放線菌的代謝產物及其製備的抑制物的製作方法

2023-10-20 00:29:17 1

放線菌的代謝產物及其製備的抑制物的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物領域，具體而言，涉及一种放線菌的代謝產物及其製備的抑制物。放線菌的代謝產物，所述代謝產物包括：糖基多肽、鄰苯二甲酸二丁酯、無色天竺葵素；所述放線菌為從桃樹根癌病的土壤中篩選出的菌株。本發明放線菌的代謝產物包括：糖基多肽、鄰苯二甲酸二丁酯、無色天竺葵素。由該代謝產物製備的抑制物包括以質量比計，所述抑制物用於抑制桃根癌病菌。達到了較好的抑菌效果。由於放線菌是從桃樹高髮根癌病的土壤中篩選出的具有耐氰作用的菌株。因此本發明主要作用於引起桃樹根癌病的根癌弄桿菌有效。
【專利說明】放線菌的代謝產物及其製備的抑制物
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物領域，具體而言，涉及一种放線菌的代謝產物及其製備的抑制物。【背景技術】
[0002]桃樹根癌病(亦稱冠癭病)是一種世界範圍的植物細菌腫瘤病害，是根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)通過自然轉基因方式引發的基因病害。桃樹根癌病在我國江蘇、浙江、福建及上海郊區普遍發生，北京南口農場桃樹根癌病發病率為58.2%-100%。桃樹染病後在根及根莖部形成大小不等的腫瘤，影響根部的水分和養料吸收，病株常表現為葉黃、勢弱，使果實產量和品質下降，嚴重的甚至毀園、絕收。
[0003]目前桃樹根癌病在生產上主要以化學農藥和抗菌劑防治為主，雖有一定效果，但經長期實踐證明，這種防治方法存在以下不足:長期使用會造成土壤汙染，產品不安全，不利於環保，不利於消費者健康。
[0004]另外，採用了生物防治的方法，比如:1972年Kerr從土壤桿菌中分離得到的放射土壤桿菌K84菌株，對核果類果樹及其近源花卉的根癌病具有良好防效，但只對根癌土壤桿菌的生化I型和II型病菌具有防效，對根瘤菌的生化III型病菌無效。。近年來我國報導分離出的放射土壤桿菌HLB-2、E26和Ml 15對葡萄根癌病菌有明顯抑制作用，經大田試驗防效為85%-100%。2004年王關林等篩選出高產細菌素的菌株WJK84-1和其產生的細菌素均對櫻桃冠癭瘤病原菌C58有明顯的抑制作用，抑瘤率達到83.4%左右。這些防治方法防治效果好，但是，由於桃樹根 系分泌一種物質即扁桃甙(氰的配糖體)，在微生物的作用下分解為苯甲醛和氫氰酸(HCN)，桃根圍這些有毒物質會致使一些微生物死亡。利用上述生物防治方式並不適用。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一种放線菌的代謝產物及其製備的抑制物，以解決上述的問題。
[0006]在本發明的實施例中提供了一种放線菌的代謝產物，所述代謝產物包括:糖基多肽、鄰苯二甲酸二丁酯、無色天竺葵素；
[0007]所述放線菌為從桃樹根癌病的土壤中篩選出的菌株。
[0008]優選的，所述糖基多肽的提取方法包括:
[0009]將放線菌置於高氏液體培養基中進行培養得到第一放線菌菌株發酵液；
[0010]將所述第一放線菌菌株發酵液進行離心分離得第一上清液；
[0011 ] 將所述第一上清液通過無菌濾膜過濾；
[0012]在濾液中加入(NH4)2SO4至60%飽和度，靜置，離心得沉澱；
[0013]將所述沉澱用截流分子量為8000-14000道爾頓的透析袋在0.lmol/L磷酸緩衝液中透析過夜，離心，得上清粗提物；所述磷酸緩衝液的pH值優選為7 ；
