人參二醇組皂苷微生物轉化產物及其製備方法
2023-10-20 00:27:07
專利名稱：人參二醇組皂苷微生物轉化產物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及人參二醇組皂苷微生物轉化產物。 本發明還涉及其製備方法。
背景技術：
五加科(Araliaceae)植物屬(Panax)植物具有很高的藥用價值， 其主要有效成分為皂苷類成分。生曬參(/^"ox: C.A.Meyer)中 人參皂苷有多種生理活性，根據文獻調査結果，可以得到以下幾點啟 示(1)關於人參二醇組皂苷微生物合成技術使17位碳上支鏈降解， 未見應用；(2)有抗炎、抗腫瘤、抗心律失常及抗衰老和益智等藥理 作用；(3)利用微生物合成技術可得到人參二醇組皂苷支鏈降解產物， 降解產物可能具有抗炎、抗腫瘤、抗心律失常及抗衰老和益智等藥理 作用，(4)原人參二醇組皂苷的抗炎、抗腫瘤等活性的活性中心在原 人參二醇配基上，而不在Cn側鏈上；是待進一步研究藥理活性的新 化合物。
然而，人參二醇組皂苷微生物合成產物及其藥理活性的研究還未 有相關報導。
發明內容
本發明提供了 ( I )人參二醇組皂苷微生物轉化產物。 本發明還提供了這種皂苷微生物轉化產物的製備方法。 本發明提供了具有下述通式(I)人參二醇組皂苷微生物合成水
解產物formula see original document page 6
其中R表示氫或葡萄糖基。
本發明的通式I化合物可按如下方法製備
人參二醇組皂苷微生物合成產物的製備方法，該方法包括以下步
a. 生曬參(屍a/7aAr57'/7se/^C.A.Meyer)鬚根取鬚根粗粉，用稀酸 調pH值為3 4，超聲提取，超聲時間每次30分鐘抽濾，合併濾液， 上D-101大孔吸附樹脂柱，蒸餾水至無色且為中性，再用稀鹼洗柱至 流出液成鹼性，再蒸餾水洗至中性且澄清無色，用75%乙醇洗脫至流 出液無皂苷反應為止，將乙醇洗脫液減壓回收至幹，殘渣即為人參皂 苷粗品。
b. 將人參總皂苷粗品溶於20倍量的95%乙醇中超聲溶解，抽 濾，濾液減壓回收至幹，殘渣即為精製人參皂苷。
c. 取人參皂苷溶於乙醇，利用溶解度梯度，通過稀鹼調節pH值 使二醇型皂苷沉澱析出。具體方法總皂苷溶於95%乙醇中過濾備用； 將0. 3%氫氧化鈉-乙醇溶液滴加入總皂苷的95%乙醇溶液中有沉澱析 出，放置過夜；過濾得沉澱乾燥即得人參二醇組皂苷即為原料。
d. 將半知菌綱、絲孢菌目、絲孢菌科、擬青黴屬(Paecilomyces) 的淡紫擬青黴(屍aec^o邁7ces "7a"'""s)菌種接種到裝有PD培養基的三角瓶中，以搖床搖速60 80r/min在搖床上振蕩培養菌絲球三 天，直徑大約為3 4mm。e. 將以分離得到的人參二醇組皂苷用少量甲醇溶解，加入到培養 後的菌液中，使皂苷濃度分別保持為1. 0 mg/mL左右，以搖速80r/min 培養一周。f. 將發酵液過濾，殘渣加蒸餾水超聲提取3次，每次10分鐘， 併入濾液，減壓濃縮至100mL。用氯仿萃取、正丁醇萃取至無皂苷反 應。合併氯仿、正丁醇萃取液，冋收溶劑至幹。g. 合併氯仿和正丁醇萃取物，先用D-101大孔樹脂75%乙醇洗 脫除去色素至無皂苷反應，回收乙醇得褐黃色固體粉末即人參二醇組 皂苷微生物轉化後產物。h. 人參二醇組皂苷微生物轉化產物用矽膠柱層析進行粗分(流 動相氯仿甲醇=5 : 1)得到(I )人參二醇組皂苷微生物合成產 物，由於其溶於甲醇，故採用ODS進行純化，得常溫黃色粘稠狀液體。本發明皂苷微生物轉化產物的藥理作用1、對神經系統的作用可抑制給予一次古柯鹼產生的活動過度以及重複給予古柯鹼發 生的逆轉耐受性和多巴胺受體過敏。這些作用可防止古柯鹼的不良反 應，也可抑制扭體反應的腹部收縮和甲醛所致咬舔後足反應。2 、對心血管系統的作用對小鼠急性腦缺血損傷有保護作用。對小鼠急性腦缺血損傷具有 保護作用，其作用機制與減輕組織酸中毒，抑制脂質過氧化損傷冇關。