抗豬生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗製劑的製作方法

2023-09-22 04:26:05

專利名稱：抗豬生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗製劑的製作方法
抗豬生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗製劑本申請是申請號為97196558. 7、申請日1997年7月15日、發明 名稱為"抗豬生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗製劑"的申請的分案申請。本發明涉及可特別地接種豬以抗生殖和呼吸疾病的疫苗製劑，還涉 及相應的接種方法。在過去幾十年裡，生產豬的方法發生了根本性的變化。在被包圍的 空間內集中繁殖已被推廣，但其必然後果是呼吸疾病也隨之迅速發展。豬呼吸病理學的症狀範圍一般被歸納為複雜的豬呼吸疾病名稱，並 涉及多種致病因子，其中包括病毒以及細菌和支原體。參與呼吸疾病的主要因子是大葉性肺炎放線桿菌 (Actino-baci 1 lus pleuropneumoniae)， 不育和呼吸症候群病毒 (PRRS)，也被稱為神秘病病毒，Aujeszkey病病毒(PRV)和豬流感病毒。其它病毒導致生殖疾病，所述疾病導致流產，胎兒乾癟和不育。主 要病毒是PRRS，細小病毒和典型豬瘋病毒(HCV)。其次，豬流感病毒PRV 和大葉性肺炎放線桿菌也可導致這種疾病。大葉性肺炎放線桿菌、HCV 和PRV可導致死亡。另外，微生物之間的相互關係在豬呼吸症候群中非常重要。實際上， 大多數細菌病原體是鼻咽區和幼小動物扁桃體的習慣性宿主。來自大母 豬的這些病原體經常被出生僅幾個小時、初乳免疫力尚未起效之前的小 豬吸入。當宿主的呼吸防禦機制被諸如大葉性肺炎放線桿菌的前體因子 或病毒損壞時，在上呼吸道中生存的生物體可入侵下呼吸道。對肺的入 侵非常快，尤其是在諸如大葉性肺炎放線桿菌的前體病原體的情況下更 是如此，所述病原體可產生強有力的細胞毒素，該毒素能損害呼吸道上 皮細胞的纖毛和肺泡巨噬細胞。除了具有呼吸道趨向性的細菌和支原體外，主要的病毒感染，如流 感病毒，呼吸道冠狀病毒和Aujeszkey病病毒的感染對呼吸道症候群的 致病性可能也起到了 一定的作用。最後， 一些因子既有呼吸效應也有生殖效應。從生殖病理學的角度
看，也會出現相互作用.因此，似乎需要試著開展針對豬生殖和呼吸疾病的主要致病因子的 有效防治作用.迄今為止發展起來的方法是用滅活疫苗或活疫苗，及可能為這種疫 苗的混合物。它們的發展提出了效價和穩定性之間相容性的問題。實際 上不論是從所用的不同抗原的角度，還是從製劑本身的角度，尤其是在 聯合使用滅活疫苗和活疫苗的情況下，都必需確保不同疫苗效價之間的相容性。另外還存在的問題是這種聯合疫苗的保存及其安全性，尤其 是存在佐劑時的安全性。這些疫苗一般十分昂貴。專利申請WO-A誦卯11092 ， WO-A-92 19183 ， WO-A-94 21797 和WO-A-95 20660利用了最近興起的多核苷酸疫苗技術。已知這些疫 苗使用了質粒，所述質粒能在宿主細胞中表達插入其中的抗原。已提出 所有的施用途徑(腹膜內，靜脈內，肌內，經皮，皮內，軲膜等等)。也 可以使用不同的接種方式，如將DNA沉積在金粒表面並投射之以穿入 動物皮膚(Tang等，自然(Nature), 356, 152-154， 1992)，可以 同時轉染皮膚，肌肉，脂肪組織和乳房組織的液體噴射注射器(Furth 等，分析生物化學(Analytical Biochemistry ) ， 205， 365-368, 1992)。多核苷酸疫苗也可以使用棵DNA和經配製的DNA，如陽離子脂 質脂質體內的DNA。M-F Le Potier等人(第二屆消滅Aujeszkey病(假狂犬病)病毒國際研討 會論文集，1995年8月6日至8日，哥本哈根，丹麥)和M. Monteil 等人(Les Journees (T Animation Scientifique du Departement de Pathologie Animale[動物病理學部門組織的科學會議，INRA-ENV, Ecole Nationale Veterinaire de LYON (裡昂國家畜醫學校)，13-14 , 1994年12月13 - 14日)藉助於可在強啟動子，即2型腺病毒主要晚期 啟動子的控制下表達gD基因的質粒，試著接種了豬以抗Aujeszkey病 病毒。儘管抗體反應水平良好，但未顯示保護作用.不過，用其中插入 了 gD基因和相同啟動子的重組腺病毒接種豬之後，記錄了有關保護作
用的令人滿意的結果，證明gD糖蛋白應足以在豬中誘導保護作用。現有技術中通過多核苷酸接種方法在豬中未獲得保護性結果.因此，本發明打算提供多價的疫苗製劑，所迷製劑可以確保接種豬 能抵抗特別是涉及呼吸疾病和/或生殖疾病的多種致病因子，本發明的另 一 目的是提供包含有不同效價並滿足彼此相容性和效 價穩定性所需的所有標準的疫苗製劑。本發明的另一目的是提供可以在相同栽體中含有不同效價的疫苗 製劑。本發明的另一目的是提供使用簡單且便宜的疫苗製劑。本發明的另一目的是提供這樣一種疫苗製劑和接種豬的方法，所述 疫苗和接種可以得到高效、長期以及安全性良好又不留後患的保護作 用，包括多價保護作用。因此，本發明的目的是特別地針對豬生殖和/或呼吸疾病的疫苗制 劑，所述製劑含有至少3種效價的多核苷酸疫苗，每種含有一個整合質 粒，其可在宿主細胞中體內表達一種豬病原體效價的基因，這些效價逸 自Aujeszkey病病毒(PRV或假狂犬病病毒)，豬流感病毒(SIV)，豬神 秘病病毒(PRRS病毒)，細小病毒病病毒(PPV病毒)，典型豬痘病毒 (HCV病毒)和引起放線桿菌病的細菌(大葉性肺炎放線桿菌)，對於每種 效價而言，質粒含有一種或多種基因，該基因對於Aujeszkey病病毒選 自gB和gD，對於豬流感病毒選自HA、 NP和N，對於PRRS病毒 選自ORF5(E), ORF3, ORF6(M)，對於細小病毒病病毒選自VP2 , 對於典型豬痘病毒選自El、 E2,對於大葉性肺炎放線桿菌選自apxl、 apxll和apxIII 。本發明中的效價應理解成至少一種可提供抗所研究病原體病毒的 保護作用的抗原，效價可含有得自 一抹或多抹所研究病原體的一個或多 個經修飾的天然基因作為亞效價。病原性因子的基因應理解成不僅指完整的基因，也指不同的多種核 苷酸序列，包括保持了誘導保護性反應之能力的片段。基因的概念覆蓋 了等價於實施例中詳細描述的序列的核苷酸序列，也就是說，有所不同
但編碼相同蛋白質的序列.此概念也覆蓋了被研究的其它抹病原體的核 苷酸序列，它可以提供交叉保護作用或特異於抹或抹群的保護作用.此 概念也覆蓋了已被修飾以便於由宿主動物在體內表達，但編碼相同蛋白 質的核苷酸序列.優選本發明的疫苗製劑含有Aujeszkey和豬流感效價，在其中可加 入優選選自PRRS和大葉性肺炎放線桿菌(放線桿菌病)效價的其它效 價，任選在其中進入選自細小病毒病和典型豬瘟效價的其它效價，當然，效價的所有聯合都是可以的，然而，在本發明的範圍內， Aujeszkey和豬流感，接下來是PRRS和大葉性肺炎放線桿菌的效價被 認為是優選的。從更特異地針對豬呼吸疾病的接種角度看，優選效價選自 Aujeszkey 、豬流感、PRRS和放線桿菌病。從特異地針對豬生殖疾病的接種角度看，優選效價選自PRRS、細 小病毒病、典型豬瘟和Aujeszkey病。至於Aujeszkey效價，可使用gB或gD基因，優選使用這兩種基 因，此時所述基因位於不同質粒或一個相同質粒上。至於豬流感效價，優選使用HA和NP基因，可以使用這兩個基因 中的一個，也可以同時使用這兩個基因，此時所述基因位於不同質粒或 一個相同質粒上。優選在同一疫苗中聯合得自一種以上流感病毒抹，尤 其是得自在自然界發現的不同抹的HA序列。另一方面，NP提供了交 叉保護作用，因此得自單個病毒抹的序列能令人滿意。至於PRSS效價，優選使用E和ORF3或M基因，可以單獨或聯 合使用這些基因；聯合使用時，基因可位於分離的質粒上，或位於聯合 有2或3個這種基因的質粒中。得自至少兩抹，尤其是得自歐洲抹和美 洲抹的基因利於在同一疫苗中聯合。至於典型豬瘟效價，可使用E1和E2基因中的任一種或E1和E2 基因，後情形下它們可在兩個不同質粒或任選在一個相同質粒中聯合。至於放線桿菌病效價，可使用上述3種基因中的一個或位於不同質 粒或混合質粒上的這些基因中2個或3個基因的聯合以提供針對不同血
清型大葉性肺炎放線桿菌的保護作用.對於apxl， II和III而言，可 以設想修飾編碼序列以得到解毒的抗原，具體方法見實施例.
