一種測定畜牧糞便中抗生素的方法

2023-10-27 06:50:07

專利名稱：：一種測定畜牧糞便中抗生素的方法一種測定畜牧糞便中抗生素的方法
技術領域：
：本發明屬於環境中痕量汙染物分析領域，具體地說是一種準確快捷測定畜牧糞便中抗生素的方法。
背景技術：
：在畜牧行業中，抗生素長期以來用於動物疾病的治療預防，監管不力和盲目濫用的情況十分嚴重。抗生素以原形或其降解產物通過糞便和尿液的形式排放到環境當中，研究表明糞便中土黴素濃度高達29mg/kg，金黴素26mg/kg，磺胺二甲嘧啶濃度高達100mg/L，可能對環境產生難以估量的影響。提取糞便中的抗生素可以利用無機溶劑或者有機溶劑，其中無機溶劑EDTAMcIlvaine緩衝液被廣泛應用於環境樣品中抗生素的測定。對於不同糞便的種類，物化性質相差很大，例如豬糞便蛋白質、纖維素、脂肪等有機成分相對於雞糞便要高，單獨的使用無機溶劑或者有機溶劑勢必不能同事很好的提取兩種糞便中的抗生素，應該針對不同的糞便選擇合適的提取溶劑。測定糞便中的抗生素有超聲波溶劑萃取、加壓液相萃取和加速流體萃取。超聲波溶劑萃取是目前應用於糞便中抗生素測定的最廣泛的一種手段，該方法在固/液萃取系統中，將有機溶劑加入到固體樣品中，在超聲條件下萃取。這個技術基於氣泡的崩解導致的空穴效應，在水液中產生了高於50MPa的短期空氣脈衝，溫度高達5000K。隨著糞便樣品結構的破壞，附著分析物分子被釋放從而增強了萃取效率。通常要樣品需要劇烈振蕩並超聲波處理15-30min，重複萃取幾次，回收率在60-80%左右。加壓液相萃取常用來代替傳統的索氏萃取。樣品置於不鏽鋼提取容器中，在高壓(大於20MPa)和高溫(大於20(TC)下進行，以提高溶解度和物質傳輸。由於壓力高，溶劑表現為液態，導致擴散係數顯著增加。有機溶劑、液態的酸性以及中性的溶劑都可以用於該法萃取。改方法的其它優點是溶劑使用量少，萃取時間短，而且全自動化操作，缺點是操作技術要求比較高，購買儀器比較昂貴。加速流體萃取技術是用溶劑對固體或半固體樣品中欲分析組分進行萃取的技術，具有萃取速度快，萃取效率高，可萃取的樣品量範圍寬，所用溶劑量較少以及易於自動化等優點。然而，因為加速流體萃取是在高溫高壓下進行的，所以要特別注意分析組分是否會分解，特別是對一些熱不穩定化合物，更要注意分解問題，不適合處理熱穩定的抗生素。微波輔助溶劑萃取技術利用微波對萃取體系各組分選擇性加熱，可使欲分析組分直接從基體中浸出，此時被萃取物是自由流向溶劑的，受溶劑親和力影響小，固可選擇的溶劑種類比較多.由於微波萃取可將萃取液瞬間加熱到常壓沸點以上，提高了萃取液的溫度，又不致使被分析組分分解，縮短了萃取時間，提高了萃取效率。但是還沒有發現利用該技術處理糞便中抗生素。抗生素在環境中為痕量存在，因此抗生素的檢測方法成為相關研究的制約因素。最早抗生素的檢測採用的是生物學方法，該方法耗時長，靈敏度低，後來逐漸為高3效液相色譜法所取代，成為抗生素類藥物檢測的標準方法。液相色譜-紫外聯用和液相色譜-螢光聯用等被廣泛應用於環境中抗生素的檢測，但是由於環境樣品成分複雜，紫外和螢光監測器的靈敏度和選擇性往往不能滿足實際樣品的測定。隨著技術的發展，液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)用由於其高靈敏度和定性能力，近年來廣泛應用於環境中抗生素的分析。毛細管電泳和放射性免疫也用於環境樣品中抗生素測定，但該方法是半定量方法，還需要採用液相色譜串聯質譜做進一步確證。綜上所述，選擇合適的提取溶劑，選用恰當的提取儀器和分析儀器，並優化其條件才能建立一種準確快捷的測定畜牧糞便中抗生素的方法，以滿足社會的需求。
