一種純化魨毒素的方法
2023-10-19 23:38:47 1
專利名稱：一種純化魨毒素的方法
技術領域：
本發明屬於生物產品提取技術領域，更具體涉及一種純化魨毒素的方法。
魨毒素(tetrodotoxin)，俗稱河魨毒素是一種毒性很強的麻痺性神經毒素，最先發現於魨形目(tetraodontiformes)魚類，故稱魨毒素(tetrodotoxin)。後來在爬行類，如鯢(俗稱娃娃魚)；甲殼類，如蟹；以及微生物中的細菌與藻類中，均有發現。經檢索中國專利，CN1058717C，「脫水河豚毒素的提取方法」，該發明的步驟是(1)純化河豚毒素母液製備先將粗品河豚毒素加5-20％醋酸溶解，加無水乙醇1-10倍，離心除去不溶物，然後將上清液移到小燒杯、貯藏在密閉的容器中，並另放一杯乙醚，控制溫度5-35℃、12-72小時，最後將醇醚溶液經離心分離出河豚毒素母液，母液經濃縮，加氨水調節PH 7-10，收集其沉澱物；(2)高壓液相色譜分離提取脫水河豚毒素；將上述沉澱物，用1-30％磷酸溶解，用流動相組成含有0.1-10％甲醇的0.01-0.2M磷酸鹽緩衝液，調PH為5.7，流動相流速1-20ml/min，用示差檢測器進行檢測，分離過程按記錄儀上出峰圖，收集脫水豚毒餾份；(3)脫水河豚毒素餾份有脫鹽、回收選用填料為酸性陽離子交換樹脂和生物凝膠，洗脫劑用1-20％的醋酸，收集PH 4-7餾份，加氨水調節PH 7.5-10，可沉澱出脫水豚毒素，經反覆脫鹽，可得到純品脫水河豚毒素結晶，設備昂貴，產量很低。還有一種製備(純化)魨毒素的方法，均以日本人T.後藤等(1965)的方法為經典，(Tetrahedron，1965，Vol.212059-2088).然而，在實踐中發現，上述方法中有些步驟很難實施，而且步驟太多，每個步驟都有損失，總得率為50％，繁雜。一般技術工人難以操作，難於工廠化。
本發明的目的是提供了一種純化魨毒素的方法，方法簡單，操作方便，所得純魨毒素的純度符合藥用劑型的需要，又能生產色譜試劑。
為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施，一種純化魨毒素的方法，其步驟是A、離子交換層析，使用弱酸性陽離子交換樹脂中適於工業規模生產用的型號裝柱，轉換成銨型或氫型，將pH調整為4.0-6.5，將經過澄清的魨毒素粗提液上柱，先以純水或緩衝液或低於0.4N濃度的乙酸溶液洗柱，再以0.1-2N濃度的乙酸一步或分步洗脫，或使用0.01-2.5N乙酸梯度洗脫，收集這一部分含魨毒素的洗脫液，減壓蒸發至幹，然後重溶於少量0.01-0.15N乙酸中B、凝膠過濾層析，選用排阻分子量在1500-4000Da，且適於充填大柱的凝膠裝柱，將第一步驟所得魨毒素的乙酸溶液上柱，用0.01-0.15N乙酸洗脫，收集含魨毒素的洗脫液，得純魨毒素的乙酸鹽溶液，或者再減壓蒸發至幹，得純魨毒素的乙酸鹽固體。
若須獲得極純粹的魨毒素，可將第二步驟所得純魨毒素等當量地溶於苦味酸中，使成為苦味酸鹽。冷卻後形成苦味酸鹽的沉澱，分離沉澱，然後在熱水中溶解，加NH4OH使pH上升至9，讓純毒素沉澱下來，過濾收集沉澱，再重新溶於少量稀乙酸溶液中。即獲得極純粹的毒素乙酸鹽溶液。
第二步驟所得的純魨毒素的乙酸鹽固體，重溶於鹽酸溶液中，再減壓蒸發至幹，即或得魨毒素的鹽酸鹽固體。重溶於檸檬酸溶液中，再減壓蒸發至幹，即或得魨毒素的檸檬酸鹽固體。重溶於苦味酸溶液中，再減壓蒸發至幹，即或得魨毒素的苦味酸鹽固體。製備過程中，可根據藥用劑型的需要，依上述法轉換為所需要的鹽。魨毒素在酸溶液中相當穩定，如使用液體劑型，則不必乾躁。
