薯蕷總皂甙在製備抗阿司匹林抵抗藥物中的應用的製作方法

2023-10-27 19:28:32

專利名稱：薯蕷總皂甙在製備抗阿司匹林抵抗藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，具體地說，本發明涉及薯蕷總皂甙在製備治療阿斯匹林抵抗藥物中的應用。
背景技術：
阿司匹林(Aspirin)又阿斯匹林或乙醯水楊酸，應用於臨床已有80多年的歷史，是一種古老的解熱、鎮痛藥。近年來隨著前列腺素研究的深入，對阿斯匹林又有了新的認識臨床上除了傳統上用於解熱、鎮痛、抗炎外，還用於抗血小板聚集等。臨床試驗表明阿司匹林是心腦血管疾病高危患者一級預防有效的抗血小板藥物，對心肌梗死和缺血性血管事件的二級預防也有效。
但是目前在臨床上使用治療劑量的阿司匹林，仍然有部分心腦血管疾病患者發生了冠脈血栓和中風，加大治療劑量，不僅未能達到治療及預防目的，而且不良反應增加，這種現象稱為「阿司匹林抵抗」(Aspirin Resistance，AR)。
經過長期隨訪，原因如下第一血小板被其它途徑激活，不能被阿司匹林阻斷[Valles J，Santos MT，Aznar J，et al.Erythrocyte Promotion of platelet reactivity decreases the effectivenessof aspirin as an antithrombotic therapeutic modalitythe effect of low-dose aspirin is less thanoptimal in patients with vascular disease due to prothrombotic effects of erythrocytes on plateletreactivity.Circulation，1998；97350-355]；第二有些患者需要比常規劑量更大的劑量才能得到最佳抗栓效果，沒有證據表明阿司匹林抗栓作用與劑量相關[Patrono C.Prevention ofmyocardial infarction and stroke by aspirindifferent mechanisms？Different dosage？Thromb.Res.，1998；92S7-S12]；第三某些患者儘管應用常規劑量阿司匹林也能生成TXA2[Tayllor DW，Low-dose and high-dose acetylsalicylic acid for patients undergoing carotid endarterectomyarandomized controlled trail；ASA and Carotid Endarterectomy(ACE)Trial Collaborators.Lancet，1999；3532179-2184]。
研究表明，AR的發生與下列機制有關。
紅細胞提高血小板反應性血小板-紅細胞相互作用影響血小板反應性，通過血小板釋放反應、類花生酸類物質合成和血小板募集導致阿司匹林抵抗。紅細胞引起TXA2合成增加，5-HT、β-TG和ADP釋放，表明紅細胞調節血小板花生酸類物質的生成[Valles J，et al.Erythrocyte metabolically enhancescollagen-induced platelet responsiveness via increased thromboxane production，adenosinediphosphate release，and recruitment.Blood，1991；78154-162]。
花生四烯酸(PGF2)代謝花生四烯酸經脂質過氧化產生一系列有生物活性的PGF2見複合物。F2-isoprostanes是血管疾病重要的新的預測因子。不穩定心絞痛、穩定性心絞痛、變異性心絞痛患者和健康人，服用阿司匹林100mg/d測量8-iso-PGF2(質脂過氧化作用的標誌物)和11脫氫-TXA2(TXA2生物合成的標誌物)的研究表明，不穩定心絞痛患者8-iso-PGF2尿排洩量明顯高於穩定心絞痛患者和對照組；TXA2的排洩量明顯高於穩定性心絞痛患者。不穩定心絞痛患者氧化劑應激增加，8-iso-PGF2增多，血小板對其他激動劑的反應增強。
