一種檢測血磷的方法和試劑盒的製作方法
2023-10-23 15:49:27 2
專利名稱：一種檢測血磷的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種檢測血磷的方法和試劑盒。
背景技術：
磷是人體遺傳物質核酸以及人體能量轉換的關鍵物質三磷酸腺苷(ATP)的重要組分，也是多種酶和生物膜磷脂的組分，還是構成骨骼、牙齒的重要成分，對人體生命活動有十分重要的作用。血液中的磷主要有兩種存在形式，即有機磷和無機磷。其中，血液無機磷稱為血磷，以無機磷酸鹽的形式存在，如Na2HP04、NaH2P04、CaHPO4、MgHPO4等。血磷的高低對人體生命活動有直接的影響。血磷含量異常通常都是繼發性的，如血磷降低常見於維生素D缺乏、 高胰島素血症、長期腹瀉、吸收不良、甲旁亢、腎功能衰竭和輸注大量葡萄糖液後等，血磷升高常見於維生素D中毒、甲狀旁腺機能減退和腎濾過磷障礙等。無論血磷濃度升高或是降低，對人體生命活動都有極大的影響，嚴重時可加重病情，同時引發其他疾病。因此，檢測血液中無機磷濃度對於疾病的防治具有重要意義。目前，現有技術中檢測血磷的方法以酶法較為精確，酶法利用的原理是，在340nm 波長下每分鐘NADH的吸光度下降的速度與血磷濃度成正比，由此測算出血磷的濃度大小。 但是，酶法中的試劑要在340nm波長下測定，但是絕大多數可見光分析儀不具備340nm波長，這極大地限制了酶法的應用範圍，況且酶法的試劑價格昂貴，同樣不利於其推廣應用。鑑於上述原因，現有方法中有利用孔雀綠法使血磷直接與酸性孔雀綠鉬酸顯色劑作用，生成綠色複合物，然後在630nm波長下進行吸光度檢測，從而檢測出血磷的濃度。但是，在該方法中標準溶液通常單純採用磷酸鹽溶液，而待測血液樣品中，除了含有磷酸鹽溶液外，還含有蛋白等物質，是一個複雜的體系，這使得標準溶液和待測樣品用孔雀綠法形成的複合物的顏色不屬於同一個色系，導致通過比色法計算出的血磷濃度出現較大誤差，影響檢測的準確度。此外，單純採用磷酸鹽溶液作為標準溶液，用孔雀綠法反應生成的綠色複合物的顏色會隨時間延長而逐漸變淺，顯色的穩定性較差，這也造成現有孔雀綠法準確性不高的原因之一。
發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種檢測血磷的方法和試劑盒，使得該試劑盒和方法能夠提高檢測無機磷的準確度。為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案一種檢測血磷的方法，將標準溶液和待測血樣分別與由鉬酸銨、吐溫-20和孔雀綠組成的混合液在強酸下反應，然後再分別將各自反應得到的綠色複合物在630nm波長下檢測吸光度，最後通過比色法得到待測血樣的血磷濃度，所述標準溶液由磷酸二氫鉀、吐溫-20和牛血白蛋白組成。其中，樣品血磷濃度(mmol/L)=標準溶液濃度XA#/Afe，所述待測血樣與混合液的體積比為1 100，所述標準溶液與混合液的體積比為1 100，所述標準溶液中磷酸二氫鉀的濃度為1. 6mmol/L，所述標準溶液中吐溫-20的濃度為0. 5-1. Omol/L，優選為 0. 75mol/L，所述標準溶液中牛血白蛋白的濃度為0. 5-1. Og/L。其中，所述混合液中鉬酸銨的濃度為0. 3-0. 6mol/L，優選為0. 5mol/L，所述混合液中孔雀綠的濃度為0. 5-0. 8mol/L，優選為0. 7mol/L，所述混合液中吐溫-20的濃度為 0. 5-1. Omol/L，優選為0. 75mol/L，強酸優選為l-2mol/L的鹽酸。在強酸中，血磷與鉬酸銨反應生成磷鉬酸銨，而磷鉬酸銨與孔雀綠很快生成綠色離子締合物孔雀綠-磷鉬酸銨，利用此原理可將標準溶液和待測血樣通過比色法檢測樣品中血磷的濃度。但是，現有標準溶液與待測血樣組成體系不同，在檢測時會出現基質效應， 使得兩者反應所得的離子締合物分屬不同色系，這樣再通過比色法檢測就會出現很大誤差，因此，本發明在標準溶液中加入牛血白蛋白和吐溫-20，模擬待測血樣的體系環境，使標準溶液與待測血樣形成的離子締合物的顏色在同一個色系中，避免誤差的產生。在不同的非離子表面活性劑體系中，離子締合物的最大吸收峰不同，本發明使用的吐溫-20為非離子表面活性劑，最大吸收峰為620-650nm，具有乳化、擴散、增溶、穩定顯色作用，三苯甲烷類染料-孔雀綠在水溶液中生成質子化孔雀綠陽離子MGH2+，具有D3螺旋槳三維結構，當離子締合物形成後，若不加吐溫-20，隨放置時間的延長，水中離子締合物三維結構中苯環的弛豫會導致其顏色逐漸退去，若有吐溫-20，處於高黏度溶劑中苯環的弛豫過程會受阻，溶液顯色穩定性增強。