骨架型黃體酮緩釋微球及其製備方法和黃體酮緩釋注射劑與流程

2023-10-22 12:13:22 5

本發明涉及製藥技術領域，尤其涉及一種骨架型黃體酮緩釋微球及其製備方法和黃體酮緩釋注射劑。

背景技術：

習慣性流產指的是連續發生≥3次的自然流產，其發病誘因尚不完全明確，給病人心理帶來巨大的傷害。復發性流產發病誘因繁多，並較為複雜，其主要有免疫因素、遺傳以及內分泌紊亂等，因此給臨床治療帶來一定的難度。根據相關實踐研究表明，患有這種疾病的病人身體當中的黃體功能不全的為24％-68％。對於黃體缺陷的發生，研究者多認為是由於絕大多數試管嬰兒周期中使用促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin-releasinghormoneagonist，gnrha)進行降調節，gnrha引起垂體抑制，使得垂體功能恢復相對推遲，導致妊娠早期黃體功能缺陷。臨床應用試管嬰兒等人工助孕技術30多年以來，黃體期藥物支持治療逐漸被公認為是有利於妊娠結局的一種幹預手段。

黃體酮(progesterone，可簡稱prg)，又名孕酮，為白色或微黃色結晶粉末，熔點127～131℃，無臭，在空氣中穩定，有右旋光性，不溶於水，溶於乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、二氧六環和濃硫酸。黃體酮的化學名稱為：孕甾-4-烯-3,20-二酮，分子式：c21h30o2，分子量：314.47，結構式如下：

黃體酮能夠使增值期內膜轉化成為分泌期內膜，為受精卵植入、著床以及初期胚胎的營養支持提供便利條件。孕酮可以使細胞當中鈉離子濃度明顯升高，使肌纖維興奮性明顯下降，以及使肌纖維明顯鬆弛，進而使宮縮明顯減少，最終使胚胎在子宮當中繼續進行生長發育；黃體激素對妊娠的積極作用主要體現在誘導子宮內膜向分泌期轉變，增加內膜容受性以利於受精卵著床，以及作用於子宮局部，經一氧化氮等因子促使血管及平滑肌舒張而抑制宮縮。

臨床上黃體酮應用劑型主要有口服膠囊、凝膠栓劑、肌注油溶製劑等，其中，黃體酮口服製劑給藥方便快捷，患者易於接受，但是口服黃體酮會在胃腸道及肝臟迅速破壞，難以起到補充和治療作用。由於黃體酮溶解度極低，且首過效應嚴重，口服生物利用度僅為10％。口服製劑往往通過增加表面活性劑濃度來提高黃體酮溶解度，不能從根本上解決黃體酮首過效應強、生物利用度低的問題；每天的給藥劑量仍需很大才能達到療效，導致副作用較大。因此，臨床上普遍使用油溶液肌注，價格也相對低廉。

但是，現有的黃體酮注射劑為油溶液注射劑，需每天注射，長期注射(約12周)。油溶液注射時極易引起患者不適，如疼痛、局部紅腫、過敏等症狀，個別病理報導甚至指出肌肉注射黃體酮可誘發急性嗜酸性粒細胞肺炎。且油劑黃體酮半衰期長，通常要數周時間才能恢復。長期高頻次注射也會導致注射部位產生硬結等其他症狀，不利於注射部位組織健康。患者均為孕婦，每天注射黃體酮極為不便，且黃體酮注射存在油溶劑易引起肌肉板結、疼痛等問題。

技術實現要素：

有鑑於此，本申請提供一種骨架型黃體酮緩釋微球及其製備方法和黃體酮緩釋注射劑，本發明提供的黃體酮緩釋微球可用作肌肉注射劑，載藥量高，體內外持續釋放時間長，且注射刺激性小，患者順應性好。

本發明提供一種骨架型黃體酮緩釋微球，其由包括黃體酮和聚合物材料的物料製成，所述聚合物材料選自聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己內酯和聚乙醇酸中的一種或多種；所述聚合物材料的分子量為4000～40000道爾頓；所述聚合物材料與黃體酮的質量比為9:1～1:1；

