與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物和試劑盒的製作方法

2023-10-19 20:05:52

與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物和試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物技術和醫學【技術領域】，提供了一種與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物，該標誌物為miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p和miR-150-5p的組合。還提供了一種上述miRNA標誌物的引物。還提供了一種上述miRNA標誌物在製備直腸癌早期診斷試劑盒中的應用。還提供了一種直腸癌早期診斷試劑盒。本發明提供的與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-150-5p對結直腸癌進行早期篩查具有操作簡單、高特異性、高靈敏性的特點。
【專利說明】與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物技術和醫學【技術領域】，特別涉及一種與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物對直腸癌早期篩查的應用。
【背景技術】
[0002]結直腸癌是第三常見的惡性疾病和癌症致死的第二主要原因。就如其他惡性疾病一樣，基因因素是導致結直腸癌形成的重要原因，但是，只有20%的結直腸癌病例可以追溯到家族性基因變異。事實上，大部分的散發性結直腸癌和環境因素密切相關，最常見的抑癌基因APC的突變導致了 Apc/GSK3 β /Axin複合物的破壞，從而激活了 Wnt/ β -catenin信號轉導通路。Wnt/ β -catenin信號轉導通路的異常激活不僅促進小腸上皮細胞的增殖，也抑制了其向腺窩底部的遷移 和凋亡。典型的「結直腸癌發生的基因途徑」已經被充分的研究，環境因素導致結直腸癌發生的最新機制和慢性炎症有關，稱為腸炎相關性結直腸癌(CAC)。近幾年來隨著中國人的飲食和生活方式的改變，結直腸癌的發生率迅速增高，而且大部分的結直腸癌病例和慢性腸炎相關。臨床上已經發現，腸炎相關性結直腸癌往往伴隨著慢性腸炎疾病，例如克羅恩病，潰瘍性腸炎。流行病學和臨床研究表明，在伴隨慢性腸炎30年後，潰瘍性腸炎增加了 18-20%的腸炎相關性結直腸癌的發病率，而克羅恩病增加了 8%的發病率。在小鼠模型中，注射致癌物azoxymethane (AOM)和慢性腸炎誘導物DSS會導致多發的腸腫瘤，但是如果沒有炎症的存在，則需要注射多倍劑量的AOM並需要更長時間才能導致腫瘤的形成。這些臨床和實驗結果表明，CAC是典型的炎症致癌。但是，不像Apc/Wnt/β -catenin信號轉導通路，腸炎相關的結腸直腸癌的發病機制，特別是腸炎惡性轉變的機制尚不清楚，主要是因為缺少動態研究的合適模型。小腸上皮組織的杯狀細胞能夠分泌一層黏液蛋白，這層黏液蛋白能夠保護上皮組織免受機械的和化學的損傷，以及炎症因素的損害。這種黏液蛋白主要是由Muc2基因所編碼。已有研究表明，杯狀細胞的減少和Muc2的表達降低在潰瘍性腸炎和結直腸癌中非常常見。MUC2對於維持腸道穩態非常重要，將小鼠的Muc2基因敲除後，腸上皮細胞的增殖、遷移和凋亡都發生了改變，最重要的是，Muc2敲除小鼠能夠自發地導致小腸、大腸和直腸腫瘤的發生。而研究發現腫瘤的發生與慢性炎症相關,與Wnt/ β-catenin信號通路無關。Muc2敲除引起的炎症促進了 Apc突變小鼠的腫瘤發生，而且在Muc2敲除小鼠中，周期依賴性激酶抑制物P21WAF1的表達降低促進了腫瘤的形成。我們更深入的研究發現，Muc2敲除小鼠在出生後3個月以內會自發形成慢性腸炎，其組織病理特點與人的潰瘍性腸炎類似。在3個月之後，Muc2-/-小鼠會形成結腸和直腸腫瘤。因此，3個月可能是慢性腸炎發展為結直腸癌的關鍵時間點。所以Muc2-/-小鼠可以作為一種動態研究慢性腸炎惡性轉變形成結直腸癌的理想模型。為了揭示腸炎惡性轉變的分子機制，我們分離了 Muc2-/_小鼠的腸上皮細胞來做miRNA，我們在腸炎惡性轉變的關鍵時間點發現了一些異常表達的miRNA。我們在人的腸炎和結直腸癌組織中對上述的一些miRNA做了驗證，有趣的是，這些表達降低的miRNA在小鼠組織中同樣表達降低，並且和一些細胞因子的表達增高相關，這些發現預示著表觀改變可能在腸炎惡性轉變中起著重要的作用。
【發明內容】

[0003]針對現有技術不足，本發明的目的是提供一種與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物和試劑盒。
[0004]為實現上述目的，本發明提供一種與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物，該標誌物為 miR-138-5p、miR-145_5p、miR-146a_5p 和 miR-150_5p 的組合。以上四種 miRNA在Muc2-/_小鼠模型的慢性腸炎惡性轉變過程中表達明顯降低，在人腸炎組織及結直腸癌組織中表達也明顯降低，說明其與慢性腸炎惡性轉變密切相關。
[0005]本發明還提供一種上述miRNA標誌物的引物，該引物為:
[0006]miR-138-5p 的正向引物序列為:5』 -TGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3』，如 SEQ ID NO:1所示；
[0007]miR-145-5p 的 正向引物序列為:5』-GGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3』，如 SEQ ID NO:2 所示；
[0008]miR-146a-5p 的正向引物序列為:5』 -TTCGGTGAGAACTGAATTCCA-3』，如 SEQ ID NO:3所示；
[0009]miR-150-5p 的正向引物序列為:5』-CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA_3』，如 SEQ ID NO:4所示；
[0010]通用反向引物序列為:5』 -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3，，如 SEQ ID NO: 5 所示。
