用於肝細胞癌診斷的含微rna生物標記的診斷試劑盒和方法

2023-09-22 15:13:00 2

專利名稱：用於肝細胞癌診斷的含微rna生物標記的診斷試劑盒和方法
技術領域：
本發明涉及用於肝細胞癌(hepatocellular cancer)血眾中的微RNA(microRNA)表達譜分析的組合物和方法。
背景技術：
肝細胞癌(也稱作肝細胞癌症(hepatocellular carcinoma, HCC))是世界範圍內最常見的實體惡性腫瘤之一。其代表了肝癌的主要組織學類型，可能佔所有肝癌病例的70%-85%。世界每年有大約500，000個新病例，和幾乎相同數目的死亡病例，這反映出對這種疾病缺乏有效的早期檢測和治療選擇(Thorgeirsson, S. S. and Grisham, J. ff. (2002) Nat. Genet. 31, 339-346 ；Parkin, D. M. et al. (2005) CA Cancer J. Clin. 55, 74-108)。肝細胞癌因此是一類預後極差的癌症。患者預後取決於癌症確診時的分期。肝細胞癌患者未進行手術的5年生存率〈5%，而術後5年生存率為60%-70%。當腫瘤大小<2cm時行手術切除，5年生存率可達到86%。但是早期肝癌患者(腫瘤大小<5cm)未行任何治療者的3年生存率僅17%-21%。這表明癌症早發現對於治療和患者生存很重要。(Tang，Z.Y. (2001)World J Gastroenterol 7, 445-454;Chambers, A.F.et al. (2002)Nat RevCancer 2, 563-572;Mola-Kuba D. et al. (2006)Annals of Hepatology 5,16-24).儘管近年來肝細胞腫瘤的早發現和手術切除顯著提高了患者存活率，但是大多數腫瘤並不能在其發生期即非致命階段發現。然而，目前僅大約10%-20%的肝細胞癌患者符合外科手術條件，所述肝細胞癌的手術條件是通過可利用的臨床分期系統根據相對正常的肝功能和可處理的腫瘤損害等參數而確定。此外，進行切除術的患者通常具有高頻率的轉移/復發，術後5年存活率僅為30%-40%。肝癌的確診通常依靠組織學證據。組織採樣通過穿刺針吸出或活檢。然而一些肝癌分化良好，也就是說它們是由幾乎完全發育的成熟的肝細胞組成，因此這些肝癌組織在顯微鏡下酷似非癌肝組織。而且並不是所有的病理醫師都被訓練得可以辨別分化良好的肝癌和正常肝組織之間的細微區別。還有一些病理醫師會將肝細胞癌誤診為肝腺癌。腺癌是肝癌的另外一種類型，它一般起源於肝外。更重要的是，轉移性腺癌其治療與原發性肝癌截然不同。因此早期診斷這些在患者身上表現為一種類型的肝細胞癌的腫瘤對於區分不同類型的腫瘤並且指導不同的治療方案是可取的，因而可顯著改善遠期存活率。肝組織穿刺或活檢最常見的危險是出血，尤其因為肝癌是富含脈管的腫瘤(容納許多血管)。有許多病例可能沒有必要通過穿刺或活檢進行組織學診斷。如果一個患者有發生肝癌的危險因素(例如肝硬化、慢性B型肝炎或慢性C型肝炎)並且血液中α-胎甲球蛋白(AFP)顯著提高，醫生幾乎可以不通過活檢就能確定這個患者發生了肝癌。目前，僅有一種血清標記(a-甲胎蛋白，AFP)通常用於早期檢測肝細胞癌(MizejeWSki，G.J. (2003)Expert Rev. Anticancer Ther. 2, 709-735 ；Paul, S. B. et al. (2007)Oncology72，Suppl. I, 117-123)。然而這個單一標記具有低特異性，且通常由於假陽性結果而是不合適的。血清AFP檢驗僅在60%的患者中可易於檢測出肝細胞腫瘤。另一方面，在大量的肝硬化患者中，在不存在癌症狀態時AFP也可升高。因此，我們仍然需要確定一些可供選擇的分子標記並且開發一些敏感的血液學檢測來早期發現和鑑別診斷肝細胞癌。解決這個問題的一種途徑可以基於一些小的調節性RNA分子，特別是基於微RNA(miRNA)，它們是一類進化保守的內源表達的小的非編碼RNA，大小為20-25個核苷酸(nt)，可以介導靶mRNA的表達。自從它們在大約10年前被發現就被認為在細胞發育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。(Bartel, D. P. (2004) Cell 116, 281-297, Ambros, V. (2004)Nature 431, 350-355; He, L. et al. (2004) Nat Rev Genet 5,522-531)。而且 miRNA 在作為癌症生物標記上比mRNA有優勢，因為它們在體外很穩定而且在體內壽命長。(Lu，J. etal. , (2005)Nature 435, 834-838;Lim, L. P. et al. , (2005)Nature 433, 769-773).miRNA是從初級轉錄物產生的,初級轉錄物被RNase III Drosha加工為莖-環結構前體(pre-miRNA)。在轉運到細胞質後,另一種稱為Dicer的RNase III切割pre_miRNA髮夾的環以形成短雙鏈(ds)RNA，其中一條鏈作為成熟miRNA摻入miRNA-蛋白質(miRNP)1中。miRNA指導miRNP到達它們的靶mRNA，在此它們發揮功能(Bartel, D. P. (2004)Cell23, 281-292 ； He, L. and Hannon, G. J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5, 522-531)。根據miRNA與其祀之間的互補性程度,miRNA可以指導不同的調節過程。與miRNA高度互補的靶mRNA通過與RNA幹擾(RNAi)相同的機制被特異切割。因此，在這種情況中，miRNA的功能是作為短幹擾RNA(siRNA)。與miRNA互補性較低的靶mRNA要麼被指引進入細胞降解途徑要麼被翻譯性阻遏而不影響mRNA水平。但是，miRNA如何阻遏它們的靶mRNA的翻譯的機制尚有爭論。高通量的miRNA定量技術，例如miRNA生物晶片技術，實時的基於RT-PCR的TaqMan miRNA分析，為全球整個癌症基因組miRNA輪廓研究提供了強大的的工具。可獲得的現有數據表明miRNA表達的調節異常(dysregulation)可能與某些類型癌症的發生和/或發展相關。例如，已表明兩種miRNA，miR-15及miR-16-l定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遺傳基因座上，並且發現在大約70%的CLL患者中，兩種miRNA基因被缺失或下調。另外，在結腸直腸瘤形成中觀察到miR-143及miR-145的下調，而miRNA let_7的表達在肺癌中經常降低(Michael, Μ. Z. et al. (2003)Mol. Cancer Res. I, 882-891 ；Mayr, C. etal. (2007) Science 315,1576-1579)。事實上，基於miRNA表達中的癌症相關改變和miRNA通常位於參與癌症的基因組區域的觀察推測miRNA可能既作為腫瘤阻抑基因也作為癌基因(Esquela-Kerscher, A. and Slack, F. J (2006)Nat. Rev. Cancer 6, 259-269 ；Calin, G.A. and Croce, C. M. (2007) J. Clin. Invest. 117, 2059-2066 ；Blenkiron, C. and Miska, E.A. (2007) Hum. Mol. Genet. 16，R106-R113)。提示這些人類癌症組織中異常表達的miRNA突出了它們作為診斷和預後的生物標記的潛能。