發明內容本發明的目的旨在為解決現有技術的問題，而提供一種準確快捷測定畜牧糞便中抗生素的方法，該測定方法簡單，快捷，並具有高回收率、低檢出限、高靈敏性、抗基質幹擾，為進一步研究糞便中抗生素奠定基礎。本發明為解決上述問題所採用的方案是設計一種準確快捷測定畜牧糞便中抗生素的方法。它的特徵在於所述方法以EDTA-Mcllvaine緩衝液或甲酸酸化的乙腈為提取液，微波輔助萃取儀為提取裝置，用固相萃取小柱進行濃縮淨化，然後再用氮氣吹捕濃縮儀濃縮，最後用液相色譜串聯質譜儀測定。本發明的有益效果是l.使用的溶劑比較少。該方法採用的微波輔助萃取重複兩次，使用的溶劑量為30ml，，而常用的超聲萃取重複兩次，使用的溶劑量為60ml，且前者的提取效率要高於後者。2.消耗的時間比較短。該方法採用的微波輔助萃取消耗的時間約是常用的超聲萃取時間的1/2。3.回收率比較高。應用該方法通過選擇不同的溶劑和不同的萃取方法，測定的糞便中幾種典型抗生素，回收率均高於70%，優越於常規的單一溶劑萃取和超聲萃取。圖1和圖2給出了微波輔助萃取與超聲萃取抗生素回收率的比較數據，證明了這一效果；圖3和圖4則通過兩種提取液分別對雞糞便和豬糞便進行提取，從回收率的數據比較得出EDTA-Mcllvaine緩衝液適宜雞糞便的提取，甲酸酸化的乙腈更適宜豬糞便的提取。4.準確性比較高。該方法選用液相色譜串聯質樸，靈敏度比較高，選擇性比較好，降低了基質幹擾，從而提高了分析的準確性。5.處理方法簡單。該方法對設備要求不高，反應條件溫和，操作步驟簡單。圖1為微波萃取與超聲萃取雞糞便中抗生素回收率比較；圖2為微波萃取與超聲萃取豬糞便中抗生素回收率比較；圖3為不同提取溶液測定雞糞便中抗生素回收率比較；圖4為不同提取溶液測定豬糞便中抗生素回收率比較。以下結合本發明的實施例進行詳細敘述。具體實施方式本發明以EDTA-Mcllvaine緩衝液或甲酸酸化的乙腈為提取液，微波輔助萃取儀為提取裝置，用固相萃取小柱進行濃縮淨化，然後再用氮氣吹捕濃縮儀濃縮，最後用液相色譜串聯質譜準確快速測定。本發明測定畜牧糞便中抗生素的方法中，檢測雞糞便包括以下步驟提取過程稱取0.5g冷凍乾燥後的雞糞便樣品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入0.1MEDTA-Mcllvaine緩衝液15ml，用微波輔助萃取儀提取15min，將萃取後得到的懸濁液轉移到離心管中，然後重新加入緩衝液再萃取一次，兩次提取的懸濁液轉移到同一離心管中冷凍離心30min;濃縮純化過程離心後的雞糞便的上清液通過固相萃取小柱，用甲醇脫洗小柱，然後用氮氣吹去甲醇溶劑，定容到lml;定容後的樣品，再通過聚四氟乙烯過濾膜，進一步純化樣品；測定過程純化後的樣品直接進入液相色譜串聯質譜儀測定。本發明測定畜牧糞便中抗生素的方法中，檢測豬糞便包括以下步驟提取過程稱取0.5g質量冷凍乾燥後的豬糞便樣品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入甲酸酸化的乙腈，Ph二4提取液15ml，用微波輔助萃取儀提取15min，將萃取後得到的懸濁液轉移到離心管中，然後重新加入緩衝液再萃取一次，兩次提取的懸濁液轉移到同一離心管中冷凍離心30min;濃縮純化過程離心後的豬糞便上清液經氮氣吹到約5ml的時候，加入200ml蒸餾水稀釋，通過固相萃取小柱，用甲醇洗脫小柱，然後用氮氣在3(TC條件下吹去甲醇溶劑，定容到lml;定容後的樣品，再通過聚四氟乙烯過濾膜，進一步純化樣品；測定過程純化後的樣品直接進入液相色譜串聯質譜儀測定。檢測中，所述微波輔助萃取儀提取溫度4(TC，功率200w，壓力2apm。所述濃縮純化過程中的固相萃取小柱是先用15ml超純水活化，然後通過10ml甲醇，最後用15ml超純水洗掉小柱上殘留的甲醇，樣品以2ml/min的速度通過固相萃取小柱，然後用12ml甲醇脫洗。