一種純化艾塞那肽的方法
2023-10-27 10:15:27 2
專利名稱：一種純化艾塞那肽的方法
技術領域：
本發明屬於HPLC技術領域，尤其是涉及一種規模化純化艾塞那肽 (Exenatide)的方法。
背景技術：
糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特徵的代謝紊亂，高血糖主要 由胰島素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分兩種，胰島素依賴型糖尿病(I
型糖尿病)和非胰島素依賴型糖尿病(n型糖尿病)，其中n型糖尿病患者佔90%
以上。WHO統計結果顯示，目前全球已經診斷的11型糖尿病達到1.3億人，我 國己超過4000萬人，是繼印度之後的第二大糖尿病大國。
常用的II型糖尿病治療藥物包括雙胍類、磺脲類、a-葡萄糖甘酶抑制劑、
噻唑烷二酮類及胰島素等。但研究發現，這幾類常用藥物都有可能造成身體的
不良反應，特別是二甲雙胍，有導致患者乳酸性酸中毒的危險性；而胰島素治
療也常導致低血糖的發生。因此，迫切需要研製出新的n型糖尿病治療藥物。
1995年，美國專利(US5424286)公開了一種從南美大毒蜥Gilka monster， Hdoderma Horridum)的唾液中分離出來的一種含有39個胺基酸的多肽， Exendin-4
(H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp國Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu陽Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro畫Ser-Ser-Gly-Ala曙Pro-Pro-P ro-Ser-NH2)。其結構與人的胰高血糖素(Glucagon)有48%的同源性，與人的GLP-1(胰高血糖素樣肽-l)有53%的同源性。
研究表明，作為GLP-1的類似物，Exendin-4能夠與GLP-1受體作用，通過 刺激胰島p細胞再生，促進胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放，減慢胃排空 速率，抑制食物攝入。其促胰島素分泌作用是根據血糖水平進行的，故可降低 低血糖的發生率，且對其他促胰島素分泌劑不敏感的II型糖尿病病人仍有降糖 作用，同時GLP-1還可以減輕II型糖尿病患者的體重，是一類全新的糖尿病治 療藥物。
2005年4月，美國禮來公司和Amylin公司共同開發的糖尿病藥物倍它 (Byetta，化學名Exenatide (人工合成的Exendin-4))獲美國FDA批准上市。 與此同時，國外許多製藥公司如諾和諾德製藥公司、默克製藥公司也在爭相研 發與倍它屬於同類型的藥物。另外，國內外也少有對Exendin-4進行固相直接合 成的相關文獻，但還沒有文獻具體研究Exenatide相關純化的方法，特別是規模 化純化Exenatide的方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一條適於產業化純艾塞那肽的工藝方法，使用反相 高效液相色譜法純化純艾塞那肽，並用陰離子交換轉鹽，純度高且收率好，達 到產業化要求，解決現有技術存在的缺陷。
為實現上述目的，本發明採取如下技術方案
一種純化艾塞那肽的方法，包括以下步驟
1 )將固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相為四烷基矽垸鍵合矽膠、 八烷基矽垸鍵合矽膠或十八烷基矽烷鍵合矽膠的反相矽膠柱，流動相為磷酸鹽緩衝溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽 溶液；
3)將純化後的高純度肽採用陰離子交換轉成醋酸鹽。 優選的方案是所述的步驟1)和步驟3)之間還包括步驟2)將收集目的 峰值的肽溶液減壓旋蒸濃縮。
更為優選的方案是所述A相的磷酸鹽緩衝溶液？11為3.0至5.3之間。 更為優選的方案是所述A相的磷酸鹽緩衝溶液pH為3.5至4.3之間。 更為優選的方案是所述色譜純乙腈的濃度為10-65%，檢測波長為230 nm。 更為優選的方案是所述色譜純乙腈的濃度為15-55%。 本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果
本發明提出的一條適於產業化純艾塞那肽的工藝方法，使用反相高效液相色 譜法純化純艾塞那肽，並用陰離子交換轉鹽，不僅能得到HPLC純度大於98.0^ 的精肽，而且能夠規模化生產，達到純度高、收率高、產業化的要求。
具體實施方式
實施例l
1、 樣品處理將合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為 50mg/mL，用孔徑為0.45jim濾膜過濾後收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相的色譜柱,柱子直徑和 長度為5 cm x25 cm 。流動相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的磷酸 溶液調pH至3.5-4.3 ; B相:色譜純乙腈。流速50-70 ml/min。檢測波長 230 nm。梯度B%: 20% 48% 66-78 min。進樣量為1.3-2 g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈衝洗乾淨後上樣，上樣量為26-40ml
5樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集的目的肽溶液於不超過35"C下 減壓旋蒸濃縮至約50-100 g/ml後備用。
3、轉鹽取55 g陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93置於合適大小的砂芯 漏鬥中，用超純水衝洗至中性後上樣，可上樣10-20 g，減壓抽濾並收集濾液， 濾液於不超過35 'C下減壓旋蒸濃縮至約5-8g/ml後轉至合適大小西林瓶。冷凍 乾燥後即可'得到純度大於98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達48%以上。
實施例2
1、 樣品處理將合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為 50mg/mL，用孔徑為0.45pm濾膜過濾後收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以四烷基矽烷鍵合矽膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和
長度為5 cm x25 cm 。流動相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的磷酸 溶液調pH至3.0-4.8 ; B相色譜純乙腈。流速50-70 ml/min。檢測波長 230 nm。梯度B%: 10% 35% 50-75 min。進樣量為l.1-1.8 g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈衝洗乾淨後上樣，上樣量為26-40ml 樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集的目的肽溶液於不超過35"C下 減壓旋蒸濃縮至約50-100 g/ml後備用。
3、 轉鹽取50 g陰離子交換樹脂Wofatit AD-41置於合適大小的砂芯漏鬥 中，用超純水衝洗至中性後上樣，可上樣10-20 g，減壓抽濾並收集濾液，濾液 於不超過35 "C下減壓旋蒸濃縮至約5-8g/ml後轉至合適大小西林瓶。冷凍乾燥 後即可得到純度大於98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達45%以上。
實施例3
1、 樣品處理將合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為
50mg/mL，用孔徑為0.45pm濾膜過濾後收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相的色譜柱，柱子直徑 和長度為5 cm x25 cm 。流動相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的磷
6酸溶液調pH至3.8-5.3 ; B相色譜純乙腈。流速50-70 ml/min。檢測波長 230 nm。梯度B%: 15% 55% 60-78 min。進樣量為1.5-2.0 g 。
純化過程將色譜柱用50°/。以上的乙腈衝洗乾淨後上樣，上樣量為30-35ml 樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集的目的肽溶液於不超過35"C下 減壓旋蒸濃縮至約50-100 g/ml後備用。
3、轉鹽取55 g陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93置於合適大小的砂芯 漏鬥中，用超純水衝洗至中性後上樣，可上樣10-20 g，減壓抽濾並收集濾液， 濾液於不超過35 'C下減壓旋蒸濃縮至約5-8 g/ml後轉至合適大小西林瓶。冷凍 乾燥後即可得到純度大於98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達52%以上。
實施例4
1、 樣品處理相合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為
50mg/mL，用孔徑為0.45pm濾膜過濾後收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基矽垸鍵合矽膠為固定相的色譜柱，柱子直 徑和長度為15 cm x25 cm 。流動相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的 磷酸溶液調pH至3.8-5.3; B相色譜純乙腈。流速450-550 ml/min。檢測波 長- 230nm。梯度B%: 15% 65°/。