對抗自由基對心肌細胞的損傷，保護細胞膜的完整性。對正常兔 血小板聚集有抑制作用，可抑制失血性休克血小板腫脹，保持血小板的形態完整，減輕血小板聚集。3、對失血性休克保護機理的研究3. 1 、對單胺類遞質的影響可抑制交感-腎上腺髓質系統，和失血休克晚期血小板對5-HT 的釋放。3.2 、對血管緊張素的影響採用放免法測定血清睪酮，紫外分光光度法測定睪丸血管緊張素 轉換酶(ACE)的活性，觀察對遊泳訓練大鼠血清睪酮和ACE的影響。表 明其可能抑制運動大鼠ACE活性，提高血清睪酮水平。3.3 、對血清酶的影響觀察到失血性休克犬血清穀草轉氨酶，古丙轉氨酶、肌酸磷酸激 酶等顯著低於失血休克對照組。超氧化歧化酶(S0D)濃度，顯著高 於對照組，從而減少過氧化脂質，保護了組織細胞結構的完整。3.4、 對血糖的影響提示可抑制失血性休克時的糖原過渡分解；對內毒性休克動物也 有明顯的保護作用。4、 對脂代謝的作用對實驗性高脂血症大鼠血清總膽固醇(TC)、脂蛋白-膽固醇代謝 有影響並具有抗氧化作用。可能通過調節體內血脂代謝、提高 PGI2/TXA2比值及糾正自由基代謝紊亂發揮抗動脈硬化作用。5 、對生殖功能的作用精索靜脈曲張是引起男性不育症的常見原因。大鼠精索靜脈曲張 時睪丸脂質過氧化物(LP0)含量明顯增高。降低精索靜脈曲張時睪 丸LP0的含量，從而可減輕LPO對睪丸生殖細胞的損傷，因而改善生殖功能。6 、對蛋白質表達和核酸合成的作用可促進雄性大鼠腦垂體LH- e -mRNA表達增強，表明垂體促性腺細 胞內LH-e -mRNA含量增高，後者通過垂體性腺軸系統發揮作用而促進 血屮睪酮水平增加。7 、對免疫功能的影響對進行長期遊泳訓練的動物模型大鼠有免疫調節效應。免疫檢測 指標為淋巴細胞轉化實驗與胸腺細胞自發增殖反應。可以遏制長期遊 泳訓練大鼠胸腺細胞自發增殖反應指標下降的趨勢，對運動後胸腺細 胞自發增殖反應的恢復有促進效應，利於運動後機體細胞免疫功能的 恢復。8 、對腎功能的作用用夾閉法致家兔腎缺血，並提取缺血血清和對照血清，分別與人 腎小管細胞共培養，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細胞株吸光度(A) 值以判定其增殖活性，苔盼藍染色計算活細胞率。對正常培養和經 急性缺血再灌注腎損傷家兔血清處理後的小管細胞增殖的影響，並探 討其機制。可促進正常培養和急性缺血再灌注腎損傷性兔血清處理後 的人腎小管細胞增殖。9 、對突變的作用基因突變是一切疾病發生的根源，特別是癌症發生的根源。對 S-180艾氏腹水瘤、SMMC-7221肝癌細胞有明顯的殺傷作用。本發明產物溶於甲醇，在氯仿中有較大溶解度，常溫下為液態， 且由於其分子結構特點其製備方法簡便、高效、成本低；可用於新藥 研發及保健品和功能性食品的開發。具體實施例製備實施例14， 4， 8， 10， 14a， 20a-六甲基-鄰-甾-2， 12-二烯-24-酸-20-卩-CH 葡萄糖苷得化合物36mg，黃色粘稠狀液體，產率約1.1%由l3CNMR, 130.9 (C13), 130.0 (C12)， 128.0 (C3), 127.9 (C2) ;IR: 1664 cm—1 (—C = C一吸收峰)，1516 cm—1 (—C = C—吸收峰)，733 cm—1 (—C H = C H—順式吸收峰)，可知化合物I的分子結構中存在兩個一C-C-一。 13C NMR:178.4 (C24); IR:1714 cm—乂羰基吸收峰)，可以推斷化合物I 的分子結構中存在羰基。