特別對於經肌內途徑接種而言，本發明疫苗製劑一般以0.1-lOml, 特別是l-5ml的劑量體積形式提供.
劑量一般為每種質粒類型10ng-lmg，優選為100ng-5(Hig ，優選 為lpg-!250ng 。
優選使用筒單地置於接種載體， 一般為生理鹽水(0.9 % NaCl),超 純水，TE緩衝液等中的棵質粒。當然也可以使用現有技術中已描述的 任何多核苷酸疫苗形式。
每個質粒都含有啟動子，在其控制下可確保插入基因在宿主細胞中 的表達。所述啟動子一般是強的真核生物啟動子，尤其是來源於人或 鼠，或任選來源於其它動物如大鼠、豬和豚鼠的巨細胞病毒早期 CMV-IE啟動子。啟動子更一般地講是來源於病毒或細胞。至於病毒啟動子，可提到 SV40病毒早期或晚期啟動子或Rous肉瘤病毒LTR啟動子。也可以是 基因來源病毒的啟動子，例如基因自身的啟動子。
至於細胞啟動子，可提到細胞骨架基因的啟動子，例如結蛋白啟動 子(Bolmont等，亞顯微鏡細胞學和病理學(Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology ) ， 1990， 22, 117-122;和Zhenlin等， 基因(Gene ) ， 1989， 78, 243-254)或者肌動蛋白啟動子。
當相同質粒中存在幾個基因時，它們會存在於相同的轉錄單位或兩 個不同的單位中。
優選通過混合表達各種效價之抗原的多核苷酸質粒來達到本發明 不同疫苗效價的聯合，但也可以設想使幾種效價的抗原由相同質粒表 達。
本發明的目的還在於單價疫苗製劑，所述製劑含有一個或多個編碼 得自選自PRV， PRRS, PPV， HCV的病毒之一和大葉性肺炎放線 桿菌的一個或多個基因的質粒，所述基因為上述的那些。除了它們的單 價特徵外，這些製劑可具有上述有關基因選擇，基因聯合，質粒組成，
劑量體積，劑量等方面的特徵.單價疫苗製劑也可用於(i)製備上迷的多價疫苗製劑，(ii)各對抗自 己的疾病，(iii)與針對另一種疾病的另一類型(活的或滅活的完整的，重 組的，亞單位)的疫苗聯合，或(iv)按下述作為疫苗的加強劑.實際上本發明另 一個目的是使用一種或多種本發明的質粒以製備 用於接種豬的疫苗，該豬首先已用第一種已知類型的常規疫苗接種，所 述第一種疫苗特別選自活的完整疫苗，滅活的完整疫苗，亞單位疫苗和 重組疫苗，所述第一種疫苗(單價或多價)具有(也就是說含有或能表達) 由所迷質粒編碼的抗原或提供交叉保護作用的抗原。值得注意的是，該 多核苷酸疫苗具有強有力的加強效果，可導致免疫應答的增強並可獲得 長期的免疫力。一般講，第一接種疫苗可選自可從不同的獸用疫苗生產商處購得的 疫苗.本發明的另一目的是接種試劑盒，所述試劑盒將上述第一接種疫苗 和用於加強免疫的本發明的疫苗製劑組配在一起。本發明還涉及附帶有 說明書的本發明疫苗製劑，所述說明書指明該製劑可作為上述第 一 次接 種的加強劑來使用。本發明的另 一 目的是接種豬以抵抗豬生殖疾病和/或呼吸疾病的方 法，所述方法包括施用有效量的上述疫苗製劑。此接種方法包括施用一 劑或更多劑疫苗製劑，這些劑量可以在短時間內連續施用和/或以較長 的間隔期連續施用。在這種接種方法中，通過現有技術中建議的用於多核苷酸接種的不 同施用途徑並利用已知的施用技術施用本發明的疫苗製劑。特別可藉助 於液體注射器經液體噴射優選多個液體噴射經由皮內途徑進行接種，尤 其是使用具有幾個孔或噴嘴，特別是具有5或6個孔或噴嘴的注射頭的 注射器，如法國裡昂Endoscoptic公司製造並銷售的Pigjet裝置。對於這種裝置而言，優選劑量體積降低為0.1-0.9ml，特別是0.2-0.6ml ，更優選為0.4-0.5ml,可以1次或幾次，優選為2次施用該劑 量體積。
本發明的另一目的是一種接種方法，所述方法包括按上述進行第一 次接種，並用本發明的疫苗製劑加強接種.在本發明方法的優選實施方 案中，首先給動物施用有效劑量的常規疫苗，尤其是滅活的、活的、減 毒的或重組的、或亞單位的疫苗以提供第一次接種， 一段時間後，優選為2至6周後，施用本發明的多價或單價疫苗。本發明也涉及一種製備疫苗製劑的方法，即製備不同效價及其混合 物的方法，如從此說明書中看到的方法。下面參照附圖，藉助於本發明的實施方案更詳細地描述本發明。


圖l:質粒pVR1012圖2:PRV gB基因的序列(NIA3抹)圖3:質粒pAB090的構建圖4:PRV gD基因的序列(NIA3抹)圖5:質粒pPB098的構建圖6:豬流感HA基因的序列(H1N1抹)圖7:質粒pPB143的構建圖8:豬流感NP基因的序列(H1N1抹)圖9:質粒pPB42的構建圖10:豬流感HA基因的序列(H3N2抹)圖11:質粒pPB144的構建圖12:豬流感NP基因的序列(H3N2抹)圖13:質粒pPB132的構建圖14:質粒pAB025圖15:質粒pABOOl圖16:質粒pAB091圖17:質粒pAB092圖18:質粒pAB004圖19:質粒pAB069
圖20:質粒pAB061圖21:質粒pPB162圖22:質粒pPB163圖23:質粒pPB174，圖24:質粒pPB189圖25'質粒pPB190序列表SEQ ID NO:SEQ ID NO:l : PRV gB基因的序列(NIA3株) SEQIDNO:2:寡核苷酸AB166 SEQIDNO:3:寡核苷酸AB167 SEQIDNO:4:寡核苷酸AB168 SEQIDNO:5:寡核苷酸AB169 SEQ ID NO:6 : PRV gD基因的序列(NIA3抹) SEQIDNO:7:寡核苷酸PB101 SEQIDNO:8:寡核苷酸PB102 SEQIDNO:9:寡核苷酸PB107 SEQIDNO:10:寡核苷酸PB108 SEQIDNO:ll:豬流感HA基因的序列(H1N1抹) SEQIDNO:12:寡核苷酸PB097 SEQIDNO:13:寡核苷酸PB098 SEQIDNO:14:豬流感NP基因的序列(H1N1抹) SEQIDNO:15:寡核普酸PB095 SEQIDNO:16:寡核苷酸PB096 SEQ ID NO:17 :豬流感HA基因的序列(H3N2抹) SEQIDNO:18:豬流感NP基因的序列(H3N2抹) SEQIDNO:19:寡核苷酸AB055 SEQIDNO:20:寡核苷酸AB056 SEQIDNO:21:寡核苷酸AB001SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SE(J ID NO:24 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 SE(J ID NO:47 SEQ ID NO:48實施例寡核苷酸AB002 寡核苷酸AB170 寡核苷酸AB171 寡核苷酸AB172 寡核苷酸AB173 寡核苷酸AB007 寡核苷酸ABOIO 寡核苷酸AB126 寡核苷酸AB127 寡核普酸AB118 寡核苷酸AB119 寡核苷酸PB174 寡核普酸PB189 寡核苷酸PB1卯 寡核苷酸PB175 寡核苷酸PB176 寡核苷酸PB191 寡核苷酸PB192 寡核苷酸PB177 寡核苷酸PB278 寡核苷酸PB279 寡核香酸PB280 寡核苷酸PB307 寡核苷酸PB303 寡核苷酸PB306 寡核苷酸PB304 寡核苷酸PB305
實施例1:病毒的培養在適當的細胞系統中培養病毒直至得到細胞病變效應.本領域技術 人員熟知每種病毒所用的細胞系統。筒單地說，用感染複數為l的被研 究的病毒抹接種對所用病毒敏感的細胞，所述細胞在Eagle最低基本培 養基(MEM培養基)或另一種適當的培養基中培養。然後於37 r保溫被 感染的細胞直至出現完全的細胞病變效應(平均為36小時)。實施例2:細菌的培養和細菌DNA的提取按A. Rycroft等人(普通微生物學雜誌(J.Gen.Microbiol.)， 1991, 137， 561-568)所述培養大葉性肺炎放線桿菌菌抹。根據J. Sambrook等人(分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室，冷泉 港，紐約，1989)所述的標準技術製備高分子量的DNA(染色體DNA)。實施例3:提取病毒基因組DNA培養後，收穫上清液和被裂解的細胞，於4 X:, 1000g將全部的病 毒懸浮液離心IO分鐘以除去細胞碎片，然後通過於4t:， 400，000g超 速離心1小時以收穫病毒顆粒。將沉澱物溶解於最少量的緩衝液(10mM Tris， lmMEDTA; pH8.0)中，於37"C，在十二烷基硫酸鈉(SDS) 的存在下(終濃度為0.5 %)，用蛋白酶K(終濃度為100ng/ml)將上述濃 縮的病毒懸浮液處理2小時。然後用笨酚/氯仿混合物提取病毒DNA， 再用2倍體積的無水乙醇沉澱之。於-20 "C放置過夜後，於4 t: ， 10，000g 將DNA離心15分鐘，乾燥DNA沉澱物，然後將它溶於最少量的無菌 超純水中，接著可以用限制性酶消化所述DNA。實施例4:分離病毒基因組RNA根據本領域技術人員熟知的技術純化RNA病毒，然後使用P. Chromczynski和N. Sacchi所述的"硫氰酸胍/笨酚-氯仿"提取技術(分 析生物化學，1987， 162, 156-159)分離各個病毒的基因組病毒 RNA。
實施例5:分子生物學技術使用J.Sambrook等人(分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港 實驗室，冷泉港，紐約，1989)所述的標準分子生物學技術進行所有的 質粒構建。使用"Geneclean"試劑盒(BIO 101 Inc. La Jolla , CA)分離用於本發明的所有限制性片段。實施例6: RT國PCR技術合成多個特異性的寡核苷酸(在其5，末端含有限制性位點以便於克 隆經擴增的片段)以使其完全覆蓋欲被擴增的基因的編碼區(見具體的 實施例)。根據標準技術(J. Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊， 第2版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)進行逆轉錄(RT)反應和 聚合酶鏈反應(PCR).用 一對特異性的擴增引物進行一種RT-PCR反 應，所迷反應的模板是提取出的病毒基因組RNA。用笨酚/氯仿/異戊 醇(25:24:1)提取經擴增的互補DNA ，然後用限制性酶消化。實施例7 :質粒pVR1012質粒pVR1012(圖l)得自Vical Inc.， San Diego， CA， USA .其構建 描述於J. Hartikka等人(人類基因療法(Human Gene Therapy )， 1996 ， 7, 1205-1217)'實施例8 :構建質粒pABO卯(PRV gB基因)用Apal和Nael消化質粒pPR2.15(M. Riviere等，病毒學雜誌 (J.Virol ) ， 1992， 66， 3424-3434)，以釋放出含有編碼Aujeszky 病病毒(NIA3抹)gB糖蛋白之基因(圖2和SEQ ID NO:l)的2665 bp的 ApaI-NaeI片段(片段A)。通過下列2個寡核苷酸的雜交 AB166(33聚體)(SEQ ID NO:2)formula see original document page 13AB167(33聚體)(SEQ ID NO:3)5， ACGTCTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC 3'重新構建含有gD基因序列，始於起始的ATG密碼子直至Apal位點的33bp的片段(片段B),該片段在5，端產生了 Pstl位點。通過下列2個寡核苷酸的雜交 AB168(45聚體)(SEQ ID NO:4) 5，GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTG TAGG 3，AB169(49聚體)(SEQ ID NO:5) 5，GATCCCTACAGGGCGTCGGGGTCCTCGCTCTCGAGGCGCTG GTAGTGCC 3'重新構建含有gD基因序列，始於Nael位點直至TAG終止密碼子的45 bp的片段(片段C)，該片段在3，端產生了 BamHI位點。將片斷A ， B和C 一起連接到預先經Pstl和BamHI消化的載體 pVR1012(實施例7)中，得到質粒pAB090(7603 bp)(圖3)。實施例9 :構建質粒pPB098(PRV gD基因)用Sail和BglII消化質粒pPR29(M. Riviere等，病毒學雜誌， 1992, 66， 3424-3434)，以釋放出含有編碼Aujeszky病病毒(NIA3 抹)gD糖蛋白之基因的3，部分(圖4和SEQ ID NO:6)的711 bp的Sall-BglII片段(片段A)。用Eco47IH和Sail消化質粒pPR29以釋放出含有編碼Aujeszky 病病毒(NIA3抹)gD糖蛋白之基因的5，部分的498 bp的Eco47III-SalI 片段(片段B)。通過下列2個寡核苷酸的雜交 PB101(15聚體)(SEQ ID NO:7) 5' GATGCTGCTCGCAGC 3'PB102(19聚體)(SEQ ID NO:8)5， GCTGCGAGCAGCATCTGCA 3'重新構建含有gD基因5，序列，始於起始的ATG密碼子直至Eco47IH 位點的15bp的片段(片段C),該片段在5，端產生了 Pstl位點。