所述骨架型黃體酮緩釋微球的粒徑為1～10μm。

本發明提供一種骨架型黃體酮緩釋微球的製備方法，包括以下步驟：

1)將包括黃體酮和聚合物材料的物料進行熱熔擠出，得到擠出物；所述聚合物材料與黃體酮的質量比為9:1～1:1；所述聚合物材料選自聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸、聚己內酯和聚乙醇酸中的一種或多種；所述聚合物材料的分子量為4000～40000道爾頓；

2)將步驟1)得到的擠出物在低溫下進行粉碎過篩，得到粉碎物；

3)將步驟2)得到的粉碎物進行溼法研磨，經乾燥，得到骨架型黃體酮緩釋微球。

為解決黃體酮臨床應用劑型上的不足，本發明人經大量研究發明了可用於肌肉注射的黃體酮緩釋微球，藥物包埋於生物可降解、組織相容性良好的聚合物材料內，體內外均可持續緩釋一周以上，安全性較強，刺激性小，提高患者順應性。另外，本發明的目的還在於製備過程不使用任何有機溶劑，從而杜絕了有機溶劑殘留的問題。

為實現上述目的，具體而言，本發明實施例包括以下步驟：

(1)將定量的黃體酮和聚合物材料均勻混合，混合後的物料置於雙螺杆擠出機進行擠出；

(2)將步驟(1)得到的擠出物在低溫下進行粉碎過篩；

(3)將步驟(2)得到的粉碎物置於溼法循環式球磨機中進行研磨處理，再將研磨液進行冷凍乾燥，得到骨架型黃體酮緩釋微球。

本發明以生物可降解的聚合物材料為載體原料，所述聚合物材料選自聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)、聚乳酸(pla)、聚己內酯(pcl)和聚乙醇酸(pga)中的一種或多種，優選為生物可降解的聚合物plga，其在環保性和注射應用性等方面的效果最佳。考慮材料的降解周期，本發明首選降解時間短的plga作為載體，可使長效注射劑給藥周期為一周一次。在本發明的一些實施例中，plga的乳酸和羥基乙酸的摩爾比例為50：50；在本發明的另一些實施例中，plga的乳酸和羥基乙酸的摩爾比例為75：25。

在本發明中，所述聚合物材料的分子量為4000～40000道爾頓；具體地，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量可為10000-40000道爾頓；聚乳酸的分子量可為10000-20000道爾頓；聚己內酯的分子量可為4000-40000道爾頓；聚乙醇酸的分子量可為8000-20000道爾頓。在本發明的一些實施例中，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量為10000-20000道爾頓。

在本發明中，活性成分為黃體酮，載體可為生物可降解的聚合物plga。本發明實施例可採用經預處理的聚合物材料，通過熱熔擠出技術，將包括黃體酮和聚合物材料的物料製備成條狀藥物，粉碎後經溼法研磨，冷凍乾燥即得。在進行熱熔混合時，聚合物材料與黃體酮投料質量比為0-100，即所述聚合物材料與黃體酮投料質量比為9:1～1:1。在本發明的一些實施例中，黃體酮與plga的質量比可為1：2、2：3、1：1。此外，本發明對黃體酮的晶型沒有特殊限制。

在本發明中，所述物料優選還包括輔料，如注射用親水性載體泊洛沙姆188和增塑劑中的一種或多種。其中，泊洛沙姆(poloxamer)為聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，商品名為普蘭尼克(pluronic)，屬於高分子非離子表面活性劑。泊洛沙姆188也稱f68，是一種水包油乳化劑。泊洛沙姆為注射級別藥用輔料，可根據釋放需求改變泊洛沙姆的用量從而調節釋放情況。增塑劑的主要功能為提高載體的易使用性、彈性及膨脹性；通過增大載體鏈之間的自由空間，降低了載體的熔點，使熱熔融擠出工藝可以在低溫和低扭力矩下進行；增加了活性成分和載體的穩定性。常用的增塑劑有檸檬酸脂、脂肪酸酯類、peg類等。作為優選，所述增塑劑選自檸檬酸三乙酯、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)和甘油單硬脂酸酯中的一種或多種。