此外，吐溫-20還增加了孔雀綠-磷鉬酸銨離子締合物的溶解度，增加反應液的吸光度。本發明還提供一種檢測血磷的試劑盒，包括由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 5-1. 0mol/L吐溫-20和0. 5-1. 0g/L的牛血白蛋白組成的標準溶液。其中，所述標準溶液中吐溫-20的濃度優選為0. 75mol/L。本發明所述試劑盒還包括由l-2mol/L 的鹽酸、0. 3-0. 6mol/L 的鉬酸銨、0. 5-1. 0mol/L 吐溫-20 和 0. 5-0. 8mol/L的孔雀綠組成的反應試劑。其中，所述反應試劑中鉬酸銨的濃度優選為0. 5mol/L,吐溫-20的濃度優選為 0. 75mol/L，孔雀綠濃度優選為0. 7mol/L。本發明試劑盒可以配製成單試劑，即由l-2mol/L的鹽酸、0. 3-0. 6mol/L的鉬酸銨、0. 5-1. 0mol/L吐溫-20和0. 5-0. 8mol/L的孔雀綠組成的反應試劑；由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 5-1. 0mol/L吐溫-20和0. 5-1. 0g/L的牛血白蛋白組成的標準溶液。本發明所述方法檢測血磷濃度具有較高準確度和精密度，試驗結果顯示，本發明所述方法檢測的結果在質控品的士2SD範圍內。此外，本發明對同一樣品進行重複性檢測， 各結果之間的標準差率(變異係數)為1.30%，小於標準的3%。上述試驗結果表明本發明具有很高的準確度和精密度。由以上技術方案可知，本發明所述方法能夠消除因標準溶液體系環境與待測血樣體系環境不同而出現的基質效應，避免兩者用孔雀綠法檢測時所得離子締合物分屬不同色系，同時增強顯色的穩定性，提高了檢測血磷的準確性，可以廣泛應用於血磷的檢測中。
具體實施例方式本發明公開了一種檢測血磷的方法和試劑盒，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述方法及試劑盒已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。以下就本發明所提供的一種檢測血磷的試劑盒和方法做進一步說明。實施例1 本發明所述方法將由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 75mol/L的吐溫-20和1. Og/L的牛血白蛋白組成的標準溶液與由0. 5mol/L的鉬酸銨、0. 75mol/L的吐溫-20和0. 7mol/L的孔雀綠組成的混合液在鹽酸(1.5mol/L)中反應，將得到綠色複合物在630nm波長下檢測吸光度Afe，待測血樣與混合液反應後也在630nm波長下檢測吸光度A# (待測血樣和標準溶液與混合液的體積比均為1 100)，與所述綠色複合物在630nm波長下的吸光度Afe比色，通過公式樣品血磷濃度(mmol/L)=標準溶液濃度XA#/Afe (1. 6mmol/L)計算得到樣品血磷濃度值。實施例2 本發明所述方法將由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 5mol/L的吐溫-20和0. 75g/L的牛血白蛋白組成的標準溶液與由0. 6mol/L的鉬酸銨、0. 5mol/L的吐溫-20和0. 5mol/L的孔雀綠組成的混合液在鹽酸介質(1. Omol/L)中反應，將得到綠色複合物在630nm波長下檢測吸光度Afe， 待測血樣與混合液反應後也在630nm波長下檢測吸光度A# (待測血樣和標準溶液與混合液的體積比均為1 100)，與所述綠色複合物在630nm波長下的吸光度Afe比色，通過公式 樣品血磷濃度(mmol/L)=標準溶液濃度XA#/Afe (1. 6mmol/L)計算得到樣品血磷濃度值。實施例3 本發明所述方法將由1.6mmol/L的磷酸二氫鉀、1.0mol/L的吐溫-20和0. 5g/L的牛血白蛋白組成的標準溶液與由0. 3mol/L的鉬酸銨、1. 0mol/L的吐溫-20和0. 8mol/L的孔雀綠組成的混合液在鹽酸介質中Omol/L)反應，將得到綠色複合物在630nm波長下檢測吸光度Afe，待測血樣與混合液反應後也在630nm波長下檢測吸光度A# (待測血樣和標準溶液與混合液的體積比均為1 100)，與所述綠色複合物在630nm波長下的吸光度Afe比色，通過公式樣品血磷濃度(mmol/L)=標準溶液濃度XA#/Afe (1. 6mmol/L)計算得到樣品血磷濃度值。