純化之後，將片段A， B和C一起連接到預先經PstI和BglII消 化的載體pVR1012(實施例7)中，得到質粒pPB098(6076 bp)(圖5)。實施例10:構建質粒pPB143(豬流感HA基因，H1N1抹)用根據實施例4所述技術製備的豬流感病毒(SIVH1N1 " SW"抹) 基因組RNA，和下列寡核苷酸 PB107(32聚體)(SEQ ID NO:9)5， GTTCTGCAGCACCCGGGAGCAAAAGCAGGGGA 3' PB108(33聚體)(SEQ ID NO:IO)5， ATTGCGGCCGCTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTT 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從SIVH1N1中精確地分 離1803 bpPCR片段形式的編碼HA蛋白的基因(圖6和SEQ ID NO:ll)。純化之後，將此片段與載體PCRII-direct(Invitrogen Reference K2000-01)連接，得到載體pPB137(5755bp)。用EcoRV和Notl消化 載體pPB137以釋放1820 bp的含有HA基因的EcoRV-NotI片段。將 此片段與預先經EcoRV和Notl消化的栽體pVR1012(實施例7)連接， 得到質粒pPB143(6726 bp)(圖7)。實施例ll:構建質粒pPB142(豬流感NP基因，H1N1抹)用根據實施例4所迷技術製備的豬流感病毒(SIVH1N1 " SW "抹) 基因組RNA，和下列寡核苷酸 PB097(36聚體)(SEQ ID NO: 12)5， CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC 3' PB098(33聚體)(SEQ ID NO: 13)5' TTGCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從SIVH1N1中精確地分 離SalI-NotI片段形式的編碼NP蛋白的基因(圖8和SEQ ID NO:14). 純化之後，將1566 bp的RT-PCR產物與載體PCRII-direct(Invitrogen Reference K2000-01)連接，得到載體pPB127(5519 bp).用Sail和NotI消化載體pPB127以釋放1560 bp的含有NP基因 的Sall-Notl片段。將此片段與預先經Sail和NotI消化的載體pVR1012 (實施例7)連接，得到質粒pPB142(6451 bp)(圖9)。實施例12:構建質粒pPB144(豬流感HA基因，H3N2抹)用根據實施例4所述技術製備的豬流感病毒(SIVH3N2抹，Cotes du Nord 1987)基因組RNA ，和下列寡核苷酸 PB095(31聚體)(SEQ ID NO: 15)5， GTTCTGCAGGCAGGGGATAATTCTATCAACC 3' PB096(36聚體)(SEQ ID NO: 16)5， TTGCGGCCGCAAGGGTGTTTTTAATTACTAATATAC 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從SIVH3N2中精確地分 離PstI-NotI片斷形式的編碼HA蛋白的基因(圖IO和SEQ ID NO:17)。純化之後，將1765 bp的RT-PCR產物與載體PCRII-direct(Invitrogen Reference K2000畫01)連接，得到載體pPB120(5716 bp)。用NotI消化載體pPB120以釋放1797 bp的含有HA基因的NotI -NotI片段。將此片段與預先經Notl消化的載體pVR1012(實施例7)連 接，得到質粒pPB144(6712bp)，該質粒在相對於啟動子正確的方向上 含有H3N2 HA基因(圖11)。實施例13:構建質粒pPB132(豬流感NP基因，H3N2抹)用根據實施例4所述技術製備的豬流感病毒(SIVH3N2祙，Cotes du Nord 1987)基因組RNA ，和下列寡核苷酸 PB097(36聚體)(SEQ ID NO: 12) 5， CCGGTCGACCGGGATAATCACTCACTGAGTGACATC 3' PB098(33聚體)(SEQ ID NO: 13)5， TTGCGGCCGCTGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從SIVH3N2中精確地分 離SalI-NotI片段形式的編碼NP蛋白的基因(圖12和SEQ IDNO:18)。 純化之後，將1564 bp的RT-PCR產物與載體PCRII-direct(Invitrogen Reference K2000-01)連接，得到載體pPB123(5485 bp)。
用Sail和Notl消化栽體pPB123以釋放1558 bp的含有NP基因 的Sail-NotI片段。將此片段與預先經SalI和NotI消化的載體 pVR1012 (實施例7)連接，得到質粒pPB132(6449 bp)(圖13)。
實施例14 :構建質粒pAB025(PRRSV ORF5基因，Lelystad株)
用根據實施例4所述技術製備的PRRSV病毒(Lelystad抹)基因組 RNA(丄Meulenberg等，病毒學(Virology ) ， 1993， 19， 62-72), 和下列寡核苷酸 AB055(34聚體)(SEQ ID NO: 19)
5， ACGCGTCGACAATATGAGATGTTCTCACAAATTG 3' AB056(33聚體)(SEQ ID NO:20)5' CGCGGATCCCGTCTAGGCCTCCCATTGCTCAGC 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從PRRS病毒Lelystad抹 中精確地分離編碼包膜糖蛋白E(gp25)的"ORF5"基因。純化之後， 用Sail和BamHI消化630 bp的RT-PCR產物以分離617 bp的Sall-BamHI片段。將此片段與預先經SalI和BamHI消化的載體pVR1012 (實施例7)連接，得到質粒pAB025(5486 bp)(圖14)。
實施例15:構建質粒pAB001(PRRSVORF5基因，USA株)
用根據實施例4所述技術製備的PRRSV病毒(ATCC VR2332抹) 基因組RNA(M. Murtaugh等，Arch Virol ， 1995， 140， 1451-1460)，和下列寡核苷酸
AB001(30聚體)(SEQ ID NO:21)5， AACTGCAGATGTTGGAGAAATGCTTGACCG 3' AB002(30聚體)(SEQ ID NO:22)5， CGGGATCCCTAAGGACGACCCCATTGTTCC 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從PRRS病毒ATCC陽 VR2332抹中精確地分離編碼包膜糖蛋白E(gp25)的基因。純化之後， 用Pstl和BamHI消化620 bp的RT-PCR產物以分離606 bp的Pstl畫 BamHI片斷。將此片段與預先經Pstl和BamHI消化的載體pVR1012 (實施例7)連接，得到質粒pABO01(5463 bp)(圖15)。實施例16 :構建質粒pAB091(PRRSV ORF3基因，Lelystad抹)用根據實施例4所述技術製備的PRRSV病毒(Lelystad抹)基因組 RNA(J. Meulenberg等，病毒學，1993, 19， 62-72),和下列寡核苷 酸AB170(32聚體)(SEQ ID NO:23)5， AAACTGCAGCAATGGCTCATCAGTGTGCACGC 3' AB171(30聚體)(SEQ ID NO:24)5， CGCGGATCCTTATCGTGATGTACTGGGGAG 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從PRRS病毒Lelystad抹 中精確地分離編碼包膜糖蛋白"gp45"的"ORF3"基因。純化之後， 用Pstl和BamHI消化818 bp的RT-PCR產物以分離802 bp的Pstl-BamHI片斷。將此片段與預先經PstI和BamHI消化的載體pVR1012 (實施例7)連接，得到質粒pAB091(5660 bp)(圖16)。實施例17 :構建質粒pAB092(PRRSV ORF3基因，USA抹)用根據實施例4所述技術製備的PRRSV病毒(ATCC VR2332抹) 基因組RNA(M. Murtaugh等，Arch Virol ， 1995， 140， 1451-1460)，和下列寡核苷酸 AN172(32聚體)(SEQ ID NO:25)5， AAACTGCAGCAATGGTTAATAGCTGTACATTC 3' AB173(32聚體)(SEQ ID NO:26)5， CGCGGATCCCTATCGCCGTACGGCACTGAGGG 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從PRRS病毒ATCC-VR2332抹中精確地分離編碼包膜糖蛋白"gp45"的"ORF3"基因。 純化之後，用Pstl和BamHI消化785 bp的RT-PCR產物以分離769 bp 的Pstl-BamHI片段。將此片段與預先經PstI和BamHI消化的栽體 pVR1012 (實施例7)連接，得到質粒pAB092(5627 bp)(圖17)。實施例18 :構建質粒pAB004(豬細小病毒VP2基因)用根據實施例4所述技術製備的豬細小病毒(NADL2抹)基因組 RNA(J. Vasudevacharya等，病毒學，19卯，178， 611-616)，和下列寡核苷酸AB007(33聚體)(SEQ ID NO:27)5， AAAACTGCAGAATGAGTGAAAATGTGGAACAAC 3， AB010(33聚體)(SEQ ID NO:28)5， CGCGGATCCCTAGTATAATTTTCTTGGTATAAG 3" 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以擴增含有編碼豬細小病毒 VP2蛋白之基因的1757bp的片段。純化之後，用Pstl和BamHI消化 RT-PCR產物，得到1740bp的Pstl-BamHI片段。將此片段與預先經 Pstl和BamHI消化的載體pVR1012 (實施例7)連接，得到質粒pAB004 (6601bp)(圖18)。實施例19 :構建質粒pAB069(豬痘HCV El基因)用根據實施例4所述技術製備的豬瘟病毒(HCV)(Alfort抹)基因組 RNA(G. Meyers等，病毒學，1989 ， 171 ， 18-27)，和下列寡核苷酸 AB126(36聚體)(SEQ ID NO:29)5， ACGCGTCGACATGAAACTAGAAAAAGCCCTGTTGGC 3' AB127(34聚體)(SEQ ID NO:30)5， CGCGGATCCTCATAGCCGCCCTTGTGCCCCGGTC 3' 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從HCV病毒中分離1363 bp的RT-PCR片段形式的編碼El蛋白的序列.純化之後，用SalI和 BamHI消化此片段，得到1349 bp的SalI-BamHI片段。將此片段與 預先經Sail和BamHI消化的載體pVR1012 (實施例7)連接，得到質 粒pAB069(6218 bp)(圖19)。實施例20:構建質粒pAB061(豬痘HCVE2基因)用根據實施例4所述技術製備的豬瘟病毒(HCV)(Alfort抹)基因組 RNA(G. Meyers等，病毒學，1989 ， 171 ， 18-27),和下列寡核普酸 AB118(36聚體)(SEQ ID NO:31)5" ACGCGTCGACATGTCAACTACTGCGTTTCTCATTTG 3， AB119(33聚體)(SEQ ID NO:32)5， CGCGGATCCTCACTGTAGACCAGCAGCGAGCTG 3， 根據實施例6所述技術進行RT-PCR反應以從HCV病毒中分離1246bp 的RT-PCR片段形式的編碼E2蛋白的序列。純化之後，用SalI和 BamHI消化此片段，得到1232 bp的SalI-BamHI片段。將此片段與 預先經Sail和BamHI消化的載體pVR1012 (實施例7)連接，得到質 粒pAB061 (6101bp)(圖20)。實施例21 :構建質粒pPBl^(缺失的大葉性肺炎放線桿菌apxl基因) 克隆大葉性肺炎放線桿菌apxl基因以缺失胺基酸719-846之間富含甘氨酸的胺基酸區域(涉及鈣離子的結合)。用根據實施例2和3所述技術製備的大葉性肺炎放線桿菌(血清型l)的基因組DNA(J. Frey等，感染和免疫(Infect. Immun.)， 1991,59, 3026-3032),和下列寡核苷酸PB174(32聚體)(SEQ ID NO:33)5， TTGTCGACGTAAATAGCTAAGGAGACAACATG 3' PB189(29聚體)(SEQ ID NO:34)