在本發明的一些實施例中，採用熱熔擠出機進行熱熔擠出，所用的熱熔擠出機優選為同向雙螺杆擠出機；擠出機各區段溫度範圍包括：1區80-100℃；2區90-110℃；3區115-130℃；4區110-120℃。本發明實施例各區段溫度的設定可根據藥物性質而定；在進行熱熔混合時，雙螺杆轉速可設定為0-500rpm，優選為100rpm～300rpm。

本發明主要應用熱熔擠出-研磨法，將藥物黃體酮與生物可降解聚合物plga、pla、pcl、pga等均勻混合，於同向雙螺杆熱熔擠出機中進行熔融混合、擠出、粉碎後，再經溼法研磨進一步降低粒徑，最後經冷凍乾燥或噴霧乾燥，製成骨架型黃體酮緩釋微球，微粒粒徑控制在1-10μm範圍內。

在本發明的實施例中，擠出物冷卻後進行低溫粉碎，粉碎物再進行溼法研磨。在本發明的具體實施例中，研磨處理的轉速可為2000rpm；研磨時間可為30min。作為優選，所述溼法研磨初步用氧化鋯珠研磨，以降低粒徑；再用聚乙烯珠進行深度打磨，使顆粒表面光滑，通針性好。

如採用普通球磨機或冷凍粉碎機進行物料的粉碎，粉碎粒徑較大，且粒子呈不規則形狀。而本發明採用溼法研磨後續處理，分別經氧化鋯珠和聚乙烯珠進行研磨處理，粒徑可降至3-5μm，在小粒徑下控制藥物釋放，注射刺激性小，通針性良好。

溼法研磨結束後，本發明實施例可將研磨液經冷凍乾燥或噴霧乾燥等常規的乾燥方式，製成肌肉注射用的黃體酮緩釋微球。具體的，凍幹工藝可包括：-40℃預凍四小時，抽真空，-40℃維持兩個小時，兩個小時升至-20℃維持三個小時，一個小時升至-10℃維持兩個小時，兩個小時升至0℃維持兩個小時，兩個小時升至20℃維持兩個小時。

本發明所述的骨架型黃體酮緩釋微球的粒徑為1～10μm，優選為3～5μm。本發明所述的注射用的黃體酮緩釋微球粒度分布均勻，載藥量高。在本發明的一些實施例中，所述黃體酮緩釋微球的載藥量為20％～45％，優選為29％～45％。在本發明的一些實施例中，所述的黃體酮緩釋微球的比表面積為1100～1200m2/kg。

本發明實施例所採用的熱熔擠出技術，是利用原料藥同包裹輔料經由不同的熱熔單元，進行熔融混合，得到均勻分布原料藥的plga條狀擠出物，再對擠出物進行研磨，得到顆粒狀微球。並且，本發明可通過控制熔融溫度和研磨條件等來調整藥物分布狀態和粒徑大小。熱熔擠出法相對於傳統乳化法製備載體包封微粒而言，具有操作步驟簡化、過程時間短、避免使用有機溶劑和水、藥物在載體中均勻分散等明顯優勢，亦可實現持續化操作，利於工藝放大生產。

本發明還提供一種黃體酮緩釋注射劑，其包括黃體酮微球和注射用溶劑；所述黃體酮微球為上文所述的骨架型黃體酮緩釋微球。

本發明的黃體酮緩釋製劑採用生物可降解高分子材料包裹藥物製成注射用微球製劑給藥後，藥物通過在微球內的擴散和聚合物骨架的溶蝕控制釋放，達到長效平穩緩釋的目的。並且，體內可維持有效血藥濃度，因而可以提高患者的依從性，提高療效。此外，本發明製備過程不使用有機溶劑，避免有機溶劑殘留問題，有機雜質含量低，注射安全性高。

