中國棉鈴蟲病毒基因工程株1號的製作方法

2023-10-27 15:07:42 1

專利名稱：中國棉鈴蟲病毒基因工程株1號的製作方法
技術領域：
本發明是中國棉鈴蟲病毒基因工程株1號，屬生物技術領域。可用於害蟲的生物防治及病毒流行病學研究以杆狀病毒為代表的昆蟲病毒由於其高度專一性，極強的致病性以及對環境的安全性已廣泛用於農業害蟲的生物防治。到目前為止國際上登記註冊的病毒殺蟲劑已超過20種，我國也有中國棉鈴蟲病毒殺蟲劑，斜紋夜蛾病毒殺蟲劑和小菜蛾顆粒體病毒等3種病毒殺蟲劑登記註冊進入商品化生產。在生產上發揮了重要作用。但野生型病毒存在殺蟲速度慢(一般需要5-7天)，殺蟲譜窄等缺陷而限制了其更大規模的應用。隨著杆狀病毒分子生物學研究和生物技術的發展，通過基因工程的方法改良病毒的殺蟲性能成為現實。
目前改良病毒殺蟲速度的方法有刪除或失活病毒自身的特定基因如egt，pp32等、表達昆蟲的激素基因和酶以及表達毒素基因如Bt毒素基因、昆蟲特異性的神經毒素基因如AaIT等。其中以缺失病毒egt基因和表達昆蟲神經毒素基因AaIT的改良效果最為理想。
國際上已經和正在進行遺傳改良以提高病毒殺蟲速度的昆蟲杆狀病毒有苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)(美國，英國等)，舞毒蛾核型多角體病毒(LdMNPV，美國)，黃杉毒蛾核型多角體病毒(OpMPNV，美國)，雲杉捲葉蛾核型多角體病毒(CfMNPV，加拿大)，甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeMNPV，荷蘭)，海灰翅夜蛾核型多角體病毒(SINPV，以色列)，美洲棉鈴蟲(HeSNPV)(美國)等。我國也有多家實驗室正在從事相關研究，其中中山大學的主要研究對象為AcMNPV和斜紋夜蛾核型多角體病毒(S1MNPV)，武漢大學的研究對象為AcMNPV。到目前為止，國內外尚未見通過基因工程方法改良中國棉鈴蟲病(Heliothis armigeranucleopolyhedrovirus,HearNPV或HaNPV)殺蟲性能研究的報導(見查新報告)。
中國科學院武漢病毒於1973年在湖北分離獲得中國棉鈴蟲病毒，成功的研製了HaSNPV殺蟲，並已於1995年登記註冊成為我國第一個商品化生產的病毒殺蟲劑，每年的防治面積達200萬畝次。但這僅佔我國控制大面積棉鈴蟲危害所使用的農藥的極少部分(主要農藥仍為化學農藥)主要原因是棉鈴蟲病毒和所有其它杆狀病毒一樣殺蟲速度慢。因此，如何提高棉鈴蟲病毒殺蟲劑的殺蟲速度成為該殺蟲劑推廣應用的關鍵。
本發明專利的目的是通過基因工程的方法對中國棉鈴蟲病毒株進行遺傳改造，提高其殺蟲速度，為病毒殺蟲劑的生產提供一株高效的工程病毒株。
為了獲得高效的棉鈴蟲病毒基因工程株，本發明採用了缺失HaSNPV自身egt(蛻皮激素UDP葡萄糖基轉移酶)基因的技術路線。昆蟲病毒遺傳工程株構建方法是構建重組轉移載體，轉移載體與野生型病毒共轉染敏感的昆蟲細胞，通過同源重組產生重組病毒，然後空斑純化重組病毒；最後對重組病毒的性能進行分析。
和野生型棉鈴蟲核型多角體病毒相比較，經過遺傳改良所獲得的中國棉鈴蟲病毒基因工程株1號的殺蟲速度比野生型病毒有了明顯的提高，其LT50縮短20％，該重組株用於棉鈴蟲的防治將明顯優於野生型病毒。
另外本工程株含有GFP(綠色螢光蛋白)標記基因，因而還特別適用於病毒田間流行病學的研究。
2．pHaGFPegt-質粒DNA與HaSNPV(野生型)DNA共轉染敏感昆蟲細胞Hz-AM1，來源於HaSNPV的序列和野生型病毒DNA發生同源等位交換產生重組病毒。該重組病毒的egt基因大部分編碼區被GFP標記基因取代。由於GFP的表達，感染了重組病毒的細胞在紫外燈下產生綠色的螢光。
3．空斑挑選產螢光的重組病毒，經3-5輪空斑可獲得純化的重組病毒。
4．重組病毒的檢測1)．限制性內切酶消化分析2)．PCR分析3)．EGT酶活性分析確認基因已被刪除。
5．生物活性測定以3齡中國棉鈴蟲為供試幼蟲，以1x106PIB/ml的病毒為供試濃度，測定比較野生型和重組型的LT50。
權利要求
本發明專利是中國棉鈴蟲病毒基因工程株1號，其特徵是病毒的egt(蛻皮激素UDP葡萄糖基轉移酶)基因被刪除或失活，從而改良病毒的殺蟲性能，提高其殺蟲速度，可作為新一代病毒殺蟲劑生產用毒株；插入了報導基因GfP(綠色螢光蛋白)，可作為環境釋放和流行病學研究的標記。
全文摘要
杆狀病毒廣泛用於農林害蟲的生物防治。到目前為止國際上登記註冊的病毒殺蟲劑已超過20種,我國也有中國棉鈴蟲病毒等3種病毒殺蟲劑登記註冊進入商品化生產。但野生型病毒存在殺蟲速度慢(一般需要5—7天)等缺陷限制了其大規模的應用。本發明通過分子生物技術刪除(或失活)中國棉鈴蟲病毒(Helio－this armigera nucleopolyhedrovirus)的蛻皮激素UDP葡萄糖基轉移酶基因(egt),構建了殺蟲性能明顯改良的中國棉鈴蟲病毒基因工程株一號。該基因工程株感染棉鈴蟲的LT
文檔編號A01N63/00GK1297043SQ9911668
公開日2001年5月30日 申請日期1999年9月29日 優先權日1999年9月29日
發明者陳新文, 胡志紅, J·M·Vlak(休斯特·福拉克), 張友清, 孫修練 申請人:中國科學院武漢病毒研究所