[0011 ] 本發明還提供一種上述miRNA標誌物在製備直腸癌早期診斷試劑盒中的應用。具體地，通過檢測被試者結直腸組織中的四種miRNA的含量，並與正常水平相比較來對患者的病情發展做出預判，以此來指導臨床治療。在一個特定的實施方案中，使用定量PCR的方法來檢測被試者結直腸組織中的四種miRNA含量。
[0012]優選的，上述miRNA標誌物的引物在製備直腸癌早期診斷試劑盒中的應用。
[0013]本發明還提供一種直腸癌早期診斷試劑盒，試劑盒含有上述miRNA標誌物的引物。
[0014]優選的，該試劑盒還包括PCR反應常用的酶和試劑。
[0015]優選的，該試劑盒包括組織總RNA提取試劑、總RNAWpoly(A)試劑、RT-PCR試劑、定量PCR試劑。
[0016]優選的，所述RT-PCR試劑中包括RT-引物:
[0017]hsa-miR-138:5』 -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT-3』 ；
[0018]hsa-miR-145:5』 -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT-3』 ；
[0019]hsa-miR-146a:5』 -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA-3，；
[0020]hsa-miR-150:5』 -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG-3』 ；
[0021]內參 SN0RD44:5』 -GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTagtcag_3，；
[0022]所述定量PCR試劑中包括序列:
[0023]通用反向引物:5』 -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3，；
[0024]通用Taqman 探針:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAATTT/3 IABkFQ。[0025]本發明的有益效果:
[0026]本發明提供的與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物miR-138_5p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-150-5p對結直腸癌進行早期篩查具有操作簡單、高特異性、高靈敏性的特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1 Muc2_/_小鼠腸上皮miRNA array聚類分析結果；
[0028]圖2 Muc2+/+和Muc2-/_小鼠的腸上皮細胞因子表達水平；
[0029]圖3在Muc2+/+和Muc2-/_小鼠的腸上皮細胞中驗證差異表達的miRNA ；
[0030]圖4 miR-138-5p在16對結腸癌組織中的表達水平；
[0031]圖5 miR-145-5p在16對結腸癌組織中的表達水平；
[0032]圖6 miR-146a-5p在16對結腸癌組織中的表達水平；
[0033]圖1 miR-150-5p在16對結腸癌組織中的表達水平；
[0034]圖8 miR-138-5p在6對結腸炎組織中的表達水平；
[0035]圖9 miR-145-5p在6對結腸炎組織中的表達水平；
[0036]圖10 miR-146a-5p在6對結腸炎組織中的表達水平；
[0037]圖11 miR-150-5p在6對結腸炎組織中的表達水平。
【具體實施方式】
[0038]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0039]實施例1結腸炎相關的癌模型Muc2基因敲除小鼠結腸上皮細胞中miRNA表達譜
[0040]小鼠的腸上皮細胞的收集:選擇3月齡的Muc2+/+和Muc2-/_，每組包括四隻小鼠，將小鼠處死，取結腸洗淨，縱向剖開，各取一段置於20ml冰PBS ;將組織移入37°C 15mMEDTA30ml中；37°C振蕩，220rpm, 30min,充分振蕩，去除腸組織；4°C離心5000rpm, 5min ;先棄去上清，5ml冷PBS重懸細胞,分裝於1.5mlEP管中；4°C離心,3000rpm, 5min ;棄去上清，EP管開蓋置於液氮中；取出後開蓋置於_80°C過夜,次日將EP管蓋上。
[0041]總RNA的提取:按照操作手冊用Trizol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取總RNA0
[0042]miRNA array(表達譜):實驗操作由芝加哥大學基因研究所實施。
[0043]聚類分析結果如圖1所示:21個miRNA下調,70個miRNA上調(changefold>2or<0.5 ；T<0.01,p value<0.05, q value<0.05)。
[0044]實施例2Muc2小鼠結腸上皮細胞中細胞因子的表達、差異表達miRNA的驗證
[0045]小鼠結腸上皮細胞RNA提取與實施例1中方法相同；
[0046]利用qRT-PCR檢測細胞因子mRNA表達水平，反應體系:正向引物(20μπι)0.15 μ 1，反向引物(20μL?)0.15μ l，cDNA0.7μ 1，Η209 μ 1，螢光染料 SYBR Green (2X) 10 μ I ;反應條件:50°C 2min，95°C 2min ;變性 95°C 15sec，退火 / 延伸 60°C lmin，共 40 個循環。
[0047]細胞因子mRNA表達水平如圖2所示:與對照相比，Muc2_/_小鼠的結腸上皮細胞中幾種細胞因子IL-6、COX-2、IL-10、TNF α、IL-1 β表達水平明顯上升。
[0048] IL-6:[0049]正向引物:TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC，
[0050]反向引物:TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC；
[0051]COX-2:
[0052]正向引物:TGAGCAACTATTCCAAACCAGC，
[0053]反向引物:GCACGTAGTCTTCGATCACTATC；