一些研究報導了人肝細胞癌中的miRNA的表達譜(Murakami, Y. et al. (2006)Oncogene 25,2537-2545;Li, ff. et al. (2008)Int J Cancer 123,1616-1622;Huang, Y.S. et al. (2008)Hepatology 23，87-94;Ladeiro, Y. et al. (2008)Hepatology47, 1955-1963; Jiang, J. et al. (2008) Cl in Cancer Res 14，419-427)。此外，這些研究已經顯示出，與非惡性的肝細胞或組織相比，在惡性的細胞或組織中，特定的miRNA異常表達。因此，此類miRNA可以提供對涉及到惡性轉變和進展中的細胞過程的了解。在許多可能的樣本類型中，血液被認為是最理想的來監測高危的個體，導向早發現、早診斷、監控、和有效地治療癌症，因為血樣易於用微創的方法採集。已被證實腫瘤衍生的miRNA以相當穩定的形式存在於人血漿或血清中，因為它們被保護而不受內源性RNA酶活性影響。這些存在於血清或血漿中的衍生於腫瘤的miRNA的水平足夠作為癌症檢測的生物標記。而且血漿或血清中的miRNA有強的相關性，表明不管是血漿還是血清樣本都適於臨床應用miRNA作為癌症診斷的生物標記。(Mitchell, P. S. et al. (2008)Proc NatlAcad Sci USA 105，10513 - 10518;Gilad, S. et al. (2008)PLoS ONE 3，e3148;Chen, X. etal. (2008) Cell Res 18，997_1006)。至今，還沒有基於血樣的miRNA生物標記在肝細胞癌患者的血漿或血清中確定。因此，急需基於血液的診斷標記，特別是「表達特徵(expression signature)」或「分子足跡(molecular footprint) 」形式的診斷標記，以使得可以快速、可靠和節約成本地診斷肝細胞癌。而且仍然需要一致的方法來在高危個體中篩選早期肝細胞癌(earlystage-HCC)，鑑別診斷HCC，早發現肝癌復發，和/或監測肝癌治療。發明目的和概述
本發明的目的是提供用於診斷肝細胞癌、監測癌治療、和/或治療癌的新方法，其中通過測定血中的多種核酸分子，每種核酸分子均編碼微RNA(miRNA)序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在肝細胞癌的血漿中經分析與健康對照相比和/或與健康個體、結直腸癌和肺癌相比差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特徵，該核酸表達特徵指示肝細胞癌的存在，其中所述核酸表達特徵包括腫瘤相關特徵(tumor-related signature)和血眾特異性特徵(plasma-specific signature)。此外，本發明的目的是提供用於在展現肝細胞癌的血液中鑑別一或多種核酸表達特徵的相應方法。更具體地，本發明的目的是提供用於與健康對照、和/或健康個體、結直腸癌和肺癌相比較來區分肝細胞癌的方法。這些及其它目的從以下描述將變得清楚，其通過獨立權利要求的主題來達成。本發明的一些優選實施方案則通過從屬權利要求的主題來限定。在第一方面，本發明涉及用於鑑別一或多種展現出肝細胞癌的目標血漿的血液中分子標記物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種對照血漿中差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子源於腫瘤相關或血漿特異性特徵，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特徵，所述核酸表達特徵指示肝細胞癌的存在。本文限定的核酸表達特徵可包括至少三十二種核酸分子，優選至少十二種核酸分子，特別優選至少六種核酸分子。在優選的實施方案中，所述核酸表達特徵包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康對照相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康對照相比被下調。在優選的實施方案中，所述核酸表達特徵包含編碼腫瘤相關特徵hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、 hsa-miR-192、 hsa-miR-21、 hsa-miR-139_3p、 hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa_miR-181d、hsa-miR-125b_2*、a-miR-125a_3p ;血眾特異性特徵hsa-miR-34aλ hsa-miR-Ι36λ hsa-miR-Ι51~5ρλhsa-miR-lQSb5^λ hsa-miR-Ι24λhsa-miR-936λhsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-513c、hsa-miR-525_5p、hsa-miR-654_5p、hsa_miR-518c*、hsa-miR-500、hsa_miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629* 和內部穩定的對照 hsa-miR-1238 和hsa-miR-1228的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與一或多種健康對照相比，在所述一或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR_34a、hsa_miR-136、hsa-miR-151_5p的任意一種或多種核酸分子的表達被上調；編碼 hsa-miR-139_3p、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa_miR-181d、hsa-miR-125b_2*、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-936、hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769_3p、hsa_miR-513c、hsa-miR-525_5p、hsa-miR-654_5p、hsa_miR-518c*、hsa-miR-500、hsa_miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629* 的任意一種或多種核酸分子表達被下調；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228沒有變化。在更優選的實施方案中，核酸表達特徵包括編碼腫瘤相關特徵hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa_miR-2I、hsa-miR-139-3p、hsa_miR-10a、hsa-miR-103和編碼血眾特異性特徵 hsa_miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151_5p、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與一種或多種健康對照相比，在一種或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR_34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151_5p的任意一或多種核酸分子表達被上調；而編碼hsa-miR-139_3p、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124的任意一種或多種核酸分子表達被下調。
