一種水稻庫源新基因(ss1)的緊密連鎖分子標記的製作方法

2023-10-19 21:59:12 2

專利名稱：一種水稻庫源新基因(ss1)的緊密連鎖分子標記的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種控制水稻庫源新基因SSl的緊密連鎖分子標記，屬於水稻超高產育種和分子遺傳學領域，適用於在水稻高產育種中引入新的產量相關基因SS1，並利用緊密連鎖分子標記對該基因進行水稻庫源相關性狀的輔助選擇育種。
背景技術：
水稻產量的高低主要取決於源、庫、流三者的強弱及其相互間的協調程度，其中穗部性狀特別是每穗總粒數是光合產物積累的主要庫性狀，倒三葉尤其是劍葉大小是光合產物生產的主要源性狀，穗莖中的大維管束數量通常被作為從葉片向穗部輸送同化物的一個 「流」性狀。劍葉是穗部最重要的同化產物來源，其大小與每穗粒數、小穗育性、高容重籽粒、 千粒重及籽粒產量密切相關。在不同條件下，源、庫、流三者之一都有可能成為作物產量的限制因素，因而單方面強調源或庫對產量的重要性都是不全面的。要獲得高產，不僅源、庫要協調，還要考慮到流(運轉)的協調，即源要足、庫要大和運轉通暢。由此可見，源、庫、流三者之間是相互促進、相互影響、相互制約的關係。目前一般採用源/庫、源/流和流/庫 「三比」來評價源、庫、流三者間的平衡關係，進而分析「三比」變化對水稻產量及生理的影響，從而找出水稻高產所需的最佳「三比」值。儘管人們已經認識到充足而且彼此協調的庫源關係是水稻高產理想株型和超高產育種的重要目標，但至今對庫源性狀的遺傳特別是兩者間的分子調控機制還缺少研究。因此，鑑定影響庫源性狀的重要基因，通過分子標記輔助選擇培育庫源協調的高產品種進而解析庫源性狀調控的分子機制，意義重大。數量性狀基因座(QTL)定位的應用極大的促進了對包括產量在內的許多重要複雜性狀遺傳機理的認識。鑑定影響庫、源和流及產量性狀的QTL有助於增加對這些複雜性狀相互關係的理解，從而達到通過遺傳操縱改良這些性狀並最終提高產量的目的。Cui等 (2003)利用珍汕97與明恢63的重組自交系群體，定位了劍葉、倒二葉和倒三葉(源性狀)、 每穗總粒數(庫性狀)、莖中大維管束數量(流性狀)及三者衍生的比例性狀與籽粒產量及產量相關性狀(結實率和千粒重)的QTL，在定位影響庫-源-流的25個主效QTL中，其中有8個與影響產量性狀的QTL定位在相同或相近的區域，認為一因多效或緊密連鎖是籽粒產量與庫、源、流之間相關的遺傳基礎。Li等(1998)在美國德州生態條件下種植Lemont/特青的早世代(F4)重組自交系群體，研究了水稻劍葉和倒二葉與庫容量之間的遺傳關係，發現作為主要庫容量的每穗粒重有50%的變異是由劍葉大小引起，並利用分子標記鑑定出位於第4染色體RG143-RG214區間同時影響庫性狀(每穗粒數和每穗粒重)和源(劍葉和倒二葉的葉面積和葉寬)性狀的1個主效QTL(QLw4)，分別解釋劍葉葉寬、倒二葉葉寬和每穗粒數表型變異的20%、19%和16%，是一個影響庫源性狀的重要主效QTL。該基因座上來自 Lemont的等位基因能夠在增加葉寬和葉面積的同時增加每穗粒數和穗粒重，一因多效是該基因控制庫源性狀的遺傳基礎。Xu等Q004)在菲律賓熱帶條件下種植Lemont/特青的高世代(F13)重組自交系群體，在第4染色體的RM317-RM255區間檢測到影響每穗粒數的主效 QTL，其增加每穗粒數的等位基因也同樣來自Lemont。經比較作圖分析發現，與該QTL緊密連鎖的分子標記RM255正好落在RG143-RG214區間。因此，推斷該QTL與Li等(1998)定位到影響庫源性狀的QLw4很可能是同一個位點。