[0054]IL-10:
[0055]正向引物:GCTCTTACTGACTGGCATGAG，
[0056]反向引物:CGCAGCTCTAGGAGCATGTG；
[0057]IL-1 β:
[0058]正向引物:GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，
[0059]反向引物:ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT；
[0060]TNF α:
[0061]正向引物:CCCTCACA CTCAGATCATCTTCT，
[0062]反向引物:GCTACGACGTGGGCTACAG；
[0063]IKK β:
[0064]正向引物:CTGAAGATCGCCTGTAGCAAA，
[0065]反向引物:TCCATCTGTAACCAGCTCCAG；
[0066]GAPDH:
[0067]正向引物:TCTGGAAAGCTGTGGCGTGAT，
[0068]反向引物:GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG。
[0069]為了驗證小鼠miRNA array的結果，選擇15個miRNA利用螢光定量PCR技術來驗證，如圖 3 所不:mmu_miR-146a、mmu-miR-138、mmu-miR-5123、mmu_miR-196b、mmu-miR-5099、mmu-miR-150、mmu-miR-145、mmu_miR-27a、mmu_miR-23a 表達下調；mmu-miR-705、mmu-miR-760_3p、mmu-miR-1962、mmu_miR-669c、mmu-miR-3104_5p、mmu-miR-5132表達上調,突光定量PCR的結果與miRNA array的結果一致。
[0070]mmu-miR-146a-5p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA ；
[0071 ]定量正向引物:TTCGGTGAGAACTGAATTCCA ；
[0072]mmu-miR-138-5p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT ；
[0073]定量正向引物:TGGAGCTGGTGTTGTGAATC；
[0074]mmu-miR-5123 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACACC ；
[0075]定量正向引物:TGGTGTAGATCCATATGCCAT；
[0076]mmu-miR-196b-5p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCAAC ；
[0077]定量正向引物:TTCGGTAGGTAGTTTCCTGTT；
[0078]mmu-miR-5099 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGGAGCA ；[0079]定量正向引物:TGTCGGTTAGATCGATGTGG；
[0080]mmu-miR-150-5p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG ；
[0081 ]定量正向引物:CGGTCTCCCAACCCTTGTA ；
[0082]mmu-miR-145a-5p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT ；
[0083]定量正向引物:GGGTCCAGITTTCCCAGGA；
[0084]mmu-miR-27a-3p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCGGAA ；
[0085]定量正向引物:TTCGGTTCACAGTGGCTAAG；
[0086]mmu-miR-23a-3p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGGAAAT ；
[0087]定量正向引物:TCGGATCACATTGCCAGGG；
[0088]mmu-miR-705 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTGCCCAC ；
[0089]定量正向引物: TGGGGTGGGAGGTGGGG；
[0090]mmu-miR-760-3p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCCCAC ；
[0091 ]定量正向引物:CGGCGGCTCTGGGTCTG ；
[0092]mmu-miR-1962 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTATGTGT ；
[0093]定量正向引物:TGAGAGGCTGGCACTGGG；
[0094]mmu-miR-669c-5p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTACACAC ；
[0095]定量正向引物:TTCGGATAGTTGTGTGTGGAT；
[0096]mmu-miR-3104-5p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGAGGG ；
[0097]定量正向引物:TAGGGGGCAGGAGCCGGAG；
[0098]mmu-miR-5132-5p 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCCTGAG ；
[0099]定量正向引物:GGGCGTGGGGTGGTGGA；
[0100]內參 snoRNA202 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAAITITITITITTCATCAG ；
[0101 ]定量正向引物:GTACTTTTGAACCCTTTTCCAT ；
[0102]定量通用反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGT；
[0103]定量通用Taqman 探針:56_FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAITT/3 IABkFQ。