在另一優選的實施方案中，核酸表達特徵包含編碼腫瘤相關特徵hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-139_3p 和血眾特異性特徵hsa-miR-34a的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與一種或多種健康對照相比，在一種或多種目標血漿中 編碼hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa_miR-34a 的任意一種或多種核酸分子的表達被上調，而編碼hsa-miR-139_3p的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。在特別優選的實施方案中，核酸表達特徵包括編碼hsa-miR-34a/hsa-miR_193b*、hsa-miR-21/hsa_miR-936、hsa-miR-192/hsa_miR-124、hsa-miR-122/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-138、hsa-miR-34a/hsa_miR-198、hsa-miR-122/hsa_miR-124、hsa-miR-103/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-192/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa—miR-138、hsa-miR-34a/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-122/hsa_miR-198、hsa-miR-122/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-103/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-124、hsa-miR-192/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-34a/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-192/hsa_miR-936、hsa-miR-10a/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa_miR-601、hsa-miR-21/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-199b-3p/hsa_miR-193b*、hsa-miR-103/hsa_miR-138、hsa-miR-103/hsa-miR-198、 hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-139_3p、 hsa-miR-21/hsa-miR-139_3p 和hsa-miR-21/hsa-miR_193b*的任意一種或多種核酸分子的組合。在第二方面，本發明涉及用於將肝細胞癌與健康個體、結直腸癌和肺癌的區別開的診斷試劑盒。所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種健康個體、結直腸癌和肺癌中差異表達，而其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特徵，所述核酸表達特徵指示肝細胞癌的存在。本文限定的核酸表達特徵可包括至少十六種核酸分子，優選至少六種核酸分子。在優選的實施方案中，所述核酸表達特徵包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種健康個體、結直腸癌和肺癌相比被上調；以及包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子,其表達在一或多種目標血眾中與一或多種健康個體、結直腸癌和肺癌相比被下調。在優選實施方案中，核酸表達特徵包含編碼腫瘤相關特徵hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa_let_7c、hsa-miR-103、hsa-miR-139_3p、hsa_miR-26b;血眾特異性特徵 hsa-miR-936、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa_miR-34a、hsa-miR-198、hsa-let-7g、hsa_miR-363 和內部穩定對照has_miR-1228 和 hsa-miR-1238 的任意一種或多種核酸分子。
特別優選地，與健康個體、結直腸癌和肺癌相比，一或多種目標血漿中編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa_let_7c、hsa-miR-103、hsa_miR-26b、hsa-miR_34a、hsa_let_7g、hsa-miR-363的任意一種或多種核酸分子表達被上調，而編碼hsa-miR-936、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-198 的任意一種或多種核酸分子表達被下調；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228沒有變化。在更優選的實施方案中，核酸表達特徵包括編碼腫瘤相關特徵hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215 和血眾特異性特徵 hsa-miR-936、hsa_miR-193b* 和hsa-miR-124的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與健康個體、結直腸癌和肺癌相比，一種或多種目標血漿中編碼hsa-miR-122、hsa-miR-192和hsa-miR-215的任意一種或多種核酸分子表達被上調；而編碼hsa-miR-936、hsa_miR-193b*和hsaniR-124的任意一種或多種核酸分子表達被下調。在特別優選的方案中，核酸表達特徵包括編碼hsa-miR-122/hsa-miR-936, hsa-miR-34a/hsa_miR-193b*，hsa-miR-34a/hsa_miR-198，hsa-miR-192/hsa-miR-936,hsa-miR-122/hsa_miR-193b*，hsa-miR-122/hsa-miR-198, hsa-miR-192/hsa_miR-124，hsa-miR-192/hsa_miR-193b*，hsa-miR-122/hsa-miR-124, hsa-miR-192/hsa_miR-198，hsa-miR-363/hsa_miR-936，hsa-miR-215/hsa-miR-193b*，hsa-miR-103/hsa_miR-936，hsa-miR-122/hsa-miR-139-3phsa-let_7c/hsa-miR-936, hsa-miR-215/hsa_miR-198，hsa-miR-192/hsa-miR-139_3p，hsa_miR-27b/hsa-miR-198, hsa-miR-26b/hsa_miR-936，hsa-let-7g/hsa-miR-936, hsa-miR-103/hsa-miR-198, hsa-let-7c/hsa_miR-193b*，hsa-miR-103/hsa_miR-193b*，hsa_miR-26b/hsa-miR-139_3p，hsa-let-7c/hsa_miR-198，hsa-miR-27b/hsa_miR-193b*，hsa_let_7g/hsa_miR-193b*，hsa-miR-363/hsa-miR-139_3p，hsa-let-7g/hsa_miR-198，hsa-miR-363/hsa-miR-198, hsa-miR-26b/hsa_miR-198，hsa-miR-103/hsa-miR-139_3p，hsa_miR-301a/hsa-miR-198, hsa-miR-26b/hsa_miR-193b*，hsa-let-7g/hsa-miR-139_3p，hsa-miR-363/hsa-miR-124, hsa-let-7c/hsa-miR-139_3p，hsa_miR-301a/hsa_miR-193b*，hsa-miR-301a/hsa-miR-139_3p，hsa-miR-26b/hsa_miR-124，hsa-let_7d/hsa-miR-198, hsa-let-7d/hsa-miR-139_3p，hsa-miR-103/hsa-miR-124, hsa-miR-363/hsa_miR-193b* 和 hsa-let-7d/hsa_miR-193b* 的任意一種或多種核酸組合。第三方面，本發明涉及用於鑑別一或多種展現出肝細胞癌的血漿的方法，所述方法包括(a)在所述一或多種目標 血漿中確定多種核酸分子的表達水平，每種核酸分子編碼微RNA序列；(b)在一或多種健康對照血漿中確定所述多種核酸分子的表達水平；(c)通過對比在步驟(a)和(b)中獲得的各自的表達水平，從所述多種核酸分子中鑑別出在所述目標血漿和對照血漿中差異表達的一或多種核酸分子，其中所述差異表達的一或多種核酸分子一起代表本文所定義的特徵(signature),其指示肝細胞癌的存在。在本發明的優選實施方案中，所述方法包括(a)在一或多種目標血漿中確定核酸分子組合的表達水平，每種核酸分子均編碼微RNA序列，並用特定的公式計算；(b)在一或多種健康對照血漿中確定所述核酸分子組合的表達水平，並用特定的公式計算；以及 (C)通過比較在(a)和(b)步驟中所獲得的各自的表達水平來鑑別所述組合在所述一或多種目標血漿中的差異，其中一或多種差異表達的組合一切代表特徵，其指示肝細胞癌的存在。在更優選的實施方案中，本方法進一步用於將肝細胞癌與健康個體、結直腸癌和肺癌區別開。第四方面，本發明涉及用於監測肝細胞癌治療的方法，所述方法包括(a)通過使用本文所定義的方法在一或多種目標血漿中鑑別核酸表達特徵；和(b)在血液中監測所述核酸表達特徵所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述監測以如下的方式進行，即其血漿中的表達在治療前被上調的核酸分子的表達在治療後被下調，而其血漿中的表達在治療如被下調的核Ife分子的表達在治療後被上調。第五方面，本發明涉及用於預防或治療肝細胞癌的方法，所述方法包括(a)用本文限定的方法在血漿中鑑別核酸表達特徵；和(b)在血液中改變所述核酸表達特徵所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述改變以如下的方式進行，即其表達在血液中被上調的核酸分子的表達被下調，而其表達在血液中被下調的核酸分子的表達被上調。第六方面，本發明涉及用於預防和/或治療血液中的肝細胞癌的藥物組合物，所述組合物包含一或多種核酸分子，每種核酸分子均編碼序列，所述序列與如本文所定義的在來自肝細胞癌患者的血漿中其表達被上調的核酸分子所編碼的微RNA序列至少部分互補，和/或所述序列對應於如本文所定義的在來自肝細胞癌患者的血漿中其表達被下調的核酸分子所編碼的微RNA序列。最後，第七方面，本發明涉及所述藥物組合物在製備用於預防和/或治療肝細胞癌的藥物中的用途。本發明的其它實施方案從以下詳細描述中將變得明了。附圖
簡述圖I :示出流程圖，其系統地闡明了參照本發明的方法來確定表達特徵的基本方法步驟，用於鑑別一或多種展現出肝細胞癌的目標血漿。圖2 :示出包含在本發明的特別優選的表達特徵中的人類miRNA，所述表達特徵分別用於鑑別展現肝細胞癌的一或多種目標血漿。圖中還示出與健康對照相比，在肝細胞癌血漿中這些miRNA的表達水平和準確性(即上調或下調)。在前五個六種不同miRNA的組合來作為診斷性生物標記鑑別肝細胞癌和健康對照中的準確性在87%-94%圖3 :示一例肝細胞癌和健康對照血漿中的兩個腫瘤相關miRNA (hsa-miR-122和has-miR-139-3p)的ROC曲線分析(O :健康對照組；1 :肝細胞癌組)。結果顯示這些miRNA作為診斷性生物標記的敏感性和特異性。這些經過微陣列(生物晶片)分析獲得的數據經過內部穩定對照miR-1238規範化。圖4 :示出在另一方面包含在本發明的特別優選的表達特徵中的人類miRNA，參照本發明的遠期應用鑑別肝細胞癌和健康個體、結直腸癌和肺癌。還顯示與健康個體、結直腸癌和肺癌相比肝細胞癌患者中的miRNA的表達水平和準確性(即上調或下調)。在前五個miRNA的組合來作為診斷性生物標記鑑別肝細胞癌的準確性在85%-88%圖5 :示由五種不同的miRNA組成的四中組合的比較平臺。由微陣列獲得的數據變化與由實時定量PCR(quantitative RT-PCR)獲得的數據之間數量上的相關性(R)為O. 76。這些結果顯不，由Agilent miRNA微陣列(Agilent miRNA microarray)獲得的miRNA特徵·是聞度可彳目的。發明詳沭本發明基於如下出乎意料的發現，即肝細胞癌(HCC)能可靠地通過血漿中特定miRNA表達特徵以高準確性和靈敏性來鑑定，其中所述表達特徵如本文定義典型地包括被上調和下調的人類miRNA。更特別地,所述miRNA表達特徵一通過分析血眾中整體miRNA表達模式和/或各個miRNA表達水平一使得能檢測早期疾病狀態下的HCC以及鑑別健康個體、結直腸癌和肺癌。以下例證的本發明可以合適地在不存在未在本文中具體揭示的任何一或多個元件、一或多種限制的條件下實施。本發明將根據特定的實施方案並參照附圖加以描述，但是本發明不受其限制，僅受權利要求書限制。所描述的附圖僅是示意性的，被認為是非限制性的。當術語「包含」被用於本發明說明書和權利要求書中時，其不排除其它元件或步驟。為本發明目的，術語「由…組成」被認為是術語「包含」的優選實施方案。如果在下文中組被限定為包含至少一定數目的實施方案，這也被理解為揭示了優選地僅由這些實施方案組成的組。當指代單數形式名詞使用不定冠詞或定冠詞例如「一個」或「一種」，「所述」時，包括該名詞的複數形式，除非特別指出。術語「大約」在本發明中是指本領域技術人員理解仍能保證目的特徵的技術效果的準確性區間。該術語通常表示偏離指示值的±10%，優選±5%。另外，術語第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在說明書和權利要求書中用於區分類似的元件，不是描述順序或時間次序必須的。應理解如此應用的術語在合適情況下可互換，並且本發明描述的實施方案能以不同於本文所述或例證的其它順序操作。術語的進一步定義在以下使用術語時給出。以下術語或定義僅為了理解本發明而提供。這些定義不應被認為具有小於本領域技術人員理解的範圍。本發明的一個目的是提供用於診斷肝細胞癌、監測癌治療、和/或治療癌的新方法，其中通過測定血中的多種核酸分子，每種核酸分子均編碼微RNA (miRNA)序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在肝細胞癌的血漿中經分析與健康對照相比和/或與健康個體、結直腸癌和肺癌相比差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特徵，該核酸表達特徵指示肝細胞癌的存在，其中所述核酸表達特徵包括腫瘤相關特徵和血漿特異性特徵。本文所用術語「癌症」(也稱為「癌(carcinoma) 」)通常指任何類型的惡性贅生物，即與未受影響的(健康)野生型對照細胞相比顯示或具有發生癌特徵傾向的靶細胞的任何形態學和/或生理學改變(基於遺傳重編程(genetic re-programming)) 這種改變的例子可涉及細胞大小和形狀(變大或變小)、細胞增殖(細胞數增加)、細胞分化(生理學狀態變化)、凋亡(程序性細胞死亡)或細胞存活。本文所用術語「肝細胞」涉及肝臟。因此，術語「肝細胞癌」是指在肝細胞的癌性生長。