5， TTGAATTCTTCTTCAACAGAATGTAATTC 3' 進行PCR反應以擴增SalI-EcoRI片段形式的編碼大葉性肺炎放線桿菌 溶血素I蛋白之apxI基因的5，部分。純化之後，用SalI和EcoRI消化 2193 bp的PCR產物以分離2183 bp的Sall-EcoRI片段(片段A)。用大葉性肺炎放線桿菌(血清型l)的基因組DNA(J. Frey等， Infect. Immun., 1991， 59, 3026-3032)，和下列寡核苷酸 PB1卯(32聚體)(SEQ ID NO:35)5， TTGAATTCTATCGCTACAGTAAGGAGTACGG 35 PB175(31聚體)(SEQ ID NO:36)5， TTGGATCCGCTATTTATCATCTAAAAATAAC 3' 進行PCR反應以擴增EcoRI-BamHI片段形式的編碼大葉性肺炎放線 桿菌溶血素I蛋白之apxI基因的3，部分。純化之後，用EcoRI和BamHI 消化576 bp的PCR產物以分離566 bp的EcoRI-BamHI片段(片段 B)。將片段A和B與預先經SalI和BamHI消化的載體pVR1012(實 施例7)連接，得到質粒pPB162(7619 bp)(圖21)。實施例22 :構建質粒pPB163(缺失的大葉性肺炎放線桿菌apxll基因) 克隆大葉性肺炎放線桿菌apxll基因以缺失胺基酸716-813之間富含甘氨酸的胺基酸區域(涉及鈣離子的結合)。用根據實施例2和3所述技術製備的大葉性肺炎放線桿菌(血清型9)的基因組DNA(M. Smits等，感染和免疫(Infection andImmunity), 1991, 59， 4497-4504)，和下列寡核苷酸PB176(31聚體)(SEQ ID NO:37)5， TTGTCGACGATCAATTATATAAAGGAGACTC 3'PB191(30聚體)(SEQ ID NO:38)5， TTGAATTCCTCTTCAACTGATTTGAGTGAG 3"進行PCR反應以擴增Sall-EcoRI片段形式的編碼大葉性肺炎放線桿菌溶血素II蛋白之apxll基因的5，部分.純化之後，用Sail和EcoRI消化21卯bp的PCR產物以分離2180 bp的Sall-EcoRI片段(片段A). 用大葉性肺炎放線桿菌(血清型9)的基因組DNA(M. Smits等，感 染和免疫，1991， 59， 4497-4504),和下列寡核苷酸 PB192(29聚體)(SEQ ID NO:39) 5， TTGAATTCGTAAATCTTAAAGACCTCACC 3' PB177(30聚體)(SEQ ID NO:40) 5， TTGGATCCACCATAGGATTGCTATGATTTG 3' 進行PCR反應以擴增EcoRI-BamHI片段形式的編碼大葉性肺炎放線 桿菌溶血素II蛋白之apxII基因的3，部分.純化之後，用EcoRI和 BamHI消化473 bp的PCR產物以分離463 bp的EcoRI-BamHI片段 (片段B)。將片段A和B與預先經Sail和BamHI消化的載體pVR1012 (實 施例7)連接，得到質粒pPB163(7513 bp)(圖22)。實施例23 :構建質粒pPB174'， pPB189和pPBl卯(缺失的大葉性肺炎放線桿菌apxIII基因)apxIII缺失的第一個實施例(質粒pPBl74，)克隆大葉性肺炎放線桿菌apxIII基因以缺失胺基酸733-860之間 富含甘氨酸的胺基酸區域(涉及鈣離子的結合)。用根據實施例2和3所述技術製備的大葉性肺炎放線桿菌(血清型 8)的基因組DNA(M. Smits ， 1992 ， Genbank序列登記號為 X68815),和下列寡核苷酸 PB278(30聚體)(SEQ ID NO:41)5, TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG 3' PB279(28聚體)(SEQ ID NO:42) 5， TTTATCGATTCTTCTACTGAATGTAATTC 3' 進行PCR反應以擴增Sall-Clal片段形式的apxIII基因(編碼大葉性肺 炎放線桿菌溶血素III蛋白)的5，部分。純化之後，用Sail和aai消化 2216 bp的PCR產物以分離2205 bp的Sall-Clal片段(片段A)。 用大葉性肺炎放線桿菌(血清型8)的基因組DNA(M. Smits ， 1992， Genbank序列登記號為X68815),和下列寡核苷酸 PB280(33聚體)(SEQ ID NO:43)5' TTTATCGATTTATGTTTATCGTTCCACTTCAGG 3， PB307(32聚體)(SEQ ID NO:44)5， TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3" 進行PCR反應以擴增Clal-BamHI片段形式的apxIII基因(編碼大葉性 肺炎放線桿菌溶血素III蛋白)的3，部分。純化之後，用ClaI和BamHI 消化596 bp的PCR產物以分離583 bp的Clal-BamHI片段(片段B), 將片段A和B與預先經Sail和BamHI消化的栽體pVR1012 (實施例7) 連接，得到質粒pPB174，(7658 bp)(圖23)。apxIII缺失的第二個實施例(質粒pPB189)克隆大葉性肺炎放線桿菌apxIII基因以缺失胺基酸705-886之間 富含甘氨酸的胺基酸區域(涉及鈣離子的結合)。用根據實施例2和3所述技術製備的大葉性肺炎放線桿菌(血清型8) 的基因組DNA(M. Smits ， 1992 ， Genbank序列登記號為 X68815),和下列寡核苷酸PB278(30聚體)(SEQ ID NO:41)5， TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG 3， PB303(32聚體)(SEQ ID NO:45)5' TTTATCGATTTCTTCACGTTTACCAACAGCAG 3' 進行PCR反應以擴增Sall-Clal片段形式的apxIII基因(編碼大葉性肺 炎放線桿菌溶血素III蛋白)的5，部分。純化之後，用SalI和ClaI消化 2133 bp的PCR產物以分離2122 bp的Sall-Clal片段(片段A)。 用大葉性肺炎放線桿菌(血清型8)的基因組DNA(M. Smits , 1992， Genbank序列登記號為X68815),和下列寡核苷酸 PB306(31聚體)(SEQ ID NO:46)5， TTTATCGATTCTGATTTTTCCTTCGATCGTC 3， PB307(32聚體)(SEQ ID NO:44)
5， TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3， 進行PCR反應以擴增ClaI-BamHI片段形式的apxIII基因(編碼大葉性 肺炎放線桿菌溶血素III蛋白)的3，部分.純化之後，用ClaI和BamHI 消化518 bp的PCR產物以分離506 bp的ClaI-BamHI片段(片段B), 將片段A和B與預先經Sail和BamHI消化的栽體pVR1012 (實施例7) 連接，得到質粒pPB189(7496 bp)(圖24)。apxIII缺失的第三個實施例(質粒pPB190)克隆大葉性肺炎放線桿菌apxIII基因以缺失胺基酸718-876之間 富含甘氨酸的胺基酸區域(涉及鈣離子的結合)。用根據實施例2和3所述技術製備的大葉性肺炎放線桿菌(血清型8) 的基因組DNA(M. Smits ， 1992 ， Genbank序列登記號為 X68815),和下列寡核普酸PB278(30聚體)(SEQ ID NO:41)5， TTTGTCGACATGAGTACTTGGTCAAGCATG 3' PB304(33聚體)(SEQ ID NO:47)5， TTTATCGATACCTGATTGCGTTAATTCATAATC 3' 進行PCR反應以擴增Sall-Clal片段形式的apxIII基因(編碼大葉性肺 炎放線桿菌溶血素III蛋白)的5'部分。純化之後，用Sail和Clal消化 2172 bp的PCR產物以分離2161 bp的Sall-Clal片段(片段A)。 用大葉性肺炎放線桿菌(血清型8)的基因組DNA(M. Smits , 1992， Genbank序列登記號為X68815),和下列寡核苷酸 PB305(31聚體)(SEQ ID NO:48)5' TTTATCGATAAATCTAGTGATTTAGATAAAC 3' PB307(32聚體)(SEQ ID NO:44)5， TTGGATCCTTAAGCTGCTCTAGCTAGGTTACC 3' 進行PCR反應以擴增Clal-BamHI片段形式的apxIII基因(編碼大葉性 肺炎放線桿菌溶血素III蛋白)的3，部分 純化之後，用Clal和BamHI 消化548 bp的PCR產物以分離536 bp的Clal-BamHI片段(片段B)。 將片段A和B與預先經Sail和BamHI消化的載體pVR1012 (實施例 7)連接，得到質粒pPBl卯(7565 bp)(圖25).實施例24:製備和純化質粒為了製備欲接種動物的質粒，可使用能得到超螺旋形式佔優勢的純 化質粒懸浮液的任何技術，這些技術是本領域技術人員所熟知的。這裡 可特別提到J. Sambrook等人(分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉 港實驗室，冷泉港，紐約，1989)所述的鹼裂解技術，接著再在溴化乙 錠的存在下，在氯化銫梯度中進行2次連續的超速離心。也可參照專利 申請PCT WO 95/21250和PCT WO 96/02658 ，它們描述了工業化規 模生產可用於接種之質粒的方法。為了製備疫苗(見實施例17)，可重新 懸浮純化的質粒以得到適於儲存的高濃度溶液(〉2mg/ml)。為此，將質 粒重新懸浮於超純水或TE緩衝液(10mM Tris-HCl; lmM EDTA ， pH8.0)中。實施例25:製備聯合疫苗從其濃縮溶液(實施例16)開始混合製備聯合疫苗所需的多種質 粒。製備混合物以使各個質粒的終濃度相當於各個質粒的有效劑量。可 被用於調節疫苗終濃度的溶液可以是0.9 %的NaCl溶液，也可以是PBS緩衝液。也可以將特殊的製劑，如脂質體，陽離子脂質用於製備疫苗。實施例26 :對豬的接種以每種質粒100 ， 250或500pg的劑量接種豬。 通過肌內途徑用針頭進行注射。此時，以2ml的體積施用疫苗劑量。也可使用在5個點分送0.2ml劑量(每個注射點0.04ml)的液體噴射 注射器裝置(不帶針頭)(如"PIGJET"裝置)，經由皮內途徑進行注射. 此時，施用的疫苗劑量體積為0.2或0.4ml,這分別相應於注射l次或 2次.當利用PIGJET裝置進行2次連續的注射時，應將注射區間隔開 以使2個注射區彼此間隔約l-2cm的距離. 序列表梅瑞爾公司抗豬生殖和呼吸疾病的多核苷酸疫苗製劑 454313-2230. 1 09/784,984 2001-02-16<150〉 FR 96/09338 1996-07-19 PCT/FR97/01313 1997-07-15 US 6,207, 165 2001-03-27 54<170〉 Patentln version 3-1<210〉 1 2742 DNA 假狂犬病病毒 CDS (1)..