吸菸刺激血小板聚集吸菸是心血管疾病主要的危險因素。資料表明阿司匹林能抑制血小板聚集率降低引起的血小板聚集[Davis JW，et al.Cigarette smoking-induced enhancement of plateletfunctionlack if prevention by aspirin in men with coronary artery disease.J Lab ClinMed，1982；126637-639]。吸菸後血小板聚集率降低。不吸菸者和吸菸成癮者吸菸前服用阿司匹林能防止血小板聚集率下降。
兒茶酚胺水平增加血小板聚集增加體外血小板對腎上腺素的敏感性表明兒茶酚胺引起的則血小板活化和急性冠脈症候群之間存在聯繫[Larsson PT et al，Norepinephrine-indueed human platelet activation in vivo is onlypartly counteracted by aspirin.Circulation，1994；891951-1957]。40個急性心肌梗死患者隨機分為華法林組和阿司匹林組。踏車試驗前後取血，比較兩組的基線特徵，運動時間和最大心率。在基線時華法林組比阿司匹林組血小板聚集率明顯降低，說明阿司匹林有抗血小板聚集的作用。運動時兩組的血小板聚集率均降低，表明血小板聚集能力增加。其原因可能是去甲腎上腺素水平增加導致血小板活化。
血小板對膠原的敏感性增加膠原是生理性的重要的血小板聚集的激動劑。兩個試驗研究阿司匹林應答和膠原之間的關係。一個試驗(n＝8健康男性)服用阿司匹林324mg/kg前，服藥2小時後測量出血時間，區分阿司匹林應答者和無應答者。8個人中7個參與了第二個試驗，給予膠原0.15-4μg/ml確定阿司匹林應答者和無應答者血小板對膠原的敏感性。第一個試驗8個患者中，5個阿司匹林應答者，3個無應答者。阿司匹林應答者和無應答者服藥前出血時間無差別[(408±121)和(330±30)秒，P＞0.05]，服藥後有明顯差別[(720±225)和(330±52)秒]。第二個試驗7個患者中，4個阿司匹林應答者，3個無應答者。阿司匹林應答者和無應答者服藥前出血時間無差別[(405±52)和(357±31)秒，P＞0.05]，服藥後有明顯差別[(623±189)和(345±54)秒][Kawasaki T，el at.Increased platelet sensitivity to cllagen in individuals resistant to low aspirin.Stroke，2000；31591-595]。
環氧化酶-2(COX-2)(p900)Cox是前列腺素合成的限速酶。Cox-1在大多數細胞和組織中表達。Cox-2的mRNA和蛋白質正常情況下在大多數組織中不能檢測到。最近Webr等[Weber AA，et al.Cyclooxygenase-2 in human platelet as a possible factor in aspirin resistance.Lancet，1993；353900]報導Cox-2的蛋白質和mRNA在健康人的循環血小板中表達，這可能是阿司匹林抵抗的一個原因。
藥物相互作用阿司匹林和其他非甾體類消炎藥(NSAIDS)的相互作用能夠削弱阿司匹林對血小板的作用。阿司匹林對絲氨酸殘基的乙醯化作用，需要首先與賴氨酸-120結合，賴氨酸-120是所有NSAIDS共同作用的位點。NSAIDS對賴氨酸-120的親和力較強，從而阻止了阿司匹林對血小板Cox-1的抑制作用。
以上闡述了阿司匹林抵抗的可能機制。明確血小板活化機制和可逆的危險因素，有助於減少阿司匹林抵抗的發生，改善患者的預後。
目前，對於治療阿司匹林抵抗的報導還不是很多。Yusuf S等[Effects ofpretreatment withclopidogrel and aspirin followed by long-term therapy in patients undergoing percutaneouscoronary interventionthe PCI-CURE study.Lancet，2001]報導了在阿司匹林治療的基礎上加用氯毗格雷能減少急性冠脈症候群患者包括經皮冠狀動脈介入治療的患者早期和長期的嚴重心血管事件的發生率。