如果魨毒素粗提液含有相當多的大分子幹擾純化，可採用配置截留分子量500-5000Da的超濾膜的切向流超濾系統，過濾一次，作為預處理步驟。濾液即可用於第一步驟離子交換柱純化。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果經過澄清的魨毒素粗提液，只要經過本發明的純化方法的第一、二兩個步驟的處理，即能成為純魨毒素。用薄層層析法檢測，本方法所得到的純魨毒素與西格瑪化學品公司(SIGMA Chemical Co.)的色譜純魨毒素一樣，只產生一個帶，RF值完全相同，均為0.535。本發明方法簡單，操作方便，步驟少，得率高，尤其是凝膠過濾層析這工序幾乎沒有損失，得率在70-90％，易於工業化生產。
收集的魨毒素分部經減壓蒸發至幹，然後重溶於少量0.1N乙酸中。如有沉澱，離心除去。然後上Bio-Gel P-2(Bio-Rad Laboratories)凝膠過濾柱(100×2cm)。凝膠以0.1N乙酸漲發並平衡。上樣1.5mL(含魨毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脫，洗脫速度為0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脫液，此分部為魨毒素峰。減壓蒸發至幹，重溶於少量0.1N鹽酸中。再減壓蒸發至幹，即得到與西格瑪化學品公司(SIGMA Chemical Co.)的色譜純魨毒素一樣的產品。
收集的魨毒素分部經減壓蒸發至幹，然後重溶於少量0.1N乙酸中。如有沉澱，離心除去。然後上Bio-Gel P-2(Bio-Rad Laboratories)凝膠過濾柱(100×2cm)，以0.1N乙酸漲發並平衡。上樣1.5mL(含魨毒素1.7mg)。以0.1N乙酸洗脫，洗脫速度為0.32mL min-1。收集361mL至408mL洗脫液，此分部為魨毒素峰。減壓蒸發至幹，重溶於少量0.1N鹽酸中。再減壓蒸發至幹，即得到與西格瑪化學品公司(SIGMA Chemical Co.)的色譜純魨毒素一樣的產品。
權利要求
1.一種純化魨毒素的方法，其步驟是A、離子交換層析，使用弱酸性陽離子交換樹脂柱，轉換成銨型或氫型，將pH調整為4.0-6.5，將澄清的魨毒素粗提液上柱，先以純水或緩衝液或低於0.4N濃度的乙酸溶液洗柱，再以0.1-2N濃度的乙酸一步或分步洗脫，或使用0.01-2.5N乙酸梯度洗脫，收集含魨毒素的洗脫液，減壓蒸發至幹，然後溶於0.01-0.15N乙酸中；B、凝膠過濾層析，選用排阻分子量在1500-4000Da，充填大柱的凝膠裝柱，將第一步所得魨毒素的乙酸溶液上柱，用0.01-0.15N乙酸洗脫，收集含魨毒素的洗脫液，得純魨毒素的乙酸鹽溶液，減壓蒸發至幹，得純魨毒素的乙酸鹽固體。
2.如權利要求1所述的一種純化魨毒素的方法，其特徵在於將第二步驟所得純魨毒素溶於苦味酸中，成為苦味酸鹽，冷卻後形成苦味酸鹽的沉澱，分離收集沉澱，然後在熱水中溶解後加NH4OH使pH上升至9，讓純毒素沉澱下來，過濾收集沉澱，再溶於乙酸溶液中，獲得純粹的毒素乙酸鹽溶液。
全文摘要
本發明公開了一種純化魨毒素的方法。首先是離子交換層析,使用弱酸性陽離子交換樹脂柱,轉換成銨型或氫型,將經過澄清的魨毒素粗提液上柱,以0.1－2N濃度的乙酸一步或分步洗脫,或使用乙酸梯度洗脫,收集含魨毒素的洗脫液,減壓蒸發至幹,然後重溶於乙酸中;其次是凝膠過濾層析,將第一步所得液上柱,用乙酸洗脫,收集含魨毒素的洗脫液,減壓蒸發至幹,得純魨毒素的乙酸鹽固體。將上述固體溶於所需鹽的相應酸中,蒸乾後得所需鹽。溶於苦味酸中,製成苦味酸鹽,水溶後用NH
文檔編號C07D491/00GK1385432SQ0111420
公開日2002年12月18日 申請日期2001年5月15日 優先權日2001年5月15日
發明者金傳蔭, 劉永定, 宋立榮, 朱家明 申請人:中國科學院水生生物研究所