最常見類型的肝細胞癌是肝細胞癌(也稱作肝癌，通常縮寫為HCC)。本文所用術語「肝細胞癌」是指原發的肝臟惡性腫瘤。大多數HCC繼發於病毒性肝炎感染(B型肝炎或C型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是導致肝硬化的最常見因素)。在肝炎不是地方病的國家中，大多數肝臟惡性癌症不是原發HCC，而是從機體其它部位例如結腸的癌症轉移(傳播)。HCC的治療選擇和預後依賴於許多因素，但是特別依賴於腫瘤大小和分期。腫瘤等級(tumor grade)也是重要的。高等級(high-grade)腫瘤預後不佳,而低等級(low-grade)腫瘤也許可被忽視很多年。通常結果不佳是因為僅10%-20%的肝細胞癌通過手術可完全切除。如果癌症不能被完全切除，則該疾病通常在3-6個月內是致命的。肝細胞癌與任何其它癌症一樣，當存在引起細胞高速複製和/或導致細胞避免凋亡的分子機制突變時而發生。特別地，B型肝炎和/或C型肝炎的慢性病毒感染通過重複導致機體自身免疫系統攻擊肝細胞(其中一些被病毒感染，其它的僅是旁觀者)而可助於肝細胞癌的發生。雖然這種損傷之後修復的恆定循環可導致修復期間的錯誤，隨之導致癌發生，但是目前這種假說更適用於C型肝炎。然而，在B型肝炎中，病毒基因組整合進感染的細胞中是惡性腫瘤中最一致相關的因素。另外，重複大量飲酒可具有相似作用。因此，在本發明範圍中，B型肝炎和/或C型肝炎感染或者肝硬化不僅被認為是腫瘤病因學的危險因素，而且還是腫瘤發展的早期/中間期(即「癌前狀態」)，其與導致(通常為良性)非侵襲性贅生物的過度增殖性組織生長(隨之可發展為惡性腫瘤如HCC)相關。這種惡性腫瘤侵襲其它組織並在時間足夠時經常發生轉移。惡性細胞通常特徵在於進展性(progressive)和不受控制的生長。肉眼觀察HCC看起來是結節性或侵潤性腫瘤。結節型腫瘤可以是單發性(具有大團)或多發性(當發展為硬化併發症時)。腫瘤結節為圓形至橢圓形，邊界清楚但無包膜。瀰漫型邊界不清，且侵潤門靜脈，很少侵潤肝靜脈。本發明中採用的哺乳動物目標血漿可以是人或非人類來源的。然而，本發明典型地用人類血漿進行。本文所用術語「一或多種血漿」應被理解為不僅包括個體血漿。本文所用術語「目標血漿」是指被至少認定是顯示或具有發生肝細胞癌傾向的血漿，而術語「對照血漿」典型地是指不具有這種癌表型特徵的(健康)型。但是在一些應用中，例如當比較顯示不同癌或癌前狀態的血漿時，具有不太嚴重的疾病特徵的細胞典型地被認為是「對照血漿」。本文所用術語「血漿」是血液中的黃色液體組分，全血中的血細胞在其中可以正常懸浮。其體積約佔全血體積的55%。血漿中大部分成分是水(體積佔90%)，包含可溶性蛋白、葡萄糖、凝血因子、礦物質離子、激素和二氧化碳(血漿是排洩物運輸的主要介質)。血漿準備是通過將新鮮血液在離心機裡離心，直到血細胞沉到管底。然後將血漿傾出。血漿的密度大概在1025kg/m3，or I. 025kg/L。近期的研究發現miRNA在血漿中是穩定的。術語「血漿樣本」是指從個體或健康對照獲取的待檢的血漿。本文所用術語「患者」，是指至少應該被認為是患有肝細胞癌的人；本文所用術語「目標血漿」是指從患者獲取的血漿；術語「健康個體」或「健康對照」特指不具有任一癌症表現的健康個體。並且這裡「對照血漿」是指從這些健康個體獲取的血漿。但是，在一些應用裡，例如，當比較不同的癌症類型時，這些個人有其他的癌症類型，這些從這些個體中獲取的血漿也被特指為「對照」。典型地，所用的目標血漿和對照血漿衍生自從待被診斷是否存在肝細胞癌或發生·肝細胞癌傾向的對象中收集的生物學樣品。另外，為了確證獲得的數據，「比較樣品」也可以從患有給定已知疾病狀態的對象中收集。生物學樣品可包括機體組織和液體，如組織、血清、血細胞、痰和尿。另外，如果需要，細胞可以從獲得的機體組織和液體中純化，然後用作生物學樣品。根據本發明，本發明的核酸標記的表達水平在對象衍生的生物學樣品中確定在本發明的體外方法中用於檢測的樣品通常應以臨床可接受的方式收集，優選以保護核酸(特別是RNA)或蛋白質的方式收集。待分析的樣品典型地是血液。另外，肝組織及其它類型樣品也可以使用。樣品特別在最初加工之後可以合併。但是也可以使用未合併的樣品。本文所用術語「微RNA」(或「miRNA」)是其在本領域的普通含義(Bartel，D.P. (2004) Cell 23，281-292 ；He, L. and Hannon, G. J. (2004)Nat. Rev. Genet. 5，522-531)。因此，「微RNA」是指衍生自基因組基因座的RNA分子，其從可以形成局部RNA前體miRNA結構的轉錄物加工而來。成熟miRNA通常長度為20、21、22、23、24或25個核苷酸，其它數目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27個核苷酸。miRNA編碼序列具有與側翼基因組序列配對的潛力，使成熟miRNA放置在非完全配對的RNA雙鏈體之內(本文也稱作莖-環或髮夾結構或pre-miRNA)，所述雙鏈體作為從更長的前體轉錄物進行miRNA加工的中間體。這一加工典型地通過分別稱為Drosha和Dicer的兩種特異的內切核酸酶的連續作用而發生。Drosha從初級轉錄物(本文也稱作「pri-miRNA」)產生典型地摺疊成髮夾或莖-環結構的miRNA前體(本文也稱作「pre-miRNA」)。從這個miRNA前體，通過Dicer切割miRNA雙鏈體，其在髮夾或莖-環結構的一條臂包含成熟miRNA，在另一條臂包含類似大小的節段(通常稱為miRNA*)。miRNA然後被導向其靶mRNA以發揮其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自與預測的蛋白質編碼區不同的基因組節段。本文所用術語「miRNA前體」(或「前體miRNA」或「pre-miRNA」 )是指從其加工成熟miRNA的miRNA初級轉錄物的部分。典型地,pre-miRNA摺疊成穩定的髮夾(即雙鏈體)或莖-環結構。髮夾結構典型地長度為50-80個核苷酸，優選60-70個核苷酸(計數miRNA殘基，與miRNA配對的殘基，及任何間插節段，但排除更遠端的序列)。