John W.等[Aspirin-resistant thromboxane biosynthesis and the risk of myocardial infarction，stroke，or cardiovascular death in patients at high risk for cardiovascular events.]通過測量患者尿液中的11-脫氫TXB2含量，研究了阿司匹林抵抗現象。結果表明，在阿司匹林治療的患者中，尿液中11-脫氫TXB2含量可以預測心肌梗塞和心血管疾病死亡的風險。這些發現增加了這樣的可能性，那就是尿液中11-脫氫TXB2含量升高的患者，其相對越容易引起阿司匹林抵抗，那麼他們可能從其它的抗血小板聚集的藥物中受益，從而更有效地抑制血栓烷產生和活性。
中藥理血藥，特別是活血化瘀類藥物是歷代醫家所常用的藥物，本類藥物具有活血調經、破血消癥、化瘀止痛、消腫生肌的功效，現代藥理學證實，理血藥具有擴展冠狀動脈、增加冠脈流量，降低心肌耗氧，降低外周血管阻力，抑制血小板聚集，改善微循環，抑制血栓形成，增強纖維蛋白溶解活性，抗凝血系統，改善微循環，降壓，緩解平滑肌痙攣等作用。理血藥中的川芎、丹參、益母草、桃仁、紅花、水蛭等的臨床作用不斷的拓展。
薯蕷總皂甙是從野生草本植物薯芋科的黃山藥(Dioscorea Panthaica Prain et Burkill)或穿龍薯蕷(Dioscorea nipponica Makino)的根莖中提取的甾體總皂甙，其主要含有8種甾體皂甙。現代藥理學研究表明，其具如下藥理學作用對心臟的作用採用大鼠左冠狀動脈結紮法造成急性心肌梗死，動態觀察薯蕷總皂甙的作用，結果顯示它在0.1g/kg能夠使心肌缺血程度(ST)和缺血範圍(NST)減輕，心肌梗死面積減少，表明它具有抗心肌缺血，降低缺血程度和減少缺血範圍的作用；此外，它還能減慢心串、降低心臟收縮力，減少心臟做功，有效降低心肌耗氧量，改善受損心肌的營養與修復，同時可以使回心血量增多，左心室壁彈性增強，心輸出量增加，有效恢復心肌的代謝和能量平衡。
對血流動力學的影響薯蕷總皂甙能擴張血管，降低血管總外周阻力從而降低血壓，降低心臟負荷，改善冠心病人微循環異常，同時擴張冠脈，降低冠脈的灌注壓、血球壓積、全血比粘度、血漿比粘度、纖維蛋白原水平，緩解體內高凝狀態，此外能增加血管壁的彈性，使其收縮更敏捷、迅速，有效縮短微循環時間。
抗氧自由基作用薯蕷總皂甙不僅可增加血SOD含量，直接清除氧自由基，還能降低心肌組織細胞膜MDA水平，有效降低脂質過氧化作用。
降血脂作用採用高脂血症大鼠模型的研究表明，薯蕷總皂甙能明顯降低高脂血症大鼠TC、TG、LDL-C水平，而較大劑量時則使血清HDL-C升高，提示薯蕷總皂甙不僅對冠心病有治療作用，同時具有防止動脈粥樣硬化形成，對預防心血管意外事件如心肌梗塞、猝死的發生等有作用。
鈣通道阻滯作用研究發現，薯蕷總皂甙不影響靜息狀態下的鈣離子內流，但可抑制由去甲腎上腺素和高鉀去極化引起的鈣離子內流，對電壓依賴性鈣通道和配基依賴的鈣通道均有明顯的阻滯作用。
但有關薯蕷總皂甙治療阿司匹林抵抗方面的作用尚未見報導。

發明內容
本發明是在已有產品薯蕷總皂甙的基礎上，完成的新用途發明。
薯蕷皂甙的製備可以通過下述方法實現水提取法取黃山藥根莖，用95％乙醇加熱回流提取2次，提取液濃縮後，加水溶解，除去不溶物，水溶液濃縮得棕色浸膏。取浸膏過矽膠柱色譜，採用氯仿和甲醇系統進行梯度洗脫。收集洗脫液，濃縮，得薯蕷皂甙。
酶解法稱取一定量的黃姜根莖，用粉碎機粉碎後，加一定量的高溫澱粉酶及一定量的水.攪勻，置於超級恆溫器中發酵一定時間後，水洗抽濾。濾渣用鹽酸回流水解，用Ca(OH)2中和至中性，水洗抽濾後乾燥，然後置索氏提取器中用石油醚提取，提取液經濃縮乾燥後即得薯預皂甙產品。
二氧化碳超臨界萃取法條件為萃取壓力33.0-37.0MPa，萃取溫度44-46℃，以95％乙醇為攜帶劑，攜帶劑含量3％，浸泡6h後常溫60℃下分離3小時，流量21/min。
為了達到本發明的目的，採用上述方法(並不僅限於上述方法)得到的薯蕷皂甙提取物採用以下方法進行檢定。
鑑別(1)取上述方法得到的產品5mg，加水10ml使溶解，置具塞試管中，強力振搖1分鐘，產生持久性泡沫；(2)取[含量測定]項下遺留的沉澱少許，置點滴盤中，加入醋酐3-4滴溶解，加硫酸1-2滴，顯紫紅色，漸變為棕紅色至汙綠色；(3)取本品適量，加入甲醇製成1ml含50mg的溶液，作為供試品溶液。另取黃山藥皂甙提取物或穿龍薯蕷皂甙提取物適量，加入甲醇製成1ml含50mg的溶液，作為對照品溶液。薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點於同一以羧甲基纖維素為粘合劑的矽膠H板上，以氯仿∶甲醇∶水(75∶35∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以E試劑(取對二甲氨基苯甲醛1g，加入甲醇75ml，搖勻後再加入鹽酸25ml，搖勻)，在105℃加熱3-5分鐘。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的顏色的主斑點。