在此基礎上，申請人又進一步利用Lemont/ 特青的雙向回交導入系群體，分別在北京和海南的種植條件下檢測到影響每穗粒數和劍葉寬度的主效QTL(所在區間為RM317-RM255)，該位點上增加葉寬和每穗粒數的等位基因都來自親本Lemont。由此證明RM317-RM255區間確實存在一個在不同的生態條件下穩定表達的影響庫源性狀的基因，暫且將該基因命名為SSl (Source-sink 1)。水稻庫源性狀是水稻產量形成的農學基礎。庫源相關性狀(如劍葉長、寬及葉面積，每穗粒數及粒重)的QTL定位研究表明，影響水稻庫源相關性狀的QTL(基因位點)大致分成3種類型，一是同時控制葉片源性狀和穗部庫性狀，二是只控制葉片源性狀，三是只控制穗部庫性狀。在這3種類型中，只有第一種基因，對水稻庫源協調起關鍵作用，是通過庫源協調培育超高產品種的重要遺傳基礎。雖然通過常規的表型鑑定，可以對葉片寬窄和葉片大小等源性狀進行選擇，但是卻無法對不同類型的庫源相關基因位點加以區別利用；只有通過分子標記的方法，對於同時控制庫性狀和源性狀的基因位點進行有針對性的選擇， 才能實現庫源協調超高產品種的高效選育。因此，鑑定和精細定位水稻庫源性狀的重要基因，尋找與其緊密連鎖的分子標記，對於通過標記輔助選擇技術培育水稻超高產新品種具有重要的現實意義。

發明內容
(一)技術問題本發明針對上述研究背景，從特青背景的高代回交導入系中選擇出帶有影響源 (劍葉葉寬)、庫(每穗粒數)性狀SSl基因的回交導入系GG253，其輪迴親本背景恢復率為98. 9%，進一步以特青作為輪迴親本與GG253進行2次回交，通過分子標記輔助選擇的方法篩選到目標區段為SSl基因雜合導入、背景完全恢復為輪迴親本特青的近等基因系， 利用該近等基因系所構建的F2次級分離群體為試材，篩選目標染色體區段的交換單株，從而構建了一套亞區間的跨疊系，並結合表現型對目標基因進行高精確度的連鎖分析，將SSl 基因精細定位到一個^lA的區間內；獲得與之緊密連鎖的基於PCR的分子標記FL41，藉助該標記可以有效篩選到帶有SSl基因的寬劍葉且每穗粒數多的庫源充足且協調的水稻新品種(系)，主要應用於培育水稻超產新品種。( 二 )技術方案控制水稻庫源新基因緊密連鎖的分子標記方法，其特徵在於用一對特異擴增水稻位於第4染色體上控制水稻庫源新基因(SSl)的緊密連鎖分子標記的引物FL41，其中正向引物序列為AAACCCTGGCATTACATT ；反向引物序列為 CATAGACATAAGAACCCT，共同擴增目標區段為雜合導入的近等基因系(攜帶有一個包含SSl 的551Λ雜合片段)自交所衍生的F2分離群體中各單株的基因組DNA，然後用Ddel限制性內切酶37°C酶切2小時，電泳分離出2種分子量大小的片段，其中與Lemont親本相同片段的分子量大小為171bp，與特青相同片段的分子量大小為IMbp (

圖1)。如果FL41的引物擴增後酶切獲得與親本Lemont大小相同或者雜合片段的單株，那麼這些單株帶有SSl高產等位基因，表現型表現為劍葉增寬且穗粒數增多，反之，則不帶有SSl高產等位基因，表現劍葉較窄且穗粒數較少。