實施例4 本發明所述方法的準確度分析試驗儀器CB171半自動生化分析儀；檢測樣品中生北控質控血清(血磷靶值為1. 56mmol/L, X±2SO為 1. 32-1. 80mmol/L)；CB171半自動生化分析儀設定溫度為37°C，反應方法為終點法，測定波長為 630nm，反應方向為正反應，延遲時間為2s，測量時間為2s。採用實施例1至實施例3的檢測方法對上述質控血清分別進行檢測。具體結果為 實施例1檢測結果為1. 57mmol/L ；實施例2檢測結果為1. 59mmol/L ；實施例3檢測結果為 1. 58mmol/L。3次檢測結果表明，本發明所述方法的檢測結果位於質控血清的士2SD範圍內，具有較高準確性。實施例5 本發明所述方法的精密度分析
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試驗儀器CB171半自動生化分析儀；檢測樣品任意一血清樣品；CB171半自動生化分析儀設定溫度為37°C，反應方法為終點法，測定波長為 630nm，反應方向為正反應，延遲時間為2s，測量時間為2s。採用實施例1至實施例3的檢測方法分別對同一待測樣品重複檢測10次，其中， 實施例1檢測方法的檢測結果見表1。表1檢測樣品血磷濃度(10次)及標準差率(變異係數)
權利要求
1.一種檢測血磷的方法，其特徵在於，將標準溶液和待測血樣分別與由鉬酸銨、吐溫-20和孔雀綠組成的混合液在強酸下反應，然後再分別將各自反應得到的綠色複合物在 630nm波長下檢測吸光度，最後通過比色法得到待測血樣的血磷濃度，所述標準溶液由磷酸二氫鉀、吐溫-20和牛血白蛋白組成。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述標準溶液中磷酸二氫鉀的濃度為 1. 6mmol/L0
3.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述標準溶液和混合液中吐溫-20的濃度均為 0. 5-1. Omol/Lο
4.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述標準溶液中牛血白蛋白的濃度為 0. 5-1. Og/Lo
5.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述強酸為l_2mol/L的鹽酸。
6.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述混合液中鉬酸銨的濃度為0.3-0. 6mol/L0
7.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述混合液中孔雀綠的濃度為0.5-0. Smol/L0
8.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述待測血樣與混合液的體積比為 1 100。
9.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述標準溶液與混合液的體積比為 1 100。
10.一種檢測血磷的試劑盒，其特徵在於，包括由1. 6mmol/L的磷酸二氫鉀、0. 5-1. Omol/L吐溫-20和0. 5-1. Og/L的牛血白蛋白組成的標準溶液。
11.根據權利要求10所述試劑盒，其特徵在於，還包括由 l-2mol/L 的鹽酸、0. 3-0. 6mol/L 的鉬酸銨、0. 5-1. 0mol/L 吐溫-20 和 0. 5-0. 8mol/ L的孔雀綠組成的反應試劑。
全文摘要
本發明涉及生物化學領域，公開了一種檢測血磷的方法和試劑盒。該方法將標準溶液和待測血樣分別與由鉬酸銨、吐溫-20和孔雀綠組成的混合液在強酸下反應，然後再分別將各自反應得到的綠色複合物在630nm波長下檢測吸光度，最後通過比色法得到待測血樣的血磷濃度，所述標準溶液由磷酸二氫鉀、吐溫-20和牛血白蛋白組成。本發明試劑盒包括由1.6mmol/L的磷酸二氫鉀、0.5-1.0mol/L吐溫-20和0.5-1.0g/L的牛血白蛋白組成的標準溶液。本發明所述方法能夠避免標準溶液和待測血樣用孔雀綠法檢測時所得離子締合物顯色不一致的問題，同時增強顯色的穩定性，提高了檢測血磷的準確性，能廣泛應用於血磷的檢測中。
文檔編號G01N21/78GK102353671SQ20111017523
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月27日 優先權日2011年6月27日
發明者董理 申請人:董理