本文所用術語「編碼微RNA序列的核酸分子」是指編碼微RNA (miRNA)的任何核酸分子。因此，該術語不僅指成熟miRNA,也指相應的如上所述的前體miRNA及初級miRNA轉錄物。另外，本發明不限於RNA分子，也包括相應的編碼微RNA的DNA分子，例如通過逆轉錄miRNA序列產生的DNA分子。編碼本發明的微RNA序列的核酸分子典型地編碼單個miRNA序列(即個體miRNA)。但是，也可能這種核酸分子編碼兩個或多個miRNA序列(即兩個或多個miRNA)，例如一個轉錄單位包含在常用調節序列如啟動子或轉錄終止子控制下的兩個或多個miRNA序列。本文所用術語「編碼微RNA序列的核酸分子」也被理解為包括「有義核酸分子」(即核酸序列(5' —3')匹配或相應於所編碼的miRNA (5, —3')序列的分子)及「反義核酸分子」(即核酸序列互補於所編碼的miRNA (5, —3')序列或者換句話說匹配所編碼的miRNA序列的反向互補序列(3' —5,)的分子)。本文所用術語「互補」是指「反義」核酸分子序列與相應的「有義」核酸分子序列(具有互補於反義序列的序列)形成鹼基對、優選Watson-Crick鹼基對的能力。 在本發明範圍內，兩個核酸分子(即「有義」和「反義」分子)可以完全互補，即它們不含有任何鹼基錯配和/或額外的或缺失的核苷酸。或者，兩個分子包含一或多個鹼基錯配或者在它們的核苷酸總數上不同(由於添加或缺失導致)。優選地，「互補」核酸分子包含與包含在相應的「有義」核酸分子中的序列顯示完全互補性的至少10個連續核苷酸。因此，包含在本發明的診斷試劑盒中的編碼miRNA序列的多種核酸分子可包括一或多種「有義核酸分子」和/或一或多種「反義核酸分子」。有時，診斷試劑盒包括一或多種「有義核酸分子」(即miRNA序列本身)，所述分子被認為組成了差異表達的miRNA(即分子標記)的全體或至少亞集合，所述差異表達的miRNA是存在或發生特定病症傾向的指徵，本文是肝細胞癌。另一方面，當診斷試劑盒包括一或多種「反義核酸分子」(即與miRNA序列互補的序列)時，所述分子可包含適合用於檢測和/或定量給定樣品中的一或多種特定(互補)miRNA序列的探針分子(用於進行雜交測定)和/或寡核苷酸引物(例如用於逆轉錄或PCR應用)。在本發明中定義的多種核酸分子可以包含至少2種、至少10種、至少50種、至少100種、至少200種、至少500種、至少1000種、至少10000種或至少100000種核酸分子，每種分子編碼miRNA序列。本文所用術語「差異表達」是指特定miRNA在目標血漿中的表達水平相比於健康對照血漿是改變的，其可以是上調(即在目標血漿中miRNA濃度增加)或下調(即在目標血漿中miRNA濃度降低或消失)。換句話說，核酸分子在目標血漿中被激活至比在對照血漿中更高或更低的水平。本發明範圍內，核酸分子被認為是差異表達的，如果該核酸分子在靶細胞和對照細胞中的相應表達水平典型地相差至少5%或至少10%，優選地至少20%或至少25%，最優選地至少30%或至少50%。因此，後者的值相應於給定核酸分子在靶細胞中的表達水平相比於野生型對照細胞分別上調至少I. 3倍或至少I. 5倍，或者反之在靶細胞中的表達水平下調至少O. 7倍或至少O. 5倍。本文所用術語「表達水平」是指特定的miRNA序列從其基因組基因座被轉錄的程度，即miRNA在一或多種被分析血漿中的濃度。
如上所述，術語「對照血漿」典型地是指不具有HCC表型特徵的(健康)血漿。但是，在一些應用中，例如當比較顯示不同的癌或癌前狀態的血漿時，具有較不嚴重疾病特徵的血漿典型地被認為是「對照血漿」。表達水平的確定典型地遵循本領域熟知的已建立的標準程序(Sambrook，J.et al. (1989)Molecular Cloning:A Laborary Manual. 2nd Ed. , Cold Spring HarborLibrary Press, Cold Spring Harbor, NY ；AusubeI, F. M. et al. (2001)Current Pro-colsin Molecular Biology. Wiley & Sons, Hoboken, NJ)。確定可以在 RNA 水平進行，例如使用miRNA特異性探針進行Northern印跡分析,或者在逆轉錄(及克隆)RNA群後例如通過定量PCR或實時PCR技術在DNA水平進行。本文所用術語「確定」包括分析編碼上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由於pri-miRNA及re_mRNA半衰期短,典型地僅測量成熟miRNA的濃度。在具體的實施方案中，在給定樣品的若干獨立測量(例如兩個、三個、五個或十個測量)和/或在一群目標血漿或對照血漿內的若干測量中獲得的表達水平的標準值被用於分析。標準值可以用本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值±2SD(標準差)或平均值 ±3SD的範圍可被用作標準值。所獲得的疾病和對照血漿的表達水平之間的差異可以歸一化至進一步的對照核酸例如管家基因的表達水平，管家基因的表達水平已知不根據細胞的疾病狀態而不同。舉例的管家基因包括β_肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl等。在優選的實施方案中，對照核酸是已知在樣品中的不同非癌和癌(前)狀態中穩定表達的另一種miRNA。但是，代替在任何實驗中確定一或多種對照血漿的表達水平，也可以基於實驗證據和/或現有技術數據定義針對特定疾病表型(即疾病狀態)的一或多個截斷值。在這種情況中，一或多種目標血眾的相應表達水平可以用用於歸一化的穩定表達的對照miRNA確定。如果計算的「歸一化」的表達水平高於相應定義的截斷值，則這一發現是基因表達上調的指徵。反之，如果計算的「歸一化」的表達水平低於相應定義的截斷值，則這一發現是基因表達下調的指徵。在本發明中，術語「鑑定肝細胞癌和/或鑑別其他癌症類型」也包括預測和可能性分析(「診斷」意義上)。本文公開的組合物和方法意在臨床應用，以決定治療形式，包括治療性幹預，診斷標準如疾病階段，和疾病監測和疾病監視。根據本發明，可提供用於檢查對象狀態的中間結果。這種中間結果可與額外信息組合以幫助醫生、護士或其它從業人員診斷出該對象患有該疾病。或者，本發明可用於通過血樣標本檢測癌症傾向的改變，並提供有用信息給醫生以進行診斷。另外，本發明還用於區別不同類型的肝細胞腫瘤及其他癌症類型包括結直腸癌和肺癌。在本發明中，所鑑定的一或多種差異表達的核酸分子一起代表一種核酸表達特徵，該核酸表達特徵是在目標血漿中存在肝細胞癌的指徵。本文所用術語「表達特徵」是指一組核酸分子(例如miRNA),其中各個核酸分子的表達水平在(癌性)目標血眾和(非癌性)對照血漿之間不同。本文中，核酸表達特徵也指一組標記並代表最低數目的(不同)核酸分子，每種核酸分子編碼能鑑定目標血漿的表型狀態的miRNA序列。在第一方面，本發明涉及用於鑑別一或多種展現出肝細胞癌的目標血漿的血液中分子標記物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種對照血漿中差異表達，其中所述一或多種差異表達的核酸分子源於腫瘤相關或血漿特異性特徵，其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特徵，所述核酸表達特徵指示肝細胞癌的存在。本文限定的核酸表達特徵可包括至少三十二種核酸分子，優選至少十二種核酸分子，特別優選至少六種核酸分子。

