人泡沫病毒載體介導的抑制HIV-1複製的shRNA的構建及應用的製作方法

2023-10-22 17:08:57 4

人泡沫病毒載體介導的抑制HIV-1複製的shRNA的構建及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了人泡沫病毒載體介導的抑制HIV-1複製的shRNA的構建和應用。抑制HIV-1複製的shRNA為shRNA1、2或3，它們都包含19nt的siRNA正義鏈（SEQIDNO.1、3、5），9nt的loop環，19nt的siRNA反義鏈和終止信號。這些shRNA能夠特異性地抑制HIV-1NL4-3基因的表達。通過構建表達上述shRNA的人泡沫病毒載體和Luciferase、qPCR、ELISA和LDH分析表明本發明的shRNA可有效穩定地抑制HIV-1NL4-3基因的表達，展示了人泡沫病毒作為表達載體介導的siRNA在愛滋病治療中的應用前景，為愛滋病治療研究提供了實驗依據。
【專利說明】人泡沬病毒載體介導的抑制HIV-1複製的shRNA的構建及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學和生物醫藥【技術領域】，具體涉及人泡沫病毒載體介導的抑制Hiv-1複製的shRNA的構建和應用。
【背景技術】
[0002]人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus,HIV)俗稱愛滋病(Acquiredimmune deficiency syndrome,AIDS)病毒,誘發人類獲得性免疫缺陷症候群。該病毒在分類上屬逆轉錄病毒科慢病毒屬中的靈長類免疫缺陷病毒亞屬。HIV感染一直是公眾健康的重大威脅。目前的抗HIV治療藥物不能對疾病進行徹底的治療，而且患者還需要終身服藥。因此，更多的研究開始轉變以往的治療思路，探尋更加有效更加經濟的治療辦法。
[0003]RNA幹擾(RNA interference, RNAi)技術是近幾年發展起來的可用於各種病毒治療的新方法。目前已有很多研究報導了通過對HIV保守基因進行RNA幹擾，進而達到抑制HIV病毒複製的目的。RNAi也稱為依賴於RNA的基因沉默機制，是指通過雙鏈RNA特異性地抑制與其序列同源的靶基因mRNA表達的現象。
[0004]由於HIV-1的高突變率，其在RNAi靶點序列的鹼基突變可顯著降低或解除RNAi的抑制效果。因此尋找保守的靶基因至關重要。HIV-1的長末端重複序列(long terminalrepeat, LTR)含有病毒複製所必需的重要調控因子，在病毒表達調控中起到了重要作用。因此選擇HIV-1LTR區作為RNAi的靶序列。RNAi可以用化學合成的成熟的siRNA (smallinterfering RNA,小幹擾RNA)去瞬時轉染細胞,但在體內半衰期很短,短時間內降解，而且在動物中不適用。通過表達shRNA (short hairpin RNA,短髮夾RNA)的病毒載體整合進入細胞進行長期穩定表達是RNAi的首選。
[0005]泡沫病毒(Foamy virus, FV),也稱合胞體病毒,是逆轉錄病毒的重要成員。因其感染細胞後可誘導產生類似泡沫的大量空泡、多核細胞而得名，至今仍未能發現其與人類的某種疾病存在著相互關聯。病毒載體有許多優點，如轉染效率高、整合準確，可將外源基因轉移入人體的許多不同類型的細胞等，但也存在著令人不安的難題，其中最主要為潛在的致癌可能性。而泡沫病毒載體的安全性則更高，同時它有著廣泛的宿主範圍，且可攜帶大片段外源基因。
[0006]人泡沫病毒(Human foamy virus, HFV,也稱為原型泡沫病毒(Prototype foamyvirus, PFV))缺失載體(ΔΦ)缺失了原病毒基因組gag、pol、env、bell-3附屬基因和LTR U3區，但是保留了一個必須的2.5kb長的順式作用區。另外，終止密碼子被引入到保留的gag序列 去阻止病毒多肽的表達，進一步消除Gag-Pol融合蛋白的反面影響。同時，還有三種單獨的輔助載體質粒(pCiGS、pCiPS、pCiES)來分別表達Gag，Pol, Env蛋白，四種質粒瞬時共轉染可以產生正常的人泡沫病毒載體原液(Trobridge G, JosephsonN, Vassilopoulos Gj Mac J，Russell DW.1mproved foamy virus vectors with minimalviral sequences.Mol Therj 2002, 6(3):321-8)0