13C NMR: 108.9 (C1'), 96.8 (C2')， 78.9(C3'), 70.8(C4')， 70.5(C5')， 70.4(C6'); ^ NMR: 4.57 (d， J=6.8 Hz, 1H， CrH)， 可知在(:2上連接一分子P-D-葡萄吡喃糖ESI-MS: 1176(MX2+Na+ +11",100); 1174(MX2+Na十+H"—2H"，41); 597 (M+Na_—2tT,25); IR: 1287cm—i (—C_0_C—吸收峰)，1119cm—1 (—C —O — C—吸 收峰)，1072cm_1 (—C一O —C一吸收峰)，1381 cm—1 (—CH3吸收峰)， 可推斷化合物III分子式為C33H5208，化學名稱4， 4， 8， 10， 14a ， 20a -六甲基-5p -留-2， 12-二烯-24-酸-20-p -D-葡萄糖苷。製備實施例24， 4， 8， 10， 14a， 20x-六甲基-20-羥基-鄰-堪-2， 12-二烯-24-酸由13C NMR: 132.8 (C13)， 130.9 (C12)， 130.6 (C2),128.8 (C3); IR: 1600 cm—1 (—C二C一吸收峰)，1580 cm—、一C = C—吸收峰)，704 cm一1 (一C H = C H—順式吸收峰)，可知化合物I的分子結構中存在兩個 ~C=C—。 13CNMR:167.1(C24)，IR:1727cm—、羰基吸收峰)，可以推 斷化合物I的分子結構中存在羰基。由IR'. 3376 cm—^"OH吸收峰) 1287 cm—、一C —O — C—吸收峰)，1119 cm—1 (—C一0_C—吸收 峰)，1072 cm—1 (—C —0 —C—吸收峰)，1380 cm—1 (—CH3吸收 峰);ESI-MS (100eV) m/z (%): 391(M+Na+——C=0~,81), 371(M+Na+——C=0——H20—2H"，33), 360(M+Na+——C=0---OH—一CH廠，13)， 327(M+Na+——C=0---OH——CH2-----OH—~CH3,30)，分子式C27H4203;化學名稱4， 4， 8， 10， 14x， 2(h-六甲基-20-羥基-5卩-甾-2， 12-二烯-24-酸。製備方法例取生曬參鬚根粗粉6Kg，用5 796醋酸調PH值為3 4，超聲提 取，超聲時間每次30分鐘)抽濾，合併濾液，上D-101大孔吸附樹 脂柱，蒸餾水至無色且為中性，再用1%氫氧化鈉溶液洗柱至流出液 成鹼性，再蒸餾水洗至中性且澄清無色，用759&乙醇洗脫至流出液無 皂苷反應為止，將乙醇洗脫液減壓回收至幹，殘渣即為人參皂苷粗品， 將人參總皂苷粗品溶於20倍量的95%乙醇中超聲溶解，抽濾，濾液 減壓回收至幹，殘渣即為精製人參皂苷為580g，收率為9.67%;取人參 皂苷溶於乙醇，利用溶解度梯度，通過稀鹼調節pH值使二醇型皂昔 沉澱析出。具體方法總皂苷溶於95%乙醇中過濾備用；將0.396氫氧 化鈉-乙醇溶液滴加入總皂苷的95%乙醇溶液中有沉澱析出，放置過 夜；過濾得沉澱乾燥即得人參二醇組皂苷即為為原料；將半知菌綱、 絲孢菌目、絲孢菌科、擬青黴屬(Paecilomyces)的淡紫擬青黴 (屍ae"7o/z yces A7a"72us)菌種。接種到裝有PD培養基(土豆200g; 水1000mL;蔗糖20g，攪拌溶解，分裝封好瓶口後溼熱滅菌即製成PD 液體培養基)的三角瓶中，以搖床搖速60 80r/min在搖床上振蕩培 養菌絲球三天，直徑大約為3 4mm;將以分離得到的人參二醇組皂 苷用少量甲醇溶解，加入到培養後的菌液中，使皂苷濃度分別保持為 1.0mg/mL左右，以搖速80r/min培養--周；將轉化後的菌絲球和發酵液過濾分離，用等體積的蒸餾水浸泡菌絲球，將菌絲球超聲提取3 次，每次10分鐘，合併提取的水溶液，減壓濃縮至發酵液的體積。 菌絲球提取的濃縮液和發酵液分別用氯仿萃取、正丁醇萃取。用10% 硫酸水溶液，顯色10分鐘，無皂苷反應，菌絲球提取的濃縮液和發 酵液中己無皂苷，停止萃取。分別合併氯仿、正丁醇萃取液，回收溶 劑至幹；合併氯仿和正丁醇萃取物，先用D-101大孔樹脂75%乙醇洗脫 除去色素至無皂苷反應，回收乙醇得褐黃色固體粉末即微生物轉化後 產物取體積比為1 : 20 (98%濃硫酸50%乙醇)的硫酸-乙醇水解 液；在70'C 80'C水浴中熱回流溫和水解72小時 120小時每一小 時薄層層析顯色定性即各點無變化後，加水稀釋，回收乙醇；水解液 分別用氯仿、正丁醇萃取，蒸餾水洗氯仿和正丁醇萃取液至中性，然 後滴加幾滴5% 7%稀氨水；回收氯仿和正丁醇合併固體粉末，得人 參二醇組皂苷微生物轉化水解產物；所得微生物轉化後人參二醇皂苷 水解產物，用矽膠層析柱進行粗分(流動相氯仿乙酸乙酯=3 : 1) 得到(I)人參二醇組皂苷微生物合成水解產物水解產物，由於其溶 於甲醇，故採用ODS進行純化，得常溫及-2(TC均為黃色粘稠狀液體。