檢查依照《中國藥典2000版》相應的規定，乾燥失重不的超過5.0％；熾灼殘渣不得超過0.3％；鐵鹽與標準鐵溶液2.5ml製成的對照溶液比較，不得更深；重金屬不得超過百萬分之二十。
含量測定取上述方法得到產品0.3g，精密稱定，至於150ml圓形燒瓶中，加入硫酸40％乙醇溶液(取硫酸60ml緩緩注入適量的40％乙醇溶液中，放冷，加入40％乙醇至1000ml。搖勻)50ml，回流5小時，放冷，加水100ml，搖勻，用稱定量的4號垂熔玻璃坩堝濾過，沉澱用水洗滌至濾液不顯酸性，105℃乾燥至恆重，精密稱定，計算，即得。按乾燥品計算，含甾體總皂甙以甾體總甙元計，優選不得少於35％。
應用小劑量阿司匹林治療和預防冠心病、心絞痛是現代醫學常用的手段之一，表現出良好的臨床效果。但流行病學調查表明有些心腦血管疾病患者長期使用阿司匹林，以預防心腦血管疾病的發生，非但沒有產生預期的效果，反而不良反應增加，這種現象臨床上被稱為「阿司匹林抵抗」。
由於阿司匹林抵抗常發生於心腦血管疾病患者中，所以本發明所述的阿司匹林抵抗為阿司匹林抵抗性心腦血管疾病；即使用阿司匹林治療無效的心腦血管疾病，特別是阿司匹林治療無效的冠心病、心絞痛。本發明所說的藥物組合物具有抗阿司匹林抵抗的作用。
通過測量受試患者晨尿中段11-脫氫TXB2含量，研究了本發明藥物組合物治療阿司匹林抵抗的作用。其中，對阿司匹林抵抗的治療作用是指阿司匹林抵抗患者單獨使用該藥物組合物，或聯合阿司匹林一起使用時，其尿液中11-脫氫TXB2含量將低。實驗表明，其11-脫氫TXB2含量下降越低，其治療阿司匹林抵抗的效果就越好。本此實驗中，原屬於活血化瘀，理氣止痛類藥物的本發明藥物組合物具有抗「阿司匹林抵抗」的作用。
為了更好地理解本發明的實質，下面通過臨床觀察薯蕷總皂甙在抗「阿司匹林抵抗」的試驗結果，說明其在製藥領域中的新用途。
患者尿中11-脫氫TXB2含量是目前公認的最能代表人類「阿司匹林抵抗」的指標。本試驗採用測量患者晨尿中11-脫氫TXB2含量，來說明服藥前後患者「阿司匹林抵抗」的改善情況。
一般資料本組177例病人全部來自總後第一幹休所、八分部幹休所離退休人員。其中男性140人，女性37人。年齡70歲～87歲，平均年齡77.1歲。隨機選出170人進行標本檢測，數據可接受範圍150人(IC20～IC80)。記入統計人員中，服阿司匹林者50人；服用薯蕷總皂甙50人；合用者50人(全部病人至採樣之日，至少已連續服藥半年以上)，其中91人合併有高血壓史，25人有高血脂，32人有糖尿病，139人有冠心病，57人有腦血管疾病。
材料與方法所採尿樣為第一次晨尿中段，取後立即投入液氮中，後保存於-86℃低溫冰箱中備用。應用免疫酶標法檢測11-脫氫TXB2，試劑盒採用Cayman Chemical公司產品，全部實驗在天士力研究院生物所完成，病人分組狀況對實驗室人員及後期數據統計人員實行雙盲。
結果對組間均值進行t-檢驗，對組間抵抗者頻數進行x2檢驗。
表1.各組病人尿值11-脫氫TXB2(ng/mmol)阿司匹林與薯蕷總皂甙合用阿司匹林(n＝50例) 薯蕷總皂甙(n＝50例)(n＝50例)尿值11-脫氫TXB2(ng/mmol) 尿值11-脫氫TXB2(ng/mmol) 尿值11-脫氫TXB2(ng/mmol)30.24 30.94 19
19 13 8.3518.78 19.36 29.3630.46 12.23 17.6615.26 12.63 24.0237.24 31.86 17.6511 13.08 21.2336 35.64 32.7711.63 23.32 9.2538 10.38 11.4434.64 9.52 1113.41 28.6 25.6216.68 28.01 25.3227.621.94 12.7730.12 27.32 28.9214.74 15.21 11.0115.54 34.42 28.1238.25 10.67 9.7427.68 18.8 30.2528.94 24.25 20.1136.51 28.67 15.2617.45 14.25 13.3315.32 31.58 2539.35 10.25 