[0014]將所述上清粗提物進行高效液相色譜分離提純；[0015]對高效液相色譜分離提純後的產物進行中壓製備色譜分離提純；
[0016]收集中壓製備色譜分離提純後的產物冷凍乾燥得到所述糖基多肽。
[0017]優選的，所述高效液相色譜分離提純包括:
[0018]所述上清粗提物經0.22微米微孔濾膜過濾；流動相:以體積比，乙腈:水為3:7 ；色譜柱為zorboxXDB-C18，其管徑為4.6毫米，柱長為150毫米，填充物粒徑為5微米；268納米的紫外線檢測；柱溫為25°C，流速為1.0毫升.mirT1，進樣量為10微升。
[0019]優選的，所述中壓製備色譜分離純化包括:
[0020]質譜柱為zorboxXDB-C18，其管徑為4.6納米，柱長為250納米，填充物粒徑為20微米，流動相:體積比，乙腈:水=3:7，268納米的紫外線檢測，柱溫25°C，流速為10毫升.min \進樣量為200微升。
[0021]優選的，所述高氏液體培養基每升包括:可溶性澱粉20g，KNO3Ig, K2HPO40.5g，NaCl0.5g, MgSO40.5g, FeSO40.01g,瓊脂 20g, pH 值 7.2 ~7.4 ;
[0022]優選的，所述放線菌在高氏液體培養基中培養的條件為:培養溫度為28°C，180轉/分鐘的震蕩條件，培養時間為8天；
[0023]和/ 或，
[0024]優選的，在對所述第一放線菌菌株發酵液進行離心分離時採用的離心速度為10000轉/分鐘，離心時間優選為15分鐘。
[0025]優選的，所述糖基多肽的檢測方法為:`[0026]提純後的糖基多肽用少量基質溶解得到水溶物，取0.5微升所述水溶物於基質輔助雷射解吸電離MALDI目標板上，風乾所述目標板，風乾後置於MALD1-T0FMS中檢測，得到一級質譜圖後，進行二級質譜檢測。經過MALD1-T0FMS檢測後的三個主要質量紋，進行MALD1-T0FMS/MS 二次雷射檢測，並對其顯示的二級質量紋圖譜，確定其為糖基多肽；所述基質為以體積比計，乙腈--水為3:7。
[0027]優選的，所述鄰苯二甲酸二丁酯和所述無色天竺葵素的提取方法包括:
[0028]將放線菌置於高氏I號液體培養基中進行培養得到第二放線菌菌株發酵液；
[0029]將所述第二放線菌菌株發酵液過濾濾除放線菌菌體和發酵殘渣，得到第二上清液；
[0030]向所述第二上清液中加入固體硫酸銨，離心並收集離心上清液；
[0031]用乙酸乙酯對所述離心上清液進行一次以上的萃取，合併萃取液；
[0032]將合併後的所述萃取液進行減壓濃縮得到粗提物；
[0033]採用S印hadex LH_20柱層析對所述粗提物進行分離得到分離產物；
[0034]將所述分離產物進行減壓濃縮，以根癌土壤桿菌為指示菌，採用K-B濾紙片法測定各組分抑菌活性，挑選抑菌活性組分；
[0035]將所述抑菌活性組分進行高效液相色譜分離確定出峰保留時間；
[0036]將經過高效液相色譜分離後的產物進行中壓製備色譜分離純化；
[0037]對中壓製備色譜分離純化後的產物進行減壓濃縮，得到鄰苯二甲酸二丁酯和無色
天竺葵素。
[0038]優選的,採用Sephadex LH-20柱層析包括:`[0039]用分段洗脫法，洗脫梯度水(體積):甲醇(體積)依次為7:3，5:5，3:7，1:9;[0040]每個梯度I倍體積洗脫液，流速控制在0.8-1.0mL/min ；
[0041]用核酸蛋白檢測儀在254納米下監測，並根據出峰情況分部收集得到分離產物。
[0042]優選的，所述高效液相色譜分離包括:
[0043]將抑菌活性組分經0.22 μ m微孔濾膜過濾，流動相:甲醇和水，梯度洗脫:O-1Omin, 30% 甲醇;10_20min, 30%_60% 甲醇；20_30min，60% ~80% 甲醇；30-40min, 80%-90%甲醇；40-50min, 90%-50%甲醇；254nm紫外檢測；柱溫25 °C，色譜柱為ZORBAXEclipseXDB-C18，其管徑為4.6毫米，柱長為150毫米，填充物粒徑為5微米；流速為1.0毫升.π?η-1，進樣量為10微升。 [0044]優選的，所述中壓製備色譜分離純化包括:
[0045]取活性較強組分0.5克，用乙腈的體積:水的體積為3:7的流動相溶解，製成濃度為500毫克/毫升的待測樣品，將I毫升的待測樣品經0.22微米微孔濾膜過濾，200微升的進樣量，色譜柱為Waters C0SM0SIL5C18-MS-1I，其管徑為20毫米，柱長為250毫米，流速為
10毫升/分鐘。
[0046]在一些實施例中，本發明提供了上述任一項所述的放線菌的代謝產物製備的抑制物，包括:以質量比計，糖基多肽:鄰苯二甲酸二丁酯:無色天竺葵素為1:1:1 ;所述抑制物用於抑制根癌病菌。
[0047]本發明上述實施例提供的放線菌的代謝產物包括:糖基多肽、鄰苯二甲酸二丁酯、無色天竺葵素。由該代謝產物製備的抑制物包括以質量比計，糖基多肽:鄰苯二甲酸二丁酯:無色天竺葵素為1:1:1;所述抑制物用於抑制桃根癌病菌。達到了較好的抑菌效果。由於放線菌是從桃樹高髮根癌病的土壤中篩選出的具有耐氰作用的菌株。因此該放線菌的代謝產物主要作用於引起桃樹根癌病的根癌弄桿菌有效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1示出了糖基多肽(al)、鄰苯二甲酸二丁酯(a2)、無色天竺葵素(a5)、抑制物(a3 )、硫酸銨(a4)、乙酸乙酯(a6 )的抑制效果示意圖。
【具體實施方式】
[0049]下面通過具體的實施例子並結合附圖對本發明做進一步的詳細描述。
[0050]在本發明的實施例中提供了一种放線菌的代謝產物，所述代謝產物包括:糖基多肽、鄰苯二甲酸二丁酯、無色天竺葵素；所述放線菌為從桃樹根癌病的土壤中篩選出的菌株。
[0051]在一些實施例中，本發明提供了上述任一項所述的放線菌的代謝產物製備的抑制物，包括:以質量比計，糖基多肽:鄰苯二甲酸二丁酯:無色天竺葵素為1:1:1;所述抑制物用於抑制根癌病菌。
[0052]本發明上述實施例提供的放線菌的代謝產物包括:糖基多肽、鄰苯二甲酸二丁酯、無色天竺葵素。由該代謝產物製備的抑制物包括以質量比計，糖基多肽:鄰苯二甲酸二丁酯:無色天竺葵素為1:1:1 ;所述抑制物用於抑制根癌病菌。達到了較好的抑菌效果。
[0053]接下來通過一些實施例來詳細描述該代謝產物的製備方法:
[0054]糖基多肽的提取方法:[0055]放線菌G-19在高氏液體培養基中，高氏液體培養基每升包括:可溶性澱粉20g，KN031g, K2HP040.5g, NaCl0.5g, MgS040.5g, FeS040.01g，瓊脂 20g, pH 值 7.2 ~7.4 ;，在28°C, 180r/min的條件下震蕩培養8天,放線菌菌株發酵液離心(lOOOOr/min, 15min),得上清液，無菌濾膜過濾，加入(NH4) 2S04至60%飽和度,靜置2h, 10000r/min離心IOmin,取沉澱，用截流分子量為8000-14000道爾頓的透析袋在0.lmol/L磷酸緩衝液(pH7.0)中透析過夜，離心10000r/min低溫離心IOmin,棄不溶物,得上清粗提物。
