連接至PTZ57 R/T載體轉化DH5a大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。Blast同源比對分析表明，目的產物為L印tin A基因的cDNA序列片段。
[0028]實施例2斜帶石斑魚LptinA原核表達載體的構建
根據L印tin A編碼基因的兩端序列合成一對引物，上遊引物含有ife? HI切割位點，序列如 SEQ ID N0:3 (GGATCCGCTCCTCTGCCAGTGGAGGTG)所示，下遊引物含有歷III 切割位點，其序列如 SEQ ID Ν0:4 所示(AAGCTTTCAGCAAGTCTCAAGATGGTCC)。
[0029]以含有L印tinA編碼基因的pTZ57R/T質粒為模板，進行PCR擴增，得到特異擴增的單一條帶，產物大小為550 bp左右，電泳結果如圖1。將PCR擴增產物克隆至原核表達載體pQE-30 UA上，得到原核重組表達載體:pQE30-L印tin A (構建流程圖如圖2所示)。表達載體中的外源基因序列經測序鑑定正確。
[0030]實施例3重組斜帶石斑魚L印tin A基因的表達轉化表達宿主:
將上述構建好的原核重組表達載體pQE30-Leptin A轉化到大腸桿菌M15中，獲得可表達外源蛋白Leptin A的重組菌。用含氨節黴素(Amp)和卡那黴素(Kana)的培養基,進行篩選培養，挑取陽性單克隆菌落，進行菌液PCR驗證，PCR擴增的片段大小與目的片段大小相似，約550bp，驗證正確後，再進行後續的實驗。
[0031 ] 重組蛋白的誘導表達:
在誘導表達過程中，先對重組菌的培養時間、溫度和IPTG誘導濃度等條件進行優化，得到重組菌的最佳培養和誘導表達條件為:挑陽性克隆的單菌落至3 ml含有Amp抗性的培養基中，37 °C，200 rpm,振蕩培養過夜；按照1:100體積比接種到200ml含有Amp抗性的LB液體培養基中，370C，200 rpm,培養至OD6tltl達到0.4 ;加入IPTG至總濃度0.8 mM,對Leptin A蛋白表達重組菌誘導7h ;收集菌液，離心獲得菌體，加入IxN1-NTA結合緩衝液重懸菌體，超聲波破碎，離心，將上清和沉澱分開。
[0032]分別將誘導前的總菌體、誘導後的上清和沉澱加入蛋白Loading buffer,混勻，沸水浴中煮5分鐘，分別取1PL進行SDS-PAGE電泳和Western blotting檢測，檢測結果如圖3和圖4所示。從圖3的SDS-PAGE電泳結果中，在誘導後的沉澱蛋白中，在17 kDa的位置明顯出現了一條蛋白條帶，與預計的L印tin A重組蛋白的分子量大小一致，可看出Leptin A重組蛋白主要存在菌體沉澱中。從圖4的western blotting檢測結果中，可看出用His-tag的抗體能夠雜出陽性信號，表明表達出來的蛋白帶有His-tag標籤，分子量大小與預期的一致；LeptinA重組蛋白主要存在菌體沉澱中，且在上清中有少量的蛋白表達。
[0033]實施例4重組斜帶石斑魚L印tin A蛋白的純化
收集上述誘導表達後的菌體，用Bug Buster Master Mix混勻重懸,室溫下將重懸的細胞液孵育10?20min ;無需超聲波破碎，4°C下16，OOOg離心20 min收集沉澱，將沉澱重懸於Bug Buster Master Mix,吸打潤旋，重懸沉澱，潤旋I min ;4°C, 5，OOOg離心15min，移去上清，收集沉澱，沉澱即包涵體；將包涵體重懸於相當於原培養體系體積一半的經1:10稀釋的Bug Buster Master Mix中，潤旋混勻，離心；取沉澱再加入1:10稀釋的BugBuster Master Mix重複潤旋2次，於4°C, 16，000 g離心15min並去除上清；最終沉澱(LeptinA包涵體)加鹽酸胍裂解液洗滌，這樣抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上樣，經固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白，即可獲得純化的LeptinA蛋白，SDS-PAGE電泳圖如圖5所示。鹽酸胍裂解液的pH優選為7.8，含500mmol/L NaCl。洗脫過程中的洗脫液為100?150mM咪唑洗脫液，最優選為150 mM咪唑洗脫液。