權利要求
1. top= "91" left = "84"/>其中R表示氫或葡萄糖基。
2. 按照權利要求1的微生物轉化產物，其中R表示葡萄糖基， 化學名稱4， 4， 8， 10， 14a， 20x-六甲基-鄰-甾_2， 12-二烯-24-酸-20-p -D-葡萄糖苷。
3. 按照權利要求1的微生物轉化產物，其中R表示氫，化學名 稱4， 4， 8， 10， 14a， 2Qx-六甲基-20-羥基-鄰-甾-2， 12-二烯-24-酸。
4 、權利要求1的人參二醇組皂苷微生物合成產物的製備方法， 該方法包括以下步驟a.生曬參鬚根取鬚根粗粉，用稀酸調pH值為3 4，超聲提取，超聲時間每次30分鐘抽濾，合併濾液，上D-101大孔吸附樹脂柱， 蒸餾水至無色且為中性，再用稀鹼洗柱至流出液成鹼性，再蒸餾水洗 至中性且澄清無色，用75%乙醇洗脫至流出液無皂苷反應為止，將乙 醇洗脫液減壓回收至幹，殘渣即為人參皂苷粗品；b. 將人參總皂苷粗品溶於20倍量的95%乙醇中超聲溶解，抽 濾，濾液減壓回收至幹，殘渣即為精製人參皂苷；c. 取人參皂苷溶於乙醇，利用溶解度梯度，通過稀鹼調節pH值 使二醇型皂苷沉澱析出；d. 將半知菌綱、絲孢菌目、絲孢菌科、擬青黴屬的淡紫擬青黴菌 種接種到裝有PD培養基的三角瓶中，以搖床搖速60 80r/min在搖 床上振蕩培養菌絲球三天，直徑大約為3 4mm;e. 將以分離得到的人參二醇組皂苷用少量甲醇溶解，加入到培養 後的菌液中，使皂苷濃度分別保持為1. 0 mg/mL，以搖速80r/min培養--周；f. 將發酵液過濾，殘渣加蒸餾水超聲提取3次，每次10分鐘， 併入濾液，減壓濃縮至lOOmL,用氯仿萃取、正丁醇萃取至無皂苷反 應，合併氯仿、正丁醇萃取液，回收溶劑至幹；g. 合併氯仿和正丁醇萃取物，先用D-101大孔樹脂75%乙醇洗 脫除去色素至無皂苷反應，回收乙醇得褐黃色固體粉末即人參二醇組 皂苷微生物轉化後產物；h. 人參二醇組皂苷微生物轉化產物用矽膠柱層析進行粗分，其 中流動相氯仿甲醇=5 : 1，得到(I )人參二醇組皂苷微生物合成產物。
5. 按權利要求4中a步驟屮稀酸為5 7%醋酸；稀鹼為 化鈉溶液。
6. 按照權利要求4的方法，其中步驟d中所述PD培養基配方為 土豆200g;水1000mL;蔗糖20g，攪拌溶解，分裝封好瓶U後溼熱火 菌即製成PD液體培養基。
7. 按照權利要求4的方法，其屮步驟C中所述具體方法總皂苷 溶於95%乙醇中過濾備用；將0. 3%氫氧化鈉-乙醇溶液滴加入總皂苷 的95%乙醇溶液中有沉澱析出，放置過夜；過濾得沉澱乾燥即得人參 二醇組皂苷即為原料。
全文摘要
人參二醇組皂苷微生物轉化產物及其製備方法，涉及人參二醇組皂苷微生物轉化產物，以及製備方法。本發明提供了具有下述通式(I)人參二醇組皂苷微生物合成水解產物。其中R表示氫或葡萄糖基。採用醇提及培養基培養等工藝製取。本發明產物溶於甲醇，在氯仿中有較大溶解度，常溫下為液態，且由於其分子結構特點其製備方法簡便、高效、成本低；可用於新藥研發及保健品和功能性食品的開發。
文檔編號C07J9/00GK101284858SQ200810050758
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月30日 優先權日2008年5月30日
發明者張連學, 袁金田 申請人:吉林農業大學