所述氮氣吹乾溫度設定為30°C。所述濃縮純化過程中的聚四氟乙烯過濾膜是0.45iim聚四氟乙烯過濾膜。所述測定過程中，液相色譜串聯質譜儀測定流動相使用0.25%甲酸和乙腈的混合液。純化後的樣品直接進入液相色譜串聯質譜儀測定。液相色譜質譜條件見表1和表2。表1LC-MS/MS和微波輔助萃取操作條件攛相參數質譜參數微波輔助萃取參數流速0.25mL/min質譜方法力法二級質譜溫度4(TC流動相AACNMS模式ESI+持續時間15min0.5%HCOOH毛細管電壓4.0KV升溫時間2min流動相程序0min，20%Almin，25%A源溫度去溶劑溫度鵬DC350eC提取液體ii15ml3min，15%A錐卞氣SOL/h5min，30%A去溶劑氣流500lib9mH30%A倍增電壓700V16mto^25%A17min20%A27minj20%A表2選擇性離子分析條件設置化合物種類縮寫母離子(m/z)子離子(m/z)(sec)錐空電壓(v)碰撞能量(eV)磺胺嘧啶SDZ2511080.32225磺胺氯噠嗪磺胺甲噁唑磺胺—甲械嘧啶SCPs匿SDO2852543111561561560.30.30,3202540151520氧氣沙星OFL3623180.33835環閃沙星CIP3322認0,33030四環素TC4454100.32020金黴素CTC4794440,32520實施例1選擇天津市兩個集約化養殖小區A和B的雞糞便作為分析對象，分析方法及效果如下提取過程稱取0.5g質量冷凍乾燥後的雞糞便樣品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入0.1MEDTA-Mcllvaine緩衝液15ml，4(TC條件下微波輔助萃取15min，將萃取後得到的懸濁液轉移到離心管中，然後重新加入緩衝液再萃取一次，兩次提取的懸濁液轉移到同一離心管中冷凍離心30min;濃縮純化過程15ml蒸餾水，10ml甲醇和15ml蒸餾水依次通過固相萃取小柱。離心後的雞糞便的上清液通過預處理後的固相萃取小柱，然後用10ml甲醇脫洗固相萃取小柱，最後用溫柔的氮氣在3(TC條件下吹去甲醇溶劑，甲醇定容到lm。定容後的樣品，再通過聚四氟乙烯過濾膜過濾。測定過程以0.25%甲酸和乙腈作為流動相，純化後的樣品直接進入液相色譜串聯質譜儀測定。表3不同養殖小區雞糞便中抗生素殘留tableseeoriginaldocumentpage7實施例2選擇天津市兩個集約化養殖小區C和D的豬糞便作為分析對象，分析方法及效果如下提取過程稱取0.5g質量冷凍乾燥後的豬糞便樣品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入甲酸酸化的乙腈(pH二4)15ml，4(TC條件下微波輔助萃取15min，將萃取後得到的懸濁液轉移到離心管中，然後重新加入緩衝液再萃取一次，兩次提取的懸濁液轉移到同一離心管中冷凍離心30min;濃縮純化過程15ml蒸餾水，10ml甲醇和15ml蒸餾水依次通過固相萃取小柱。離心後的豬糞便上清液經氮氣吹到約5ml的時候，加入200ml蒸餾水稀釋，然後通過固相萃取小柱，最後用甲醇洗脫，用溫柔氮氣在3(TC條件下吹去甲醇溶劑，定容到lml。定容後的樣品，再通過聚四氟乙烯過濾膜。測定過程以0.25%甲酸和乙腈作為流動相，純化後的樣品直接進入液相色譜串聯質譜儀測定。表4不同養殖小區豬糞便中抗生素殘留tableseeoriginaldocumentpage8不同提取溶液測定雞(豬)糞便中抗生素回收率比較"一種提取液用來提取豬糞便樣品比較好，另外一種提取液提取雞糞便樣品比較好。柱狀圖中回收率比較高表明了提取效果比較好。