在優選的實施方案中，所述核酸表達特徵包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與一或多種對照血漿相比被上調；以及包括至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達與一或多種對照相比被下調本文的術語「血漿特異性」(plasma-specific)是指在肝癌患者和正常對照的血漿有差異性表達的特徵，但在肝細胞癌組織細胞和非癌組織細胞之間沒有發現顯著的差異表達。典型地，包含在核酸表達特徵中的核酸分子是人類序列(以後稱為「has」(智人(Homo sapiens)))。在本發明的優選實施方案中，核酸表達特徵包括編碼腫瘤相關的hsa-miR-122(SEQ ID NO:I)，hsa-miR-199b_3p (SEQ ID NO:2), hsa-miR-192(SEQ IDN0:3), hsa-miR-21(SEQ ID NO:4)，hsa-miR-139_3p (SEQ ID NO:5)，hsa-miR-lOa (SEQ IDNO:6), hsa-miR-103(SEQ ID NO:7)，hsa_miR-181d(SEQ ID NO:8)，hsa-miR-125b_2*(SEQID N0:9),hsa-miR-125a-3p (SEQ ID NO: 10)的任意一種或多種核酸分子的表達；編碼血漿特異性的 hsa-miR-34a(SEQ ID NO: 11)，hsa-miR-136 (SEQ ID NO: 12)，hsa-miR-151_5p(SEQ ID NO: 13),hsa-miR-193b*(SEQ ID NO: 14),hsa-miR-124(SEQ IDNO:15)，hsa-miR-936(SEQ ID NO:16)，hsa-miR-198(SEQ ID NO:17)，hsa-miR-149* (SEQID N0:18)，hsa-miR-138(SEQ ID NO:19)，hsa-miR-601(SEQ ID NO:20)，hsa-miR-769_3p(SEQ ID NO:21)，hsa-miR-513c (SEQ ID NO :22)，hsa-miR-525_5p (SEQID NO :23),hsa-miR-654-5p (SEQ ID NO :24)，hsa_miR-5I 8c*(SEQ IDNO:25)，hsa-miR-500(SEQ ID NO:26)，hsa_miR-181c*(SEQ ID NO:27)，hsa-miR-1226*(SEQID NO:28)，hsa-miR-202(SEQ ID NO:29)，hsa-miR-629*(SEQ ID NO:30)任意一種或多種核酸分子的表達；編碼穩定內部穩定對照的hsa-miR-1238 (SEQ ID NO:36)和hsa-miR-1228 (SEQ ID NO :37)的核酸分子。上述miRNA的核酸序列列於表I。表權利要求
1.用於鑑別一或多種展現出肝細胞癌的目標血漿的血液中分子標記物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列， 其中所述多種核酸分子的一或多種在目標血漿中和在一或多種對照血漿中差異表達， 其中所述一或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特徵，所述核酸表達特徵指示肝細胞癌的存在。
2.權利要求I的試劑盒，其中所述核酸表達特徵可包含至少三十二種核酸分子，優選至少六種核酸分子。
3.權利要求I或2的試劑盒，其中所述核酸表達特徵包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血漿中與在一或多種對照血漿中相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一或多種目標血眾中與在一或多種對照血眾中相比被下調。
4.權利要求1-3任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特徵包含編碼腫瘤相關特徵 hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-lOa、hsa-miR-103、hsa_miR-181d、hsa-miR-125b_2*、a-miR-125a_3p ;血眾特異性特徵 hsa_miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151_5p、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-936、hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769_3p、hsa_miR-513c、 hsa-miR-525_5p、 hsa-miR-654_5p、 hsa-miR-SISc*、 hsa_miR-500、hsa_miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629* 和內部穩定的對照hsa-miR-1238和hsaniR-1228的任意一種或多種核酸分子。
5.權利要求4的試劑盒，其中與一或多種健康對照相比，在所述一或多種目標血眾中編碼 hsa-miR-122、hsa-miR-199b_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21 Λ hsa-miR-lOa、hsa-miR-103、hsa_miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151_5p 的任意一種或多種核酸分子的表達被上調；編碼 hsa-miR-139_3p、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa_miR-181d、hsa-miR-125b_2*、hsa-miR-125a_3p、hsa-miR-936Λ hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、 hsa-miR-601、 hsa-miR-769_3p、 hsa_miR-513c、 hsa-miR-525_5p、hsa-miR-654_5p、 hsa-miR-518c*、 hsa-miR-500、 hsa_miR-181c*、 hsa-miR-1226*、hsaniR-202、hsa-miR-629^的任意一種或多種核酸分子表達被下調；hsaniR-1238和hsa-miR-1228 沒有變化。
6.利要求1-3任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特徵包括編碼hsa-miR-34a/hsa_miR-193b*、hsa-miR-21/hsa-miR-936Λ hsa-miR-192/hsa_miR-124、hsa-miR-122/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-138、hsa-miR-34a/hsa_miR-198、hsa-miR-122/hsa-miR-124、hsa-miR-103/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-192/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa-miR-138、hsaiiR-34a/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-122/hsa-miR-198Λ hsa-miR-122/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-103/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-124、hsa-miR-192/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-34a/hsa-miR-769-3p、hsa-miR-192/hsa_miR-936、hsa-miR-10a/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa_miR-601、hsa-miR-21/hsa-miR-769_3p、hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-193b^λ hsa-miR-103/hsa_miR-138、hsa-miR-103/hsa-miR-198、hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-21/hsa-miR-139_3p 和hsa-miR-21/hsa_miR-193b*的任意一種或多種核酸組合。