【發明內容】

[0007]本發明的目的首要目的在於提供一種抑制HIV-1複製的siRNA。
[0008]本發明的另一目的在於提供含有上述siRNA抑制HIV-1複製的shRNA。
[0009]本發明的再一目的在於提供含有上述shRNA抑制HIV-1複製的人泡沫病毒表達載體及構建方法。
[0010]本發明的目的還在於提供上述siRNA、shRNA或人泡沫病毒表達載體的應用。
[0011]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0012]一種抑制 HIV-1 複製的 siRNA，為 siRNAl、siRNA2 或 siRNA3 ;其中，
[0013]siRNAl 的正義鏈為:5』 -GCATCCGGAGTACTACAAA-3』，
[0014]siRNAl 的反義鏈為:5』-TTTGTAGTACTCCGGATGC-3』 ；
[0015]siRNA2 的正義鏈為:5』 -GCCCTCAGATGCTACATAT-3』，
[0016]siRNA2 的反義鏈為:5』-ATATGTAGCATCTGAGGGC-3』 ；
[0017]siRNA3 的正義鏈為:5』 -GCTTGCCTTGAGTGCTCAA-3』，
[0018]siRNA3 的反 義鏈為:5』 -TTGAGCACTCAAGGCAAGC-3』。
[0019]一種抑制HIV-1複製的shRNA，為shRNAl、shRNA2或shRNA3，它們都包含19nt的siRNA 正義鏈，9nt 的 loop 環，19nt 的 siRNA 反義鏈和終止信號；shRNAl、shRNA2、shRNA3的siRNA正義鏈和siRNA反義鏈分別為siRNAl、siRNA2、siRNA3的正義鏈和反義鏈；所述的loop環的鹼基序列為TTCAAGAGA ;所述的終止信號的鹼基序列為TTTTT。
[0020]一種抑制HIV-1複製的人泡沫病毒表達載體，為能表達shRNAl、shRNA2或shRNA3的 ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρ Δ Φ-Η1_8?ιΚΝΑ2 或 ρ Λ Φ-Hl-shRNASo
[0021]所述的抑制HIV-1複製的人泡沫病毒表達載體的構建方法包括如下步驟:
[0022](I)將 shRNAl、shRNA2、shRNA3 分別克隆到 shRNA 表達載體 pSUPER 上得至IjpSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER_shRNA3。
[0023](2)分別以 pSUPER-shRNAl、pSUPER_shRNA2、pSUPER_shRNA3 進行 PCR 擴增，引物為:
[0024]上遊引物P1: 5 』 -AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3，，
[0025]下遊引物P2:5 』 -GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3 』。
[0026](3)通過KpnI和BamHI將⑵擴增的產物克隆到人泡沫病毒載體ρ Λ Φ上得到ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρΔ Φ-Η1_8?ιΚΝΑ2 或 ρΛ Φ-Hl-shRNASo 其中，人泡沫病毒載體 ρΔ Φ通過下列文獻中闡述的材料方法製備得到(Trobridge G, Josephson N, VassilopoulosG, Mac J, Russell Dff.1mproved foamy virus vectors with minimal viral sequences.Mol Ther, 2002，6(3):321-8 ；
[0027]Trobridge GD,RusselI Dff.Helper-Free Foamy Virus Vectors.Hum GeneTher, 1998，9(17):2517-25)。