具體實施例方式下面結合具體實施實例，進一步闡述本發明。其中所用方法如無特別說明均為常規方法。(一 )控制水稻庫源新基因的初步定位1.供試材料以美國南部的優質粳稻品種Lemont和我國廣東的高產秈稻品種特青所構建的雙向回交導入係為主要研究材料。其構建過程如下將Lemont與特青配製雜種FnF1植株分別與雙親回交，分別形成Lemont和特青背景的雙向回交BC1F1群體，在雙向回交後代隨機選單株分別與各自的輪迴親本進行2-4次不等的連續回交並經自交多代穩定，最後分別獲得了 201個Lemont背景導入系(LT-ILs)和252個特青背景的導入系(TQ-ILs)。另一套材料是來自同一個雜交組合(Lemont/特青)的294個高世代重組自交系(RILs)。2. DNA提取、PCR擴增及凝膠電泳參考TemnyW1等(2000年)的DNA提取方法，對各株系的代表單株分別混合提取基因組DNA。根據參考圖譜，選取均勻分布於全基因組的142個SSR標記，合成引物。以各個株系的基因組DNA為模板進行，聚合酶鏈式(PCR)反應。PCR反應的產物通過8%非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，genefinder染色後，在凝膠成像系統下成像。參考雙親的擴增條帶，對後代株系的帶型進行判別記錄。3.完備區間作圖分析根據後代株系的擴增條帶所表示的基因型，將其對應的庫(每穗粒數)和源(劍葉寬度)相關性狀調查的結果作為表型值，輸入由中國農業科學院作物科學研究所王建康課題組所發展的完備區間作圖軟體(ICIMapping V3. 0，免費軟體)，進行數據分析，獲得與水稻庫源相關的候選區間及相關標記。我們鑑定出1個在不同遺傳背景下(特青背景導入系、Lemont背景導入系和重組自交系)不同環境下(北京和海南)均能穩定表達的同時影響庫源性狀的主效QTL(表1)， 即位於第4染色RM255標記附近同時影響每穗粒數(庫性狀)和劍葉葉寬(源性狀)的主效QTL(SSl)，該基因座上來自Lemont的等位基因增加劍葉葉寬的同時增加每穗粒數，一因多效是控制該庫源性狀的遺傳基礎。表1利用四2個Lemont/特青重組自交系(RILs)、2M個特青背景導入系(TQ-ILs) 和201個Lemont背景導入系(LT-ILs)定位影響劍葉葉寬(FLW，釐米)和每穗粒數(SNP， 粒/穗)的主效QTL
權利要求
1.水稻庫源新基因(SSl)緊密連鎖分子標記方法，其特徵在於以雜合近等基因系構建的F2次級分離群體為試材，篩選目標染色體區段的交換單株，從而構建了一套覆蓋目標區段的跨疊系，結合表現型對目標基因進行高精確度的連鎖分析，最終將SSl基因精細定位到55Kb的區間內，獲得與庫源新基因(SSl)緊密連鎖的CAPS分子標記FL41。
2.按照權利1所獲得一種與水稻庫源新基因(SSl)緊密連鎖分子標記的應用，其特徵在於以寬葉品種Lemont導入窄葉品種特青培育的雜合近等基因系的後代分離群體為對象，通過FL41標記的帶型數據，預測其由SSl等位基因所控制的水稻庫(每穗粒數)源(劍葉葉寬)相關性狀。
全文摘要
本發明涉及一種水稻庫源新基因SS1的分子標記方法，屬於水稻超高產育種和分子遺傳學領域。本發明實質是根據連鎖分離規律，利用攜帶SS1雜合片段的近等基因系自交所構建的F2次級分離群體為試材，構建一套目標區段的跨疊系，結合表現型對目標基因進行高精確度的連鎖分析，經過兩年兩點的重複鑑定，最終將SS1精細定位到第4染色體上55Kb的區間內，並獲得了與之緊密連鎖的基於PCR的分子標記FL41。將本發明應用於水稻超高產育種，能夠快速準確的鑑定出同時影響庫(每穗粒數)源(劍葉葉寬和葉面積)性狀的基因型個體，進行育種材料的早世代選擇，大大加速水稻超高產分子育種的進程。
文檔編號C12N15/10GK102304513SQ20111025364
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者孫勇, 徐建龍, 王韻, 趙秀琴, 鄭天清, 黎志康 申請人:中國農業科學院作物科學研究所