70-88 min。進樣量為8-15g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈衝洗乾淨後上樣，上樣量為 160ml-300ml樣品溶液。線性梯度洗脫70-88 min，收集目的峰，將收集的目的 肽溶液於不超過37 "C下減壓旋蒸濃縮至約80-200 g/ml後備用。
3、 轉鹽取105g陰離子交換樹脂置WofatitAD-41於合適大小的砂芯漏鬥 中，用超純水衝洗至中性後上樣，可上樣30-40 g，減壓抽濾並收集濾液，濾液 於不超過35 "下減壓旋蒸濃縮至約5-8 g/ml後轉至合適大小西林瓶。冷凍乾燥 後即可得到純度大於98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達55%以上。
實施例5
1、樣品處理相合成所得艾塞那肽粗肽用注射用水溶解(濃度約為
50mg/mL,用孔徑為0.45pm濾膜過濾後收集濾液備用。
72、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基矽烷鍵合矽膠為固定相的色譜柱，柱子直
徑和長度為30cmx25cm 。流動相A相磷酸二氫鈉水溶液用分析純的磷 酸溶液調pH至3.8-5.3; B相色譜純乙腈。流速1900-2200 ml/min。檢測波 長230 nm。梯度B%: 15°/。 65% 85-100 min。進樣量為45-65 g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈衝洗乾淨後上樣，上樣量為
900ml-1300ml樣品溶液。線性梯度洗脫60-80 min，收集目的峰，將收集的目的 肽溶液於不超過35"C下減壓旋蒸濃縮至約60-180 g/ml後備用。
3、 轉鹽取210g陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93置於合適大小的砂芯 漏鬥中，用超純水衝洗至中性後上樣，可上樣50-60 g，減壓抽濾並收集濾液， 濾液於不超過35 。C下減壓旋蒸濃縮至約5-8 g/ml後轉至合適大小西林瓶。冷凍 乾燥後即可得到純度大於98%的醋酸艾塞那肽，純化收率可達57%以上。
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不 能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通 技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替 換，都應當視為屬於本發明的保護範圍。
權利要求
1、一種純化艾塞那肽的方法，包括如下步驟1)將固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相為四烷基矽烷鍵合矽膠、八烷基矽烷鍵合矽膠或十八烷基矽烷鍵合矽膠的反相矽膠柱，流動相為磷酸鹽緩衝溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液；3)將純化後的高純度肽採用陰離子交換轉成醋酸鹽。
2、 如權利要求1所述的純化艾塞那肽的方法，其特徵是所述的步驟l) 和步驟3)之間還包括步驟2)將收集目的峰值的肽溶液減壓旋蒸濃縮。
3、 如權利要求1或者2所述純化艾塞那肽的方法，其特徵在於所述A相 的磷酸鹽緩衝溶液pH為3.0 5.3。
4、 如權利要求3所述純化艾塞那肽的方法，其特徵在於所述A相的磷酸 鹽緩衝溶液pH為3.5 4.3。
5、 如權利1或者2所述純化艾塞那肽的方法，其特徵在於所述色譜純乙 腈的濃度為10-65%，檢測波長為230nm。
6、 如權利5所述純化艾塞那肽的方法，其特徵在於所述色譜純乙腈的濃 度為15-55%。
7、 如權利要求1或者2所述的純化艾塞那肽的方法，其特徵在於所述的 反相矽膠柱為四烷基矽烷鍵合矽膠、八烷基矽烷鍵合矽膠或十八烷基矽烷鍵合 矽膠。
8、 根據權利要求1或者2所述方法，其特徵在於所述的陰離子交換法為通過採用能夠提供醋酸根的陰離子交換樹脂進行離子交換實現，所述的陰離子 交換樹脂是Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41 。
全文摘要
本發明公開了一種純化艾塞那肽的方法，包括如下步驟1)將固相合成所得粗肽用注射用水溶解，用固定相為四烷基矽烷鍵合矽膠、八烷基矽烷鍵合矽膠或十八烷基矽烷鍵合矽膠的反相矽膠柱，流動相為磷酸鹽緩衝溶液為A相、色譜純乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液；3)將純化後的高純度肽採用陰離子交換轉成醋酸鹽。本發明提出的一條適於產業化純艾塞那肽的工藝方法，使用反相高效液相色譜法純化純艾塞那肽，並用陰離子交換轉鹽，不僅能得到用PLC純度大於98.0％的精肽，而且能夠規模化生產，達到純度高、收率高、產業化的要求。
文檔編號C07K14/435GK101538323SQ20091010498
公開日2009年9月23日 申請日期2009年1月13日 優先權日2009年1月13日
發明者旭 康, 李紅玲, 袁建成, 覃亮政, 馬亞平 申請人:深圳市翰宇藥業有限公司