[0028]通過Luciferase、qPCR、ELISA和LDH分析表明本發明人泡沫病毒介導的siRNA對HIV-1NL4_3有明顯的抑制作用，能明顯抑制Hiv-lgag、pol、env基因的mRNA表達水平，能夠顯著降低HIV-lp24蛋白的表達水平，且無細胞毒性。
[0029]基於本發明研究，上述抑制HIV-1複製的siRNA、shRNA或人泡沫病毒表達載體可用於製備治療愛滋病的藥物。
[0030]一種治療愛滋病的藥物，包含上述抑制HIV-1複製的siRNA、shRNA或人泡沫病毒表達載體。
[0031]本發明提供了能夠抑制HIV-1複製siRNA、shRNA，成功構建了無細胞毒性、能抑制HIV-1複製的人泡沫病毒表達載體，為愛滋病治療及預防研究提供實驗依據及理論基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1是shRNA轉錄生成siRNA的示意圖；該shRNA包含19nt的siRNA正義鏈,9nt的loop環，19nt的siRNA反義鏈和TTTTT終止信號，將其插入pSUPER載體Hl啟動子下，就能有效表達出所需的siRNA。
[0033]圖2是將shRNA表達載體質粒或pSUPER空載體分別與pNL4_3.Luc.R-E-、pRL_TK共轉染293T細胞，48小時後Luciferase (螢光素酶實驗)檢測shRNA對HIV_1NM_3基因抑制水平的分析圖；與空載體對照組比較，*#P〈0.005。
[0034]圖3是抑制HIV-1複製的shRNA的人泡沫病毒表達載體ρ Δ Φ-Hl-shRNA的構建示意圖；將含有Hl啟動子的shRNA基因片段克隆入人泡沫病毒載體ρΛ Φ中得到人泡沫病毒表達載體；圖中，CMV(cytomegalovirus,巨細胞病毒)是一種組成型啟動子，能夠控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達程度。
[0035]圖4是輔助載體質粒pCiGS、pCiPS、pCiES的示意圖;圖中，Gag、Pol、Env分別是泡沫病毒的衣殼蛋白，逆轉錄酶和病毒糖蛋白；CMV(cytomegalovirus,巨細胞病毒)是一種組成型啟動子，能夠控制基因表達(轉錄)的起始時間和表達程度；SpA(Simianvirus40poly adenylation signal, SV40poly (A))猿猴空泡病毒40多聚腺苷酸序列，對上遊基因的轉錄水平起調控作用。
[0036]圖5是將人泡沫病毒表達載體和輔助載體質粒及pNL4-3.Luc.R-E-, pRL-TK共轉染293T細胞48h後，Luciferase (螢光素酶實驗)檢測人泡沫病毒載體介導的shRNA對HIV-1NL4_3基因抑制水平的分析圖；與空載體對照組比較，*#P〈0.005。
[0037] 圖6是將人泡沫病毒載體介導的shRNA和輔助載體質粒及pNL4_3.Luc.R-E-共轉染293T細胞48h後，qPCR檢測細胞培養基中HIV-1gag(A)、pol (B)、env (C)基因mRNA水平的分析圖；與未轉染shRNA的對照組比較，*P〈0.05，#P〈0.01。
[0038]圖7是將人泡沫病毒載體介導的shRNA和輔助載體質粒及pNL4_3-Luc共轉染293T細胞48h後，ELISA(酶聯免疫吸附試驗)檢測胞內HIV_lp24蛋白表達水平的分析圖；與空載體對照組比較，**P<0.01，*#P〈0.005。
[0039]圖8是將人泡沫病毒載體介導的shRNA和輔助載體質粒及pNL4_3.Luc.R-E-共轉染293T細胞48h後，LDH(乳酸脫氫酶實驗)分析圖，表明人泡沫病毒載體介導的shRNA不會產生細胞毒性；與空載體對照組比較，p>0.05,無顯著性差異(non significant, ns)。
【具體實施方式】
[0040]下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0041]實施例1由shRNA轉錄生成siRNA的策略[0042]shRNA轉錄生成siRNA的示意圖如圖1所示。設計的寡核苷酸鏈每條均為60nt, 5』端和3』端分別包含BglII和HindIII酶切位點，便於與pSUPER載體連接。5』端19nt的序列(siRNA正義鏈)與靶基因同源，另一端19nt的序列(siRNA反義鏈)與其反向互補，其間由9nt的TTCAAGAGA間隔序列形成環狀結構，末端加有轉錄終止信號TTTTT。具有上述結構特徵的寡核苷酸鏈經退火、磷酸化後形成雙鏈DNA，然後定向插入經相同酶切的pSUPER載體Hl啟動子下。具有上述結構的pSUPER載體能轉錄生成shRNA，後者經Dicer酶切後成為siRNA而發揮抑制基因表達的功能。