(2742) 1atg ccc get ggt ggc Met Pro Ala Gly Gly 1 5ggg cac cac ggc ggt Gly His His Gly Gly 20cac get gca get gcg His Ala Ala Ala Ala 35ggt ctt tgg cgc ggg Gly Leu Trp Arg Gly 10ccc egg ggg cat egg ccc Pro Arg Gly His Arg Pro 1548get ggc etc gga cgt Ala Gly Leu Gly Arg 25ctt tgg cct get cca cac Leu Trp Pro Ala Pro His 3096egg ggc gcc gtc gcg Arg Gly Ala Val Ala 40eta gcg ctg ctg ctg ctg Leu Ala Leu Leu Leu Leu 45 gcg etc gcc gcg gcc ccg ccg tgc ggc gcg gcg gcc gtg acg egg gcc Ala Leu Ala Ala Ala Pro Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Thr Arg Ala 50 55 60192gcc tcg gcc tcg ccg acg ccc ggg acg ggc gcc acc ccc aac gac gtc Ala Ser Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Gly Ala Thr Pro Asn Asp Val 65 70 75 80240tec gcc gag gcg tec etc gag gag ate gag gcg ttc tec ccc ggc ccc Ser Ala Glu Ala Ser Leu Glu Glu lie Glu Ala Phe Ser Pro Gly Pro 85 90 95288tcg gag gcc ccc gac ggc gag tac ggc gac ctg gac gcg egg acg gcc Ser Glu Ala Pro Asp Gly Glu Tyr Gly Asp Uu Asp Ala Arg Thr Ala 100 105 110336gtg cgc gcg gcc gcg acc gag egg gac cgc ttc tac gtc tgc ccg ccg Val Arg Ala Ala Ala Thr Glu Arg Asp Arg Phe Tyr Val Cys Pro Pro 115 120 125384ccg tec ggc tec Pro Ser Gly Ser 130acg gtg gtg egg ctg gag ccc gag cag gcc tgc ccc Thr Val Val Arg Uu Glu Pro Glu Gin Ala Cys Pro 135 140432gag tac tcg cag Glu Tyr Ser Gin 145ggg'cgc aac ttc acg gag ggg ate gcc ctg etc ttc Gly Arg Asn Phe Thr Glu Gly lie Als Uu Leu Phe 150 155 160480aag gag aac ate Lys Glu Asn liegcc ccg cac aag ttc aag gcc cac Ala Pro His Lys Phe Lys Ala His 165 170ate tac tac aag lie Tyr Tyr Lys 175528aac gtc ate gtc Asn Val lie Val 180acg acc gtg tgg tec ggg age acg tac gcg gcc ate Thr Thr Val Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Ala Ala lie 185 190576acg aac cgc ttc Thr Asn Arg Phe 195aca gac cgc gtg ccc gtc ccc gtg cag gag ate acg Thr Asp Arg Val Pro Val Pro Val Gin Glu lie Thr 200 205624gac gtg ate gac Asp Val lie Asp 210cgc cgc ggc aag tgc gtc tec aag gcc gag tac gtg Arg Arg Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr Val 215 220672formula see original document page 29Ala Leu Gly Ala Ser Phe Val Ser Asp Val Thr Gin Leu Asp Leu Gin 405 410 415cgc gtg celc ctg Arg Val His Leu 420ggc gac tgc gtc ctc cgc gag gcc teg gag gcc ate Gly Asp Cys Val Uu Arg Glu Ala Ser Glu Ala lie 425 4301296gac gcc ate tac egg egg cgc tac aac age acg cac gtg ctg gcc ggc Asp Ala lie Tyr Arg Arg Arg Tyr Asn Ser Thr His Val Leu Ala Gly 435 440 4451344gac agg ccc gag gtg tac ctc gcc cgc ggg ggc ttc gtg gtg gcc ttc Asp Arg Pro Glu Val Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Val Val Ala Phe 450 455 4601392cgc ccg ctg ate teg aac gag ctg gcg cag ctg tac gcg cgc gag ctc Arg Pro Leu lie Ser Asn Glu Leu Ala Gin Leu Tyr Ala Arg Glu Leu 465 470 475 4801440gag cgc ctc ggc ctc gcc ggc gtc gtg ggc ccc gcg gcc ccc gcg gcc Glu Arg Leu Gly Leu Ala Gly Val Val Gly Pro Ala Ala Pro Ala Ala 485 490 4951488gcc cgt egg gcc egg cgc tec ccc ggc ccg gcg ggg acg ccc gag ccg Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Glu Pro 500 505 5101536ccg gcc gtc Pro Ala Val 515幼c Asnggc Glyacg Thrggg cac Gly His 520ctg Leucgc Argate acc acg lie Thr Thr 525ggcGlyteg gcg Ser Ala1584gag ttt gcg cgc ctg cag ttc acc tac gac cac ate cag gcg cac gtg Glu Phe Ala Arg Leu Gin Phe Thr Tyr Asp His lie Gin Ala His Val 530 535 5401632aac gac atg ctg ggc cgc ate gcg gcc gcc tgg tgc gag ctg cag aac Asn Asp Met Leu Gly Arg lie Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gin Asn 545 550 555 5601680aag gac cgc acc ctg tgg age gag atg teg cgc ctg aac ccc age gcc Lys Asp Arg Thr Leu Trp Ser Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser Ala 565 570 5751728gtg gcc acg gcc gcg ctc ggc cag cgc gtc tgc gcg cgc atg ctc ggc Val Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gin Arg Val Cys Ala Arg Met Leu Gly1776
580585590gac gtg atg gcc ate teg egg tgc gtg gag gtg cgc ggc ggc gtg tac Asp Val Met Ala lie Ser Arg Cys Val Glu Val Arg Gly Gly Val Tyr5956006051824gtg cag aac tec atg cgc gtg ccc ggc gag cgc ggc acg tgc tac age Val Gin Asn Ser Met Arg Val Pro Gly Glu Arg Gly Thr Cys Tyr Ser 610 615 6201872cgc ccg ctg gtc acc ttc gag cac aac ggc acg ggc gtg ate gag ggc Arg Pro Leu Val Thr Phe Glu His Asn Gly Thr Gly Val lie Glu Gly 625 630 635 6401920cag etc ggc Gin Leu Glygac gac aac Asp Asp Asn 645gag etc etc ate Glu Leu Leu lie 650teg cgc gac etc ate gag Ser Arg Asp Leu lie Glu 6551968ccc tgc acc Pro Cys Thrggc aeic esc Gly Asn His 660egg cgc tac ttt Arg Arg Tyr Phe 665aag ctg ggg age Lys Leu Gly Ser 670ggg tac Gly Tyr2016gtg tac tac Val Tyr Tyr 675g3g g8C t3CGlu Asp Tyraac tac gtg cgc Asn Tyr Val Arg 680atg gtg gag Met Val Glu 685gtgValccc gag Pro Glu2064acg ate age acg egg gtt acc ctg aac ctg acg ctg ctg gag gac cgc Thr lie Ser Thr Arg Val Thr Uu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp Arg 690 695 7002112gag ttc ctg Glu Phe Uu 705ccc etc gag Pro Leu Glu 710gtg tac acg cgc Val Tyr Thr Arggag gag Glu Glu 715etc Leugcc Alagac acg Asp Thr 7202160ggc etc ctg gac tac age gag ate cag cgc cgc aac cag ctg cac gcg Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu lie Gin Arg Arg Asn Gin Leu His Ala 725 730 7352208etc aag ttc tac gac ate gac cgc gtg gtc aag gtg gac cac aac gtg Leu Lys Phe Tyr Asp lie Asp Arg Val Val Lys Val Asp His Asn Val 740 745 7502256gtg ctg ctg VbI Leu Leu 755cgc ggc ate Arg Gly liegcc aac ttc ttc cag ggc Ala Asn Phe Phe Gin Gly 760etc ggc gac gtg Leu Gly Asp Val 7652304
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Gly Gin Leu Ser Thr Arg Gly Val Gin lie Ala Ser Asn 355 360 3651104gaa aac atg gaa aca atg gag tec agt act ctt gaa ctg aga age aaa1152Glu Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Lys 370 375 380tac tgg get ata aga acc agg age gga gga aac Tyr Trp Ala lie Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn 385 390 395acc肪c caa cag aga Thr Asn Gin Gin Arg 4001200gca tct gca ggg caa ate agt gta caa ctt act ttc teg gta cag aga Ala Ser Ala Gly Gin lie Ser Val Gin Leu Thr Phe Ser Val Gin Arg 405 410 4151248aat ctt cct ttc gag aga gcg acc ate atg gca gca ttt aca ggg aac Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr lie Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn 420 425 4301296act gaa Thr Gluggc Gly 435aga ArgThrtct gac Ser Aspatg Met 4403gg 8CtArg Thrgaa Glu8tt 8ta lie lie 445aga atg Arg MetBtgMet1344gaa agt Glu Ser 450gcc Alaaga ArgProgaa gat Glu Asp 455gtg Valtec ttc Ser Phecag Ginggg egg Gly Arg 460gga gtc Gly Valttc Phe1392gag etc teg gac gaa aag gca acg aac ccg ate gtg cct tec ttt gac Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro 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<212〉 ■<213〉豬流感病毒 16ttgcggccgc aagggtgttt ttaattacta atatac36 <213〉171701 腿豬流感病毒<220〉 <223〉CDS (1).