[0104]實施例3人結腸癌組織標本收集
[0105]16對結直腸癌組織、6對結腸腸炎組織及其配對正常組織皆從新鄉醫學院第一附屬醫院和新鄉醫學院附屬中心醫院收集，標本儲存於-80°C環境中。[0106]實施例4RNA提取
[0107]按照操作手冊步驟用Trizol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取冰凍的結腸癌及其鄰近正常結腸組織的 RNA。用 A-Plus? Poly(A) Polymerase Tailing Kit (CELLSCRIPT,INC)按操作手冊對miRNA進行加polyA。
[0108]實施例5通過qRT-PCR對四個miRNA表達水平進行檢測
[0109]為了檢測來自結腸癌模型鼠中差異表達的miRNA是否有臨床意義，我們選擇了四個miRNA:即miR-138、miR-145、miR-146a、miR-150，在臨床病人標本中進行驗證。
[0110]使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo SCIE NTIFIC, USA)按操作手冊對加poly (A)的miRNA進行逆轉錄。
[0111]使用實時螢光定量PCR (Applied Biosystem Inc.)對miRNA進行定量分析。定量的反應體系:GoTaq Hot Start Colorless Master MixlO μ I,上遊引物 0.4 μ I,下遊引物0.4 μ I,probe0.5 μ I, diluted cDNA2 μ I, RNase-free water6.7 μ I。反應條件:95°C 2min ；變性95°C 10s，退火/延伸60°C 30s，共40個循環。
[0112]所使用的引物如下 :
[0113]hsa-miR-138 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCGGCCT ；hsa-miR-138 定量正向引物:TGGAGCTGGTGTTGTGAATC。
[0114]hsa-miR-145 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAGGGAT ；hsa-miR-145 定量正向引物:GGGTCCAGITTTCCCAGGA。
[0115]hsa-miR-146a 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTAACCCA ；hsa-miR-146a 定量正向引物:TTCGGTGAGAACTGAATTCCA
[0116]hsa-miR-150 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTCACTGG ；hsa-miR-150 定量正向引物:CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA
[0117]內參 SN0RD44 逆轉錄引物:GTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAAITITITITITTagtcag ;內參 SN0RD44 定量正向引物:TGGCCTGGATGATGATAAGCA。
[0118]定量通用反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGT；
[0119]定量通用Taqman 探針:56-FAM/CAGAGCCAC/ZEN/CTGGGCAAITT/3 IABkFQ。
[0120]結腸癌組織與癌旁正常組織中4個miRNA的表達結果如圖4_7所示:與正常組織相比，16個癌組織中miR-138、miR-145、miR_146a、miR-150的總體表達水平分別減少了
3.37,3.39,2.56,4.99 倍(Ρ〈0.001)。16 個癌組織中 miR-138 和 miR-150 的表達都是降低的，15個癌組織中miR-145和miR_146a的表達是降低的。
[0121]結腸炎組織與正常結腸組織中4個miRNA的差異表達結果如圖8_11所示:這4個miRNAs在人的結腸炎組織中的表達也是下調的，因此，這幾個miRNA可能參與結腸炎的惡性轉化。
[0122]雖然，上文中已經用一般性說明、【具體實施方式】及試驗，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
【權利要求】
1.一種與結直腸炎惡性轉變相關的miRNA標誌物，其特徵在於，該標誌物為miR-138-5p、miR-145-5p、miR-146a-5p 和 miR-150_5p 的組合。
2.一種如權利要求1所述的miRNA標誌物的引物，其特徵在於，該引物為: miR-138-5p 的正向引物序列為:5』 -TGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3』 ； miR-145-5p 的正向引物序列為:5』 -GGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3』 ； miR-146a-5p 的正向引物序列為:5』 -TTCGGTGAGAACTGAATTCCA-3』 ； miR-150-5p 的正向引物序列為:5』 -CCGGGTCTCCCAACCCTTGTA-3』 ； 通用反向引物序列為:5』 -CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3』。
3.權利要求1所述的miRNA標誌物在製備直腸癌早期診斷試劑盒中的應用。
4.權利要求2所述的miRNA標誌物的引物在製備直腸癌早期診斷試劑盒中的應用。
5.一種直腸癌早期診斷試劑盒，其特徵在於，試劑盒含有權利要求2所述的miRNA標誌物的引物。
6.根據權利要 求5所述的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒還包括PCR反應常用的酶和試 劑。
【文檔編號】C12N15/11GK103966328SQ201410191812
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】鮑永華, 楊萬才, 郭永臣, 李澤信, 薛會朝, 朱紹輝, 徐紅偉, 遊焜, 韓榮飛, 賈慧婕, 李凱, 王倩 申請人:新鄉醫學院