[0056]可溶性澱粉為白色或類白色粉末，系玉米澱粉改性而成。
[0057]將上清粗提物分別經過高效液相色譜儀和中壓製備色譜儀進行分離純化。
[0058]高效液相色譜:樣品經0.22 μ m微孔濾膜過濾,流動相:乙腈:水(v:v,即體積比)=3:7,色譜柱為zorboxXDB-C18(4.6mmX 150mm, 5 μ m即:管徑為4.6毫米，柱長為150毫米，填充物粒徑為5微米)；268nm紫外檢測，柱溫25°C，流速為1.0mL.mirT1，進樣量為10 μ L。
[0059]中壓製備色譜:質譜柱為zorboxXDB_C18 (4.6_X 250mm, 20 μ m,即管徑為4.6納米，柱長為250納米,填充物粒徑為20微米),流動相:乙腈:水(V: V) =3:7, 268nm紫外檢測，柱溫25°C，流速為IOmL.mirT1，進樣量為200 μ L0
[0060]經製備色譜後，收集冷凍乾燥為糖基多肽，其為粉狀樣品。
[0061]純化後的樣品用少量基質(乙腈:水(V:V)=3: 7溶解得到水溶物，取0.5uL該水溶物於 MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation)目標板上，風乾所述目標板，等風乾後置於MALD1-T0FMS中檢測，得到一級質譜圖後，進行二級質譜檢測。經過MALD1-TOFMS檢測後的三個主 要質量紋，進行MALD1-T0FMS/MS 二次雷射檢測，並對其顯示的二級質量紋圖譜，確定其為糖基多肽。對根癌病菌有較好的抑制效果見圖1中的al (糖基多肽的抑制效果)。
[0062]鄰苯二甲酸二丁酯、無色天竺葵素的提純是混合在一起提純，提純方法為:
[0063]將放線菌菌株G-19接種到高氏I號液體培養基中，28° C搖床(轉速為120r/min)培養7天後，濾除菌體和發酵殘渣，取上清液加不用飽和度的固體硫酸銨，去掉蛋白部分，靜置12小時後，4° C、12000r/min離心lOmin，收集上清液部分。
[0064]上清液用等體積的乙酸乙酯取2次，合併萃取液，40° C減壓濃縮至幹，得抑菌物質粗提物。
[0065]抑菌物質粗提物採用SepHadex LH-20柱層析對抑菌粗提物進行分離。用分段洗脫法，洗脫梯度體積(水):體積(甲醇)依次為7: 3，5: 5，3: 7，1:9。每個梯度I倍體積洗脫液，流速控制在0.8-1.0mL/min。用核酸蛋白檢測儀在254nm下監測,並根據出峰情況分部收集得到分離產物。
[0066]將分離產物減壓濃縮後，以根癌土壤桿菌為指示菌，採用K-B濾紙片法測定各組分抑菌效果，抑菌活性組分活性較強部分(抑菌活性組分)作為下一步驟的起始樣品進一步純化。
[0067]將抑菌活性組分進行如下操作:所述高效液相色譜分離包括:將抑菌活性組分經0.22 μ m微孔濾膜過濾，流動相:甲醇和水，梯度洗脫:0-10min，30%甲醇；10_20min，30%-60% 甲醇；20-30min，60% ~80% 甲醇；30_40min，80%_90% 甲醇；40_50min，90%_50% 甲醇；254nm紫外檢測；柱溫25°C，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18，其管徑為4.6毫米，柱長為150毫米，填充物粒徑為5微米；流速為1.0毫升.min-1，進樣量為10微升；[0068]高效液相色譜能夠確定樣品準確的出峰保留時間。