(1698) 17 atg aag act Met Lys 1Thrgtc att gcc ttg age tac att ttc tgt ctg gtt ctt ggc Val lie Ala Uu Ser Tyr lie Phe Cys Uu Val Uu Gly 5 10 1548caa gac ctt cca gaa aat ggc age age aca gca aag cct ggt ctg gga Gin Asp Uu Pro Glu Asn Gly Ser Ser Thr Ala Lys Pro Gly Leu Gly 20 25 3096cat cat gcg gtg cca aac gga acg tta gtg aaa aca ate acg aat gat His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr lie Thr Asn Asp 35 40 45144cag ate gaa gtg act aat get act gag ctg gtc cag agt ttc tea atg Gin lie Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gin Ser Phe Ser Met 50 55 60192ggt aaa ata tgc aac aat cct cat cga gtt ctt gat gga gca aac tgt Gly Lys lie Cys Asn Asn Pro His Arg Val Leu Asp Gly Ala Asn Cys 65 70 75 80240aca ctg ata gat get eta ttg ggg gac cct cat tgt gat ggc ttt caa Thr Leu lie Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gin 85 90 95288肪t gag Asn Glu883Lystgg Trp 100Aspctt Leuttc Phegtt g肪 Val 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550 555 5601680agg tgc Arg CysAsnatt lietgc Cys 565ate lietg31701<210〉 18<211〉 1497 <212〉腿 〈213〉豬流感病毒〈220〉 CDS<222〉 (1)..(1494)<400〉 18atg gcg tct caa ggc act aaa cga tct tat gag cag atg gaa acc ggt Met Ala Ser Gin Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gin Met Glu Thr Gly 15 10 1548gga gaa cgc egg aat get act gaa ate aga gca tct gtt ggg gga atg Gly Glu Arg Arg Asn Ala Thr Glu lie Arg Ala Ser Val Gly Gly Met 20 25 3096gtt ggt gga att gga aga ttc tac ata cag atg tgc act aaa etc aaa Val Gly Gly lie Gly Arg Phe Tyr lie Gin Met Cys Thr Lys Leu Lys 35 40 45144etc agt gac tat gaa ggg agg Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg 50 55aga atg gtt etc tct gca ttt Arg Met Val Leu Ser Ala Phe 65 70gaa cat ccc agt gcg ggg aag Glu His Pro Ser Ala Gly Lys 85tac aga aag aga gac gga aaa Tyr Arg Lys Arg Asp Gly Lys 100aaa gag gag ate agg agg att Lys Glu Glu lie Arg Arg lie 115get act get ggt etc act cat Ala Thr Ala Gly Leu Thr His 130 135gat gcc aca tat cag aga aca Asp Ala Thr Tyr Gin Arg Thr 145 150ccc aga atg tgc tct ctg 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Asn Gly Arg Arg Thr Arg lie Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220ate etc aaa ggg aaa ttt cag aca gca gcg caa cga lie Leu Lys Gly Lys Phe Gin Thr Ala Ala Gin Arg 225 230 235gca acg atg gac Ala Thr Met Asp 240720cag gtg cga gaa age aga aat cct ggg aat get gag att gaa gac ctt Gin Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu lie Glu Asp Leu 245 250 255768ate ttt eta gca cga tct gca etc att ctg aga gga tea gtg get cat lie Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu lie Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270816aaa tec tgt ctg cct get tgt gta tat gga ctt gtt gtg gca agt gga Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Val Val Ala Ser Gly 275 280 285864tat gac ttt gaa aga gaa ggg tac tct eta gtc gga ata gat cct ttc Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly lie Asp Pro Phe 290 295 300912cgt ctg etc cag aac age cag gtg ttc age etc att aga cca aat gag Arg Leu Leu Gin Asn Ser Gin Val Phe Ser Leu lie Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320960aat cca gca cat aag agt cag ttg gta tgg atg gca tgc cat tct gca Asn Pro 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49 913 PRT假狂犬病病毒 49Met Pro Ala Gly Gly Gly Leu Trp Arg Gly Pro Arg Gly His Arg Pro 15 10 15Gly His His Gly Gly Ala Gly Leu Gly Arg Uu Trp Pro Ala Pro His 20 25 30His Ala Ala Ala Ala Arg Gly Ala Val Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu 35 40 45Ala Leu Ala Ala Ala Pro Pro Cys Gly Ala Ala Ala Val Thr Arg Ala 50 55 60Ala Ser Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Gly Ala Thr Pro Asn Asp Val 65 70 75 80Ser Ala Glu Ala Ser Leu Glu Glu lie Glu Ala Phe Ser Pro Gly Pro 85 90 95Ser Glu Ala Pro Asp Gly Glu Tyr Gly Asp Uu Asp Ala Arg Thr Ala 100 105 110Val Arg Ala Ala Ala Thr Glu Arg Asp Arg Phe Tyr Val Cys Pro Pro 115 120 125Pro Ser Gly Ser Thr Val Val Arg Leu Glu Pro Glu Gin Ala Cys Pro 130 135 140Glu Tyr Ser Gin Gly Arg Asn Phe Thr Glu Gly lie Ala Leu Leu Phe 145 150 155 160Lys Glu Asn lie Ala Pro His Lys Phe Lys Ala His lie Tyr Tyr Lys 165 170 175Asn Val lie Val Thr Thr Val Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Ala Ala lie 180 185 190Thr Asn Arg Phe Thr Asp Arg Val Pro Val Pro Val Gin Glu lie Thr 195 200 205200710127053.X說明書第55/69頁Asp Val lie Asp Arg Arg Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr Val 210 215 220Arg Asn Asn His Lys Val Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asn Pro Val 225 230 235 240Glu Val Asp Leu Arg Pro Ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly Thr Arg Ala 245 250 255Trp His Thr Thr Asn Asp Thr Tyr Thr Lys lie Gly Ala Ala Gly Phe 260 265 270Tyr Gin Thr Gly Thr Ser Val Asn Cys lie Val Glu Glu Val Glu Ala 275 280 285Arg Ser Val Tyr Pro Tyr Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp lie 290 295 300Val Tyr Met Ser Pro Phe Tyr Gly Uu Arg Glu Gly Ala His Gly Glu 305 310 315 320Gin lie Gly Tyr Ala Pro Gly Arg Phe Gin Gin Val Glu His Tyr Tyr 325 330 335Pro lie Asp Leu Asp Ser Arg Leu Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Arg 340 345 350Asn Phe Leu Arg Thr Pro His Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Ala Pro 355 360 365Lys Thr Arg Arg Val Cys Ser Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ala Glu Glu 370 375 380Met Thr Arg Asp Glu Thr Arg Asp Gly Ser Phe Arg Phe Thr Ser Arg 385 390 395 400Ala Leu Gly Ala Ser Phe Val Ser Asp Val Thr Gin Leu Asp Leu Gin 405 410 415Arg Val His Leu Gly Asp Cys Val乙eu Arg Glu Ala Ser Glu Ala lie 420 425 