8.5937.65 22.49 319.2520.52 2514.84 11.28 29.7347 31.28 31.2528.43 10.53 10.2727.32 35.66 22.3527.00 16.35 11.239.523.11 9.0418.25 10.99 30.2537.42 13.48 12.826.26 19.5 14.730.44 32.7 2916.82 28.56 79.9623.52 269.2415 8.7425 30.24 14.724.22 28.62 29.9930.24 15.43 2534.45 25.36 18.4330.22 13.99 19.79.7835.89 22.0527.63 10.02 37.05
10.1 14.23 7.938 21.33 10.8245.2721.96 26.2515.2421.45 19.0725.16±11.21 21.33579±7.563 19.39421±8.919結論薯蕷總皂甙與阿司匹林合用組(薯蕷+阿)與阿司匹林單獨使用組組間尿中TXB2排洩量之間有明顯統計學差異，t＝2.50 p＜0.05；薯蕷總皂甙與阿司匹林組組間尿中TXB2排洩量之間也有明顯統計學差異，t＝1.99 p＜0.05；薯蕷總皂甙組與薯蕷總皂甙合用阿司匹林(地奧+阿)組組間尿中TXB2排洩量之間無明顯統計學差異，t＝0.62 p＞0.05。
該實驗結果證明，薯蕷總皂甙可使尿中的TXB2排洩量減少，即在體內可阻斷血栓素A2(TXA2)的形成，減少血小板的黏附和凝血，從而抑制血小板聚集，減少動脈硬化、心肌梗塞的發生，結果說明薯蕷總皂甙具有抗阿司匹林抵抗作用，對阿司匹林無效的心血管病患者，薯蕷總皂甙依然有改善生命指標的作用。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明，下述該實施例僅用於說明本發明而對本發明沒有限制。
實施例1薯蕷總皂甙的製備取黃山藥根莖10kg，用95％乙醇加熱回流提取2次，提取液濃縮後，加水10L溶解，除去不溶物，水溶液濃縮得棕色浸膏。取其中50g進行矽膠柱色譜分離，採用氯仿-甲醇(20∶1)系統進行梯度洗脫，得薯蕷皂甙產品。其中，按乾燥品計算，含甾體總皂甙以甾體總甙元計，不得少於35％。
膠囊劑的製備將上述方法得到的薯蕷總皂甙加工製成膠囊，即得。
實施例2薯蕷總皂甙的製備稱取一定量的黃姜根莖，用粉碎機粉碎後，加一定量的高溫澱粉酶及一定量的水，攪勻，置於超級恆溫器中發酵一定時間後，水洗抽濾。濾渣用3mol/L鹽酸回流水解4h後，用Ca(OH)2中和至中性。水洗抽濾後乾燥，然後置索氏提取器中用石油醚提取6h，提取液經濃縮乾燥後即得薯蕷皂甙產品。其中，按乾燥品計算，含甾體總皂甙以甾體總甙元計，不得少於35％。
膠囊劑的製備將上述方法得到的阿薯蕷總皂甙加工製成膠囊，即得。
權利要求
1.薯蕷總皂甙在製備抗阿司匹林抵抗藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的薯蕷總皂甙在製備抗阿司匹林抵抗藥物中的應用，其中的薯蕷總皂甙的製備方法為水提取法或酶解法或超臨界萃取法。
3.根據權利要求1或2所述的薯蕷總皂甙在製備抗阿司匹林抵抗藥物中的應用，其中的薯蕷總皂甙中，按乾燥品計算，含甾體總皂甙以甾體總甙元計，不得少於35％。
4.根據權利要求1、2或3所述的一種藥物組合物在製備治療阿司匹林抵抗藥物中的應用，其特徵在於該藥物組合物在製備治療阿司匹林抵抗性心腦血管疾病的藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的用途，其特徵在於所述的阿司匹林抵抗性心腦血管疾病是指使用阿司匹林治療無效的心腦血管疾病。
6.根據權利要求4所述的用途，其特徵在於所述的阿司匹林抵抗性心腦血管疾病是指使用阿司匹林治療無效的冠心病、心絞痛。
全文摘要
本發明公開了薯蕷總皂甙在製備治療阿司匹林抵抗藥物中的應用。其中，薯蕷總皂甙的製備方法包括水提取法、酶解法或超臨界提取法等，按乾燥品計算，含甾體總皂甙以甾體總甙元計，不得少於35％。
文檔編號A61K31/7042GK1634100SQ200310122040
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月31日 優先權日2003年12月31日
發明者吳迺峰, 郭治忻, 範立君, 鄭軍, 鄭永鋒, 李旭 申請人:天津市天士力製藥股份有限公司