7.權利要求1-6任一項的試劑盒，進一步用於將肝細胞癌與健康個體、結直腸癌和肺癌區別開。
8.權利要求7的試劑盒，其中所述核酸表達特徵可包括至少16種核酸分子，優選至少6種核酸分子。
9.權利要求1-8任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特徵包含任意一種或多種編碼腫瘤相關特徵 hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa_let_7c、hsa-miR-103、hsa-miR-139_3p、hsa_miR-26b;血眾特異性特徵 hsa-miR-936、hsa_miR-193b*、hsa-miR-124、hsa_miR-34a、hsa-miR-198、hsa_let_7g、hsa-miR-363 和內部穩定對照has-miR-1228 和 hsa-miR-1238 的核酸分子。
10.權利要求9的試劑盒，其中與一種或多種健康個體、結直腸癌和肺癌相比，在所述一或多種目標血眾中，編碼 hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa_let_7c、hsa-miR-103、hsa_miR-26b、hsa_miR-34a、hsa_let_7g、hsa-miR-363 的任意一種或多種核酸分子表達被上調；而編碼 hsa-miR-936、hsa-miR-igSb*、hsa_miR124、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-198的任意一種或多種核酸分子表達被下調；hsaniR-1238和hsaniR-1228沒有變化。
11.權利要求7-10任一項的試劑盒，其中所述核酸表達特徵包括編碼hsa-miR-122/hsa-miR-936、hsa-miR-34a/hsa_miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa_miR-198、hsa-miR-192/hsa-miR-936、hsa-miR-122/hsa_miR-193b*、hsa-miR-122/hsa_miR-198、hsa-miR-192/hsa-miR-124、hsa-miR-192/hsa_miR-193b*、hsa-miR-l22/hsa-miR-124Λ hsa-miR-192/hsa-miR-198、hsa-miR-363/hsa_miR-936、hsa-miR-215/hsa_miR-193b*、hsa-miR-103/hsa-miR-936、hsa-miR-122/hsa-miR-139_3p、hsa-let-7c/hsa_miR-936、hsa-miR-215/hsa-miR-198、hsa-miR-192/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-27b/hsa_miR-198、hsa_miR-26b/hsa-miR-936、hsa-let-7g/hsa-miR-936Λ hsa-miR-103/hsa_miR-198、hsa_let_7c/hsa-miR-193b*、 hsa-miR-103/hsa_miR-193b*、 hsa-miR-26b/hsa-miR-139_3p、hsa-let-7c/hsa_miR-198、hsa-miR-27b/hsa_miR-193b*、hsa-let-7g/hsa_miR-193b*、hsa-miR-363/hsa-miR-139_3p、hsa-let-7g/hsa_miR-198、hsa-miR-363/hsa_miR-198、hsa-miR-26b/hsa_miR-198、hsa-miR-103/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-30la/hsa-miR-198、hsa-miR-26b/hsa_miR-193b*、hsa-let-7g/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-363/hsa_miR-124、hsa-let-7c/hsa-miR-139_3p、 hsa-miR-301a/hsa_miR-193b*、 hsa-miR-30Ia/hsa-miR-139_3p、hsa-miR-26b/hsa_miR-124、hsa-let-7d/hsa_miR-198、hsa-let_7d/hsa-miR-139_3p、 hsa-miR-103/hsa_miR-124、 hsa-miR-363/hsa-miR-l93b^ 和hsa-let-7d/hsa_miR-193b*的任意一種或多種核酸組合。
12.用於鑑別展現出肝細胞癌的一或多種目標血漿的方法，所述方法包括 (a)在所述一或多種目標血漿中確定多種核酸分子的表達水平，每種核酸分子編碼微RNA序列； (b)在一或多種健康對照血漿中確定所述多種核酸分子的表達水平；及 (c)通過對比在步驟(a)和(b)中獲得的各自的表達水平，從所述多種核酸分子中鑑別出在所述目標血漿和對照血漿中差異表達的一或多種核酸分子，其中所述差異表達的一或多種核酸分子一起代表如權利要求ι-ii任一項所定義的核酸表達特徵，所述核酸表達特徵指示肝細胞癌的存在。
13.權利要求12的方法，其進一步用於將肝細胞癌與健康個體、結直腸癌和肺癌區別開。
14.用於監測肝細胞癌治療的方法，所述方法包括 (a)通過使用本文所定義的方法在一或多種目標血漿中鑑別核酸表達特徵'及 (b)在血液中監測所述核酸表達特徵所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述監測以如下的方式進行，即其血漿中的表達在治療前被上調的核酸分子的表達在治療後被下調，而其血漿中的表達在治療前被下調的核酸分子的表達在治療後被上調。
15.用於預防或治療肝細胞癌的方法，所述方法包括 (a)通過使用權利要求12或13的方法在血液中鑑別核酸表達特徵'及 (b)在血液中改變所述核酸表達特徵所包含的編碼微RNA序列的一或多種核酸分子的表達，所述改變以如下的方式進行，即其表達在血液中被上調的核酸分子的表達被下調，而其表達在血液中被下調的核酸分子的表達被上調。
16.用於預防和/或治療血液中肝細胞癌的藥物組合物，所述組合物包含一或多種核酸分子，每種核酸分子均編碼序列， 所述序列與如本文所定義的在來自肝細胞癌患者的血漿中其表達被上調的核酸分子所編碼的微RNA序列至少部分互補，和/或所述序列對應於如權利要求1-13任一項所定義的在來自肝細胞癌患者的血漿中其表達被下調的核酸分子所編碼的微RNA序列。
17.權利要求16的藥物組合物在製備用於預防和/或治療肝細胞癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發明提供了微RNA生物標記和包含多種編碼所述微RNA生物標記的核酸分子的診斷試劑盒，用於鑑別展現出肝細胞癌的一或多種目標血漿。本發明還提供了用於診斷和治療肝細胞癌的方法，以及用於預防和治療肝細胞癌的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK102892898SQ201080064802
公開日2013年1月23日 申請日期2010年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者吳瑩, 朱虹光, 高雪, 盧韶華, 李兆勇, 任一萍, 李健 申請人:復旦大學