430Asp Ala lie Tyr Arg Arg Arg Tyr Asn Ser Thr His Val Leu Ala Gly 435 440 445Asp Arg Pro Glu Val Tyr Leu Ala Arg Gly Gly Phe Val Val Ala Phe 450 455 460Arg Pro Leu lie Ser Asn Glu Leu Ala Gin Leu Tyr Ala Arg Glu Leu 465 470 475 480Glu Arg Leu Gly Leu Ala Gly Val Val Gly Pro Ala Ala Pro Ala Ala 485 490 495Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Glu Pro 500 505 510Pro Ala Val Asn Gly Thr Gly His Leu Arg lie Thr Thr Gly Ser Ala 515 520 525Glu Phe Ala Arg Leu Gin Phe Thr Tyr Asp His lie Gin Ala His Val 530 535 540Asn Asp Met Leu Gly Arg lie Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gin Asn 545 550 555 560Lys Asp Arg Thr Leu Trp Ser Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser Ala 565 570 575Val Ala Thr Ala Ala Leu Gly Gin Arg Val Cys Ala Arg Met Leu Gly 580 585 590Asp Val Met Ala lie Ser Arg Cys Val Glu Val Arg Gly Gly Val Tyr 595 600 605Val Gin Asn Ser Met Arg Val Pro Gly Glu Arg Gly Thr Cys Tyr Ser 610 615 620Arg Pro Leu Val Thr Phe Glu His Asn Gly Thr Gly Val lie Glu Gly 625 630 635 640Gin Leu Gly Asp Asp Asn Glu Leu Leu lie Ser Arg Asp Leu lie Glu 645 650 655Pro Cys Thr Gly Asn His Arg Arg Tyr Phe Lys Leu Gly Ser Gly Tyr 660 665 670Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Asn Tyr Val Arg Met Val Glu Val Pro Glu 675 680 685Thr lie Ser Thr Arg Val Thr Leu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp Arg 690 695 700Glu Phe Leu Pro Leu Glu Val Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Asp Thr 705 710 715 720Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu lie Gin Arg Arg Asn Gin Leu His Ala 725 730 735Leu Lys Phe Tyr Asp lie Asp Arg Val Val Lys Val Asp His Asn Val 740 745 750Val Leu Leu Arg Gly lie Ala Asn Phe Phe Gin Gly Leu Gly Asp Val 755 760 765Gly Ala Ala Val Gly Lys Val Val Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val lie 770 775 780Ser Ala Val Gly Gly Met Val Ser Phe Leu Ser Asn Pro Phe Gly Ala 785 790 795 800Leu Ala lie Gly Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Val Ala Ala Phe Leu 805 810 815Ala Tyr Arg His lie Ser Arg Leu Arg Arg Asn Pro Met Lys Ala Leu 820 825 830Tyr Pro Val Thr Thr Lys Thr Leu Lys Glu Asp Gly Val Asp Glu Gly 835 840 845Asp Val Asp Glu Ala Lys Leu Asp Gin Ala Arg Asp Met lie Arg Tyr 850 855 860Met Ser lie Val Ser Ala Leu Glu Gin Gin Glu His Lys Ala Arg Lys 865 870 875 880Lys Asn Ser Gly Pro Ala Leu Leu Ala Ser Arg Val Gly Ala Met Ala 885 890 895Thr Arg Arg Arg His Tyr Gin Arg Leu Glu Ser Glu Asp Pro Asp Ala 900 905 910Leu 50 404<212〉 PRT Aujesky病病毒(NIA3株) 50Met Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr Thr Leu 15 10 15Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro Pro Ala 20 25 30Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gin Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser 35 40 45Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp 50 55 60Pro Cys Gly Val Val Ala Leu lie Ser Asp Pro Gin Val Asp Arg Leu 65 70 75 80Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala His Val 85 90 95Ala Trp Tyr Arg lie Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe lie 100 105 110Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gin Ala Asp Leu Trp Ala Leu Pro 115 120 125Ala Pro His His Ala Asp Val Val Asp Pro Val Arg Gly Leu His Val 130 135 140Pro His Gly Gly Arg Ala Gly Ala Ala His Gly Gly Pro Arg Ala Val 145 150 155 160Gin Arg Gly Pro Val Pro Ala Pro Gly Val Arg Arg Arg Arg Glu His 165 170 175Pro His Arg Leu His Gly Gly Ala Pro Arg Gly Ala Arg Val Pro Val 180 185 190Arg Pro Arg Gly Pro Ala Pro His Val Gin Val Arg Arg Val Leu Glu 195 200 205Arg Arg Gin Leu Gin Ala Gly Arg Gly Arg Asp Ala lie Pro Asp Ala 210 215 220Val Leu Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gly Gly Glu Leu Leu Val Pro 225 230 235 240Gin Glu Arg Pro Asp Ala Pro Ala Gly Pro Arg Arg Arg His Ala Val 245 250 255Arg His Arg Pro Arg Ala Ala Leu Gly Gly Leu Ala Glu Ala Pro Ala 260 265 270Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Glu Ala Arg Ala Arg Pro Gly Asp 275 280 285Ala Arg Ala Pro Arg Pro Pro Ala Arg Ala Gly Asp Ala Gly Pro Arg 290 295 300Arg Arg Gly Pro Pro His Ala Ala Thr Pro Glu Ala Arg Asp Ala Ala 305 310 315 320Pro Pro Leu Arg Pro Ala Gly Arg Arg Ala Gin Arg Val Ala Ala Ala325330 335Arg Gly Ala Val Pro Ala Ala Asp Pro Arg Arg Ala Gly Arg Leu Ala340345 350Pro Pro Leu Gly Asp Arg Arg His Gly His Arg Asp Gly Arg Ala Pro355360 365Gly Gly Arg Val Arg Leu His Leu Leu Pro Pro Glu Gly Gly Glu Gly370375 380Val Ser Pro Pro Gly Arg Ser Arg Gly Arg Arg Arg Ala Lys Ser Ala 385 390 395 400Ala Arg Ser Val 51 566 PRT豬流感病毒(SIV, H1N1 'SW'株 51Met Glu Ala Lys Leu Phe Val Leu Phe Cys Thr Phe Thr Ala Uu Lys 15 10 15Ala Asp Thr lie Cys Val Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30Val Asp Thr lie Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Asn Gly Val 50 55 60Ala Pro Leu Gin Leu Gly Lys Cys Asn Val Ala Gly Trp lie Leu Gly 65 70 75 80Asn Pro Glu Cys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Asn Ser Trp Ser Tyr lie 85 90 95lie Glu Thr Ser Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Glu Phe 100 105 110lie Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Ala Asn Ser Trp Pro Asn His Glu 130 135 140Thr Thr Lys Gly lie 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52 <211〉 498 PRT <213〉豬流感病毒
52