[0034]上述純化後的蛋白的純度達90%以上。
[0035]實施例5斜帶石斑魚瘦素LeptinA對攝食相關因子表達影響的活性分析魚類的基因功能跟哺乳類的基因功能存在較大的差異，一些相關基因的功能也不一樣，比如說哺乳類大多數基因都只有一種，而硬骨魚類有兩種亞型，且功能不一樣，這就是硬骨魚跟哺乳的差異；如哺乳類L印tin基因主要是在脂肪細胞中表達，而魚類L印tin基因在脂肪細胞中不表達，主要在肝臟中進行表達。雖然，在哺乳動物類，Leptin基因在脂肪細胞的作用已經研究得比較清楚，其作為脂肪組織和中樞神經系統間網絡聯繫的外周信號，可能通過血腦屏障作用於中樞神經系統，影響攝食行為和調整自主神經系統活動等，參與保持機體脂肪量恆定的自穩態調節機制，而在魚類肝臟中表達的Leptin蛋白究竟怎樣起作用，目前仍沒有相關信息報導。
[0036]實驗方法:
取12條斜帶石斑魚體長30?40 cm,體重約1-1.5kg，以冰浴麻醉約2min後，殺魚取樣，分離下丘腦組織，將下丘腦(hypothalamus)放入6孔培養板中，將組織磨至下丘腦碎片，向各孔中加入2 ml細胞懸浮液,分別向各孔中加入含100ng/ml LeptinA蛋白的M199培養基2ml，並設置陰性對照組(未加L印tin A蛋白)。將細胞培養板置於27°C，5% CO2培養箱中培養，孵育3 h後收集各孔細胞，Real-time PCR檢測LeptinA蛋白對下遊攝食因子NPY，P0MC，AgRPl和AgRP2基因表達的影響。18S rRNA作為內參基因來校正各樣品模板量，反映L印tinA蛋白的活化能力及對上下遊基因表達的影響。每組6個平行樣品，數據用平均值土標準誤表示，*表示與對照組有顯著差異(P〈0.05)，檢測結果如圖6所示。結果表明，100 ng/ml的L印tinA蛋白孵育下丘腦細胞3小時後能顯著性的下調NPY和AgRPl的mRNA表達水平，而對POMC和AgRP2沒有顯著性影響。
[0037]實施例6斜帶石斑魚瘦素L印tinA對促性腺激素表達的影響
取12條斜帶石斑魚體長30?40 cm,體重約1-1.5kg，以冰浴麻醉約2min後，殺魚取樣，分離垂體組織(Pituitary)，將垂體放入6孔培養板中，將組織磨至碎片，向各孔中加入
2ml細胞懸浮液，分別向各孔中加入含100ng/ml L印tinA蛋白的M199培養基2ml，並設置陰性對照組(未加Leptin A蛋白)。將細胞培養板置於27°C，5% CO2培養箱中培養，孵育3 h後收集各孔細胞，Real-time PCR檢測LeptinA蛋白對垂體細胞中的促性腺激素FSH-β和LH-PmRNA表達水平的影響。18S rRNA作為內參基因來校正各樣品模板量，反映L印tinA蛋白的活化能力及對上下遊基因表達的影響。每組6個平行樣品，數據用平均值土標準誤表示，*表示與對照組有顯著差異(P〈0.05),檢測結果如圖7所示。結果表明，100 ng/ml的L印tinA蛋白孵育垂體細胞3小時後能顯著性的上調LH- β的mRNA表達水平，而對FSH- β沒有顯著影響。
[0038]綜上所述，石斑魚L印tinA是調控生長和生殖樞紐，當機體生長快的時候，生殖方面就弱；當機體處於生殖期的時候，生長速度就慢。在這個能量平衡的調控過程中，Ieptin起到關鍵的調控作用。魚類Leptin可以通過抑制攝食，同時加強促性腺激素水平的釋放來調控機體生殖活動。故可將斜帶石斑魚瘦素Leptin A蛋白或其重組蛋白作為催產劑促進魚類的生殖，也可應用於魚類餌料中。