[0069]經過高效液相色譜分離後的產物進行如下操作:所述中壓製備色譜分離純化包括:取活性較強組分0.5克，用乙腈的體積:水的體積為3:7的流動相溶解，製成濃度為500毫克/毫升的待測樣品，將I毫升的待測樣品經0.22微米微孔濾膜過濾，200微升的進樣量，色譜柱為Waters C0SM0SIL5C18-MS-1I，其管徑為20毫米，柱長為250毫米，流速為10毫升/分鐘。中壓製備色譜處理能夠達到富集效果。
[0070]對中壓製備色譜分離純化後的產物進行減壓濃縮，得到鄰苯二甲酸二丁酯和無色天竺葵素。鄰苯二甲酸二丁酯和無色天竺葵素檢測方法為:採用液質聯用(LC-MS)和核磁共振(NMR)對所得純品進行結構測定，得到兩種化合物。對根癌病菌的抑制效果見圖l，a2(鄰苯二甲酸二丁酯的抑制效果)和a5 (無色天竺葵素的抑制效果)。
[0071]將上述代謝產物進行混合配比後製備抑制物，製備添加比例為:以質量比計，糖基多肽:鄰苯二甲酸二丁酯:無色天竺葵素為1:1:1;所述抑制物用於抑制根癌病菌，其對根癌病菌的抑制效果見圖la3 (糖基多肽:鄰苯二甲酸二丁酯:無色天竺葵素按1:1:1製備的抑制物的抑制效果)。
[0072]由於在上述的各種處理步驟中涉及到了硫酸銨和乙酸乙酯，為了排除硫酸銨、乙酸乙酯的抑菌可能性，也對這種中物質進行了抑菌檢測，如圖1的a4、a6，其中a4為硫酸銨的抑制效果，a6為乙酸乙酯的抑制效果。
[0073]以上所述僅為本發明的 優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一种放線菌的代謝產物，其特徵在於， 所述代謝產物包括:糖基多肽、鄰苯二甲酸二丁酯、無色天竺葵素； 所述放線菌為從桃樹根癌病的土壤中篩選出的菌株。
2.如權利要求1所述的代謝產物，其特徵在於， 所述糖基多肽的提取方法包括: 將放線菌置於高氏液體培養基中進行培養得到第一放線菌菌株發酵液； 將所述第一放線菌菌株發酵液進行離心分離得第一上清液； 將所述第一 上清液通過無菌濾膜過濾； 在濾液中加入(NH4) 2S04至60%飽和度，靜置，離心得沉澱； 將所述沉澱用截流分子量為8000-14000道爾頓的透析袋在0.lmol/L磷酸緩衝液中透析過夜，離心，得上清粗提物；所述磷酸緩衝液的PH值優選為7 ； 將所述上清粗提物進行高效液相色譜分離提純； 對高效液相色譜分離提純後的產物進行中壓製備色譜分離提純； 收集中壓製備色譜分離提純後的產物冷凍乾燥得到所述糖基多肽。
3.如權利要求2所述的代謝產物，其特徵在於， 所述高效液相色譜分離提純包括: 所述上清粗提物經0.22微米微孔濾膜過濾；流動相:以體積比，乙腈:水為3:7 ;色譜柱為zorboxXDB-C18，其管徑為4.6毫米，柱長為150毫米，填充物粒徑為5微米；268納米的紫外線檢測；柱溫為25°C，流速為1.0毫升.mirT1，進樣量為10微升。
4.如權利要求2所述的代謝產物，其特徵在於， 所述中壓製備色譜分離純化包括: 質譜柱為zorboxXDB-C18，其管徑為4.6納米，柱長為250納米，填充物粒徑為20微米，流動相:體積比，乙腈:水=3:7,268納米的紫外線檢測，柱溫25°C，流速為10毫升.mirT1,進樣量為200微升。
5.如權利要求2所述的代謝產物，其特徵在於， 所述高氏液體培養基每升包括:可溶性澱粉20g, KNO3Ig, K2HPO40.5g，NaCl0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g,瓊脂 20g, pH 值 7.2 ~7.4 ;和 / 或， 所述放線菌在高氏液體培養基中培養的條件為:培養溫度為28°C，180轉/分鐘的震蕩條件，培養時間為8天； 和/或， 在對所述第一放線菌菌株發酵液進行離心分離時採用的離心速度為10000轉/分鐘，離心時間優選為15分鐘。