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202530His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr lie Thr Asn A印 35 40 45Gin lie Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gin Ser Phe Ser Met 50 55 60Gly Lys lie Cys Asn Asn Pro His Arg Val Leu Asp Gly Ala Asn Cys 65 70 75 80Thr Leu lie Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gin 85 90 95Asn Glu Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Cys Phe Ser Asn 100 105 110Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu lie 115 120 125Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe lie Asn Glu Gly Phe Asn Trp Thr 130 135 140Gly Val Thr Gin Asn Gly Gly Ser Asn Ala Cys Lys Arg Gly Pro Asp 145 150 155 160Ser Gly Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Tyr Lys Ser Gly Asn Thr 165 170 175Tyr Pro Met Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Ser Asp Asn Phe Asp Lys 180 185 190Leu Tyr lie Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp Arg Glu Gin Thr 195 200 205Asn Leu Tyr Val Gin Val Ser Gly Lys Ala Thr Val Phe Thr Lys Arg 210 215 220Ser Gin Gin Thr lie lie Pro Asn Ser Arg Ser Arg Pro Trp Val Arg 225 230 235 240Gly Leu Ser Ser Arg lie Ser lie His Trp Thr lie Val Lys Pro Gly 245 250 255Asp lie Leu lie lie Asn Ser Asn Gly Asn Leu lie Ala Pro Arg Gly260265270Tyr Phe Lys Met His Asn Gly Arg Ser Ser lie Met Arg Ser Asp Ala 275 280 285Pro lie Gly Thr Cys Ser Ser Glu Cys lie Thr Pro Asn Gly Ser lie 290 295 300Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Lys lie Thr Tyr Gly Ala 305 310 315 320Cys Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 325 330 335Arg Asn lie Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly lie Phe Gly Ala lie Ala 340 345 350Gly Phe lie Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly 355 360 365Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin Ala Ala Asp Leu Lys 370 375 380Ser Thr Gin Ala Ala lie Asp Gin lie Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu 385 390 395 400lie Glu Lys Thr Asn Gly Lys Phe His Gin lie Glu Lys Glu Phe Ser 405 410 415lie Val Glu Gly Arg lie Gin Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr 420 425 430Lys lie Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu 435 440 445Asn Gin His Thr lie Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Ser Lys Leu Phe 450 455 460Glu Lys Thr Arg Arg Gin Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn 465 470 475 480Gly Cys Leu Gin lie Tyr His Lys Cys A印Asn Ala Cys lie Glu Ser 485 490 495lie Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Glu Tyr Arg Asp Glu Ala Leu 500 505 510Asn Asn Arg Phe Gin lie Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520 525Asp Trp lie Leu Trp lie Ser Ser Ala lie Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535 540Val Val Leu Uu Gly Phe lie Met Trp Ala Cys Gin Lys Gly Asn lie 545 550 555 560Arg Cys Asn lie Cys lie 565<210〉 54 498 PRT <213〉豬流感病毒<400〉 54Met Ala Ser Gin Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gin Met Glu Thr Gly 15 10 15Gly Glu Arg Arg Asn Ala Thr Glu lie Arg Ala Ser Val Gly Gly Met 20 25 30Val Gly Gly lie Gly Arg Phe Tyr lie Gin Met Cys Thr Lys Leu Lys 35 40 45Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu lie Gin Asn Ser lie Thr lie Glu 50 55 60Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 65 70 75 80Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro lie 85 90 95Tyr Arg Lys Arg Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu lie Met Tyr Asp 100 105 110Lys Glu Glu lie Arg Arg lie Trp Arg Gin Ala Asn Asn Gly Glu Asp 115 120 125 Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met lie Trp His Ser Asn Leu Asn 130 135 140Asp Ala Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 145 150 155 160Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gin Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 165 170 175Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 180 185 190Leu lie Arg Met lie Lys Arg Gly lie Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 195 200 205Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg lie Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn 210 215 220lie Leu Lys Gly Lys Phe Gin Thr Ala Ala Gin Arg Ala Thr Met Asp 225 230 235 240Gin Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu lie Glu Asp Leu 245 250 255lie Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu lie Leu Arg Gly Ser Val Ala His 260 265 270Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Val Val Ala Ser Gly 275 280 285Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Uu Val Gly lie Asp Pro Phe 290 295 300Arg Leu Leu Gin Asn Ser Gin Val Phe Ser Leu lie Arg Pro Asn Glu 305 310 315 320Asn Pro Ala His Lys Ser Gin Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala 325 330 335Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe lie Arg Gly Thr Lys Val 340 345 350Val Pro Arg Gly Gin Leu Ser Thr Arg Gly Val Gin lie Ala Ser Asn 355 360 365 Glu Asn Met Glu Thr Met Asp Ser lie Thr Leu Glu Leu Arg Ser Lys 370 375 380Tyr Trp Ala lie Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gin Gin Arg 385 390 395 400Ala Ser Ala Gly Gin lie Ser Val Gin Pro Thr Phe Ser Val Gin Arg 405 410 415Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr lie Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn 420 425 430Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu lie lie Arg Met Met 435 440 445Glu Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gin Gly Arg Gly Val Phe 450 455 柳Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro lie Val Pro Ser Phe Asp 465 470 475 480Val Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr 485 490 495Asn Asn
權利要求
1. 一種豬疫苗，其包含含有典型豬瘟病毒基因的質粒，所述基因選自El和E2。
2. 根據權利要求l的疫苗，其中所述質粒包含E1和E2基因二者。
3. 根據權利要求l的疫苗，其中所述質粒包含E1基因。
4. 根據權利要求l的疫苗，其中所述質粒包含E2基因。
5. 根據權利要求l的疫苗，其包含含有El基因的質粒和含有 E2基因的質粒。
全文摘要
抗豬生殖和/或呼吸疾病的豬疫苗製劑，所述製劑含有至少3種效價的多核苷酸疫苗，含有一個整合質粒，其可在宿主細胞中體內表達一種豬病原體效價的基因。這些效價選自兩組，即Aujeszkey病病毒、豬流感病毒、豬神秘病病毒、細小病毒病病毒、典型豬瘟病毒和引起放線桿菌病的細菌。對於每種效價而言，質粒含有一種或多種基因，該基因對於Aujeszkey病病毒選自gB和gD，對於豬流感病毒選自HA，NP和N，對於神秘病病毒選自E、ORF3、M，對於細小病毒病病毒選自VP2，對於瘟病毒病病毒選自E1、E2，對放線桿菌病選自apxI、apxII和apxIII。
文檔編號A61P31/14GK101121023SQ20071012705
公開日2008年2月13日 申請日期1997年7月15日 優先權日1996年7月19日
發明者A·布薩都恩, J-C·奧都尼特, M·裡威爾, P·保杜 申請人:梅瑞爾公司