【權利要求】
1.斜帶石斑魚瘦素LeptinA蛋白表達純化的方法，其特徵在於:包括以下步驟: (1)斜帶石斑魚肝臟總RNA的提取； (2)LeptinA基因cDNA的克隆:將上述提取的RNA進行反轉錄PCR合成第一鏈cDNA ；再以合成的cDNA為模板以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2為引物，PCR擴增，獲得L印tin A的cDNA片段，並將其連入pTZ57 R/T載體中，進行擴大培養； (3)斜帶石斑魚LeptinA原核表達載體的構建: 以含L印tin A基因cDNA片段的pTZ57 R/T重組質粒為模板，以SEQ ID NO:3和SEQID NO:4為引物，進行PCR擴增；PCR產物、pQE-30 UA載體分別經漢.Η !,Hind III雙酶切後，進行連接，獲得LeptinA原核重組表達載體pQE30_Leptin A ； (4)Leptin A重組基因的表達: 將重組表達載體pQE30-LeptinA轉化宿主大腸桿菌M15,獲得可表達重組外源蛋白LeptinA的重組菌；挑取陽性重組單克隆菌進行擴大和誘導培養，收集菌液，離心獲得菌體； (5)Leptin A重組蛋白的純化: 將上述收集的菌體裂解、離心，收集沉澱，沉澱即為L印tin A重組蛋白的包涵體； 再將包涵體洗滌乾淨，離心去上清，將沉澱中加入鹽酸胍裂解液，抽提得到可溶的LeptinA重組蛋白溶液，直接上樣經固定化金屬配體親和層析純化，收集洗脫的蛋白，即可。
2.根據權利要求1所述的斜帶石斑魚瘦素LeptinA蛋白表達純化的方法，其特徵在於:步驟(4)中所述的擴大和誘導培養具體為:將挑取的陽性重組單克隆菌落接種至3 ml含Amp抗性的培養基中，37°C，200 rpm，振蕩培養12?16h ;按照1:100體積比接種到200ml含有Amp抗性的LB液體培養基中，300C，200 rpm,培養至OD6tltl達到0.4 ;加入IPTG至總濃度為0.8 mM，對重組菌誘導表達7h ;可以獲得最大的可溶性重組蛋白表達量。
3.根據權利要求1所述的斜帶石斑魚瘦素LeptinA蛋白表達純化的方法，其特徵在於:步驟(5)中所述的菌體裂解、離心的具體操作為:將收集的菌體用Bug Buster MasterMix混勻重懸,收菌後可以免除細胞破碎,室溫下將重懸的細胞液孵育10?20min ;4°C下16, OOOg離心20min,所得沉澱重懸於Bug Buster Master Mix,吸打潤旋,重懸沉澱，潤旋I min ；4°C,5, OOOg離心15 min,移去上清,收集沉澱,沉澱即為包涵體。
4.根據權利要求1所述的斜帶石斑魚瘦素LeptinA蛋白表達純化的方法，其特徵在於:步驟(5)中所述洗漆的具體操作為:將包涵體重懸於經1:10稀釋的Bug BusterMaster Mix中，體積為原培養液體積的一半，潤旋混勻，離心；取沉澱再加入相同稀釋的Bug Buster Master Mix重複潤旋2次，於4°C, 16，000 g離心15min並去除上清。
5.根據權利要求1所述的斜帶石斑魚瘦素LeptinA蛋白表達純化的方法，其特徵在於:步驟(5)中所述的鹽酸胍裂解液的pH為7.8，含500mmol/L NaCl。
6.斜帶石斑魚瘦素L印tinA蛋白在製備魚類餌料中的應用。
7.斜帶石斑魚瘦素LeptinA蛋白在製備魚類催產劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK104450763SQ201410617687
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】劉曉春, 張輝賢, 李水生, 張勇, 蒙子寧, 林浩然 申請人:中山大學