6.如權利要求1所述的代謝產物，其特徵在於， 所述糖基多肽的檢測方法為: 提純後的糖基多肽用少量基質溶解得到水溶物，取0.5微升所述水溶物於基質輔助雷射解吸電離MALDI目標板上，風乾所述目標板，風乾後置於MALD1-T0FMS中檢測，得到一級質譜圖後，進行二級質譜檢測，經過MALD1-T0FMS檢測後的三個主要質量紋，進行MALD1-T0FMS/MS 二次雷射檢測，並對其顯示的二級質量紋圖譜，確定其為糖基多肽； 所述基質為以體積比計，乙腈:水為3:7。
7.如權利要求1所述的代謝產物，其特徵在於， 所述鄰苯二甲酸二丁酯和所述無色天竺葵素的提取方法包括: 將放線菌置於高氏I號液體培養基中進行培養得到第二放線菌菌株發酵液； 將所述第二放線菌菌株發酵液過濾濾除放線菌菌體和發酵殘渣，得到第二上清液； 向所述第二上清液中加入固體硫酸銨，離心並收集離心上清液； 用乙酸乙酯對所述離心上清液進行一次以上的萃取，合併萃取液； 將合併後的所述萃取液進行減壓濃縮得到粗提物； 採用Sephadex LH-20柱層析對所述粗提物進行分離得到分離產物； 將所述分離產物進行減壓濃縮，以根癌土壤桿菌為指示菌，採用K-B濾紙片法測定各組分抑菌活性，挑選抑菌活性組分； 將所述抑菌活性組分進行高效液相色譜分離確定出峰保留時間； 將經過高效液相色譜分離後的產物進行中壓製備色譜分離純化； 對中壓製備色譜分離純化後的產物進行減壓濃縮，得到鄰苯二甲酸二丁酯和無色天竺葵素。
8.如權利要求7所述的代謝產物，其特徵在於， 採用Sephadex LH-20柱層析包括: 用分段洗脫法，洗脫梯度水(體積):甲醇(體積)依次為7: 3，5: 5，3: 7，1:9 ; 每個梯度I倍體積洗脫液，流速控制在0.8-1.0mL/min ； 用核酸蛋白檢測儀在254納米下監測，並根據出峰情況分部收集得到分離產物。
9.如權利要求7所述的代謝產物，其特徵在於， 所述高效液相色譜分離包括:將抑菌活性組分經0.22 μ m微孔濾膜過濾，流動相:甲醇和水，梯度洗脫:0-10min,30% 甲醇;10_20min，30%_60% 甲醇；20_30min，60% ~80% 甲醇；30-40min,80%-90% 甲醇；40_50min，90%_50% 甲醇；254nm 紫外檢測；柱溫 25°C，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18，其管徑為4.6毫米，柱長為150毫米，填充物粒徑為5微米；流速為1.0毫升.min \進樣量為10微升； 和/或， 所述中壓製備色譜分離純化包括:取活性較強組分0.5克，用乙腈的體積:水的體積為3:7的流動相溶解，製成濃度為500毫克/毫升的待測樣品，將I毫升的待測樣品經0.22微米微孔濾膜過濾，200微升的進樣量，色譜柱為Waters COSMOSIL5C18-MS-1I，其管徑為20暈米，柱長為250暈米，流速為10毫升/分鐘。`
10.一種由權利要求1-9任一項所述的放線菌的代謝產物製備的抑制物，其特徵在於， 包括:以質量比計，糖基多肽:鄰苯二甲酸二丁酯:無色天竺葵素為1:1:1 ; 所述抑制物用於抑制桃根癌病菌。
【文檔編號】C07D311/62GK103614438SQ201310157227
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年4月28日 優先權日:2013年4月28日
【發明者】劉志民, 馬煥普, 季敬霖, 候柄竹, 王樹芳 申請人:北京農學院