[0043]實施例2針對HIV-1基因幹涉位點的選擇與寡核苷酸的設計
[0044]根據shRNA的設計原則，以HIV-1 (GenBank編號:AF324493) LTR基因序列作為siRNA的祀序列，設計了 3條shRNA oligo,設計的shRNA序列進行BLAST (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/)同源分析證實為HIV-1特異序列。設計得到的shRNA及其革巴向HIV-1nl4_3的位點如表1所示。
[0045]表1.shRNA序列及其靶向HIV_1NM_3的位點
【權利要求】
1.一種抑制HIV-1複製的siRNA，其特徵在於:所述的抑制HIV-1複製的siRNA為siRNAl、siRNA2 或 siRNA3 ;其中， siRNAl 的正義鏈為:5』 -GCATCCGGAGTACTACAAA-3』， siRNAl 的反義鏈為:5』 -TTTGTAGTACTCCGGATGC-3』 ； siRNA2 的正義鏈為:5』 -GCCCTCAGATGCTACATAT-3』， siRNA2 的反義鏈為:5』 -ATATGTAGCATCTGAGGGC-3』 ； siRNA3 的正義鏈為:5』 -GCTTGCCTTGAGTGCTCAA-3』， siRNA3 的反義鏈為:5』 -TTGAGCACTCAAGGCAAGC-3』。
2.一種抑制HIV-1複製的shRNA，其特徵在於:所述的抑制HIV-1複製的shRNA為shRNAl、shRNA2 或 shRNA3，它們都包含 19nt 的 siRNA 正義鏈，9nt 的 loop 環，19nt 的siRNA反義鏈和終止信號；shRNAl、shRNA2、shRNA3的siRNA正義鏈和siRNA反義鏈分別為權利要求1中siRNAl、siRNA2、siRNA3的正義鏈和反義鏈；所述的loop環的鹼基序列為TTCAAGAGA ;所述的終止信號的鹼基序列為TTTTT。
3.一種抑制HIV-1複製的人泡沫病毒表達載體，其特徵在於:所述的抑制HIV-1複製的人泡沫病毒表達載體為能表達權利要求2中shRNAl、shRNA2或shRNA3的人泡沫病毒表達載體。
4.權利要求3種所述的抑制HIV-1複製的人泡沫病毒表達載體的構建方法，其特徵在於包括如下步驟: (1)將權利要求2中的shRNAl、shRNA2、shRNA3分別克隆到shRNA表達載體pSUPER上得到 pSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3 ； (2)分別以pSUPER-shRNAl、pSUPER-shRNA2、pSUPER-shRNA3 進行 PCR 擴增，引物為: 上遊引物 Pl:5』 -AGAGGTACCCGAACGCTGACGTCATCA-3』，
下遊引物 P2:5』 -GAGGATCCCTCGAGGTCGACGGTATC-3』 ； (3)通過KpnI和BamHI將(2)擴增的產物克隆到人泡沫病毒載體ρΛ Φ上得到抑制HIV-1複製的人泡沫病毒表達載體ρ Λ Φ-Hl-shRNAl、ρ Δ (D-Hl-shRNA2或ρΔ Φ-Hl-shRNASo
5.權利要求1所述的siRNA、權利要求2所述的shRNA或權利要求3所述的人泡沫病毒表達載體在製備治療愛滋病的藥物中的應用。
6.一種治療愛滋病的藥物，其特徵在於:包含權利要求1所述的siRNA、權利要求2所述的shRNA或權利要求3所述的人泡沫病毒表達載體。
【文檔編號】C12N15/113GK103966219SQ201410225029
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月26日 優先權日:2014年5月26日
【發明者】劉萬紅, 何小華, 彭碧文, 程青青, 董蘭蘭, 李治, 孫燕 申請人:武漢大學