權利要求一種測定畜牧糞便中抗生素的方法，其特徵在於所述方法以EDTA-McIlvaine緩衝液或甲酸酸化的乙腈為提取液，微波輔助萃取儀為提取裝置，用固相萃取小柱進行濃縮淨化，然後再用氮氣吹乾，再用甲醇定容，最後用液相色譜串聯質譜儀測定。2.根據權利要求1所述的測定畜牧糞便中抗生素的方法，其特徵在於所述方法檢測雞糞便包括以下步驟提取過程稱取0.5g冷凍乾燥後的雞糞便樣品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入0.1MEDTA-Mcllvaine緩衝液15ml，用微波輔助萃取儀提取15min，將萃取後得到的懸濁液轉移到離心管中，然後重新加入緩衝液再萃取一次，兩次提取的懸濁液轉移到同一離心管中冷凍離心30min;濃縮純化過程離心後的雞糞便的上清液通過固相萃取小柱，用甲醇脫洗小柱，然後用氮氣吹去甲醇溶劑，定容到lml;定容後的樣品，再通過聚四氟乙烯過濾膜，進一步純化樣品；測定過程純化後的樣品直接進入液相色譜串聯質譜儀測定。3.根據權利要求1所述的測定畜牧糞便中抗生素的方法，其特徵在於所述方法檢測豬糞便包括以下步驟提取過程稱取0.5g質量冷凍乾燥後的豬糞便樣品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入甲酸酸化的乙腈，Ph二4提取液15ml，用微波輔助萃取儀提取15min，將萃取後得到的懸濁液轉移到離心管中，然後重新加入緩衝液再萃取一次，兩次提取的懸濁液轉移到同一離心管中冷凍離心30min;濃縮純化過程離心後的豬糞便上清液經氮氣吹到約5ml的時候，加入200ml蒸餾水稀釋，通過固相萃取小柱，用甲醇洗脫小柱，然後用氮氣吹去甲醇溶劑，再用甲醇定容到lml;定容後的樣品，再通過聚四氟乙烯過濾膜，進一步純化樣品；測定過程純化後的樣品直接進入液相色譜串聯質譜儀測定。4.根據權利要求2或3所述的測定畜牧糞便中抗生素的方法，其特徵在於所述微波輔助萃取儀提取溫度40。C，功率200w，壓力2.0apm。5.根據權利要求2或3所述的測定畜牧糞便中抗生素的方法，其特徵在於所述濃縮純化過程中的固相萃取小柱是先用15ml超純水活化，然後通過10ml甲醇，最後用15ml超純水洗掉小柱上殘留的甲醇，樣品以2ml/min的速度通過固相萃取小柱，然後用12ml甲醇脫洗。6.根據權利要求1所述的測定畜牧糞便中抗生素的方法，其特徵在於所述氮氣吹乾時溫度設定為30°C。7.根據權利要求2或3所述的測定畜牧糞便中抗生素的方法，其特徵在於所述濃縮純化過程中的聚四氟乙烯過濾膜是0.45i！m聚四氟乙烯過濾膜。8.根據權利要求1或2、3所述的測定畜牧糞便中抗生素的方法，其特徵在於所述液相色譜串聯質譜儀測定流動相使用0.25%甲酸和乙腈的混合液。全文摘要本發明屬於環境中痕量汙染物分析領域，具體地說是一種測定畜牧糞便中抗生素的方法。該方法以EDTA-McIlvaine緩衝液和甲酸酸化的乙腈為提取液，用微波輔助萃取儀萃取，固相萃取小柱純化濃縮，最後用液相色譜串聯二級質譜(LC-MS/MS)分析測定，從而準確快捷地分析糞便中的抗生素。具體的分析測定方法為取一定量冷凍乾燥後的糞便，放到聚四氟乙烯萃取罐中，加入EDTA-McIlvaine緩衝液和甲酸酸化的乙腈，利用調試後的微波輔助萃取儀進行萃取，然後經過優化後固相萃取小柱濃縮純化，氮氣吹乾，定容，最後用調試後的HPLC-MS/MS準確測定。本發明開發的測定方法簡單，快捷，並具有高回收率、低檢出限、高靈敏性、抗基質幹擾等特點。文檔編號G01N30/00GK101692073SQ20091006992公開日2010年4月7日申請日期2009年7月29日優先權日2009年7月29日發明者周啟星,羅義,胡獻剛申請人:南開大學