本發明提供的黃體酮緩釋注射劑採用肌肉注射，其包括上文所述的骨架型黃體酮緩釋微球；另附註射用溶劑。

在本發明中，注射用溶劑可以使藥物懸浮，從而使給藥均勻、順利。所述注射用溶劑即注射用微球復溶劑，可包括注射用水、ph值調節劑、滲透壓調節劑和穩定劑，如包含羧甲基纖維素鈉(cmc-na)、甘露醇中的一種或其混合物。在本發明的具體實施例中，所述注射用溶劑的成分包括無水檸檬酸、無水磷酸氫二鈉、聚山梨酯20、cmc-na、氯化鈉以及注射用水。

本發明實施例可將上述步驟得到的研磨混懸液分裝凍幹，另附註射用溶劑即得；裝量為2-3ml/支，即所述黃體酮緩釋注射劑的裝量可為2ml/支，也可為3ml/支等。在本發明的一些實施例中，每支注射劑中黃體酮含量為140mg；本發明設計人用劑量為140mg/周，140mg/支(以黃體酮計)。

在本發明中，該製劑粒度分布均勻，載藥量高，體內外持續釋放一周以上，累計釋放90％以上，且釋放均一穩定，可較長時間維持有效血藥濃度，給藥一次可維持一周治療之久，注射刺激性小，患者順應性好。

根據研究人員進行的臨床調查，目前臨床上治療習慣性流產和輔助生殖劑量為肌注20mg/day和60mg/day。而本發明製劑設計劑量為140mg/周，一周給藥一次。在給藥劑量和頻率上均少於臨床普通製劑，而本品在後續藥動和藥效學學研究結果顯示，本品生物利用度和治療效果與市售製劑相當；而給藥劑量和頻率的減少可降低副作用的發生率，提高患者依從性。

附圖說明

圖1為本發明實施例黃體酮緩釋製劑與現有產品的血藥濃度曲線圖；

圖2為實施例1製備出的黃體酮緩釋微球的粒度測定結果；

圖3為本發明實施例製備出的黃體酮緩釋微球的dsc曲線；

圖4為實施例2-4製備出的黃體酮緩釋微球的體外釋放曲線。

具體實施方式

下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

為了進一步理解本申請，下面結合實施例對本申請提供的骨架型黃體酮緩釋微球及其製備方法和黃體酮緩釋注射劑進行具體地描述。

以下實施例中，所用的黃體酮為晶型ⅱ、廠家：湖北葛店人福藥業有限責任公司，批號：htt151102。

實施例1

將黃體酮與plga(50：50(乳酸和羥基乙酸的摩爾比例)，10000道爾頓，以下實施例表示同實施例1)，以1：2的質量比進行物理混合，加入輔料並混合均勻。將混合均勻的物料投入雙螺杆擠出機中進行熱熔擠出，雙螺杆轉速為160rpm，各區溫度設為1區，80℃；2區，90℃；3區，115℃；4區，110℃。擠出物冷卻後進行低溫粉碎，將小型粉碎機中加入適量乾冰保證低溫環境，進行擠出物的粉碎；粉碎物於溼法循環式球磨機中進行研磨處理，初步用氧化鋯珠研磨，再用聚乙烯珠進行深度打磨。將研磨液分裝至西林瓶中進行冷凍乾燥，得到骨架型黃體酮緩釋微球。

其中，冷凍乾燥工藝包括：-40℃預凍四小時，抽真空，-40℃維持兩個小時，兩個小時升至-20℃維持三個小時，一個小時升至-10℃維持兩個小時，兩個小時升至0℃維持兩個小時，兩個小時升至20℃維持兩個小時。

實施例1中的處方及相關工藝參見表1：

表1實施例1中的處方及相關工藝參數

實施例2-4不同分子量plga製備黃體酮緩釋微球

將黃體酮分別與分子量為13000、20000、30000道爾頓的plga(50：50)以1：2的質量比進行物理混合，加入輔料並混合均勻。將混合均勻的物料投入雙螺杆擠出機中進行熱熔擠出，雙螺杆轉速為160rpm，各區溫度設為1區，80℃；2區，90℃；3區，115℃；4區，110℃。擠出物冷卻後進行低溫粉碎，粉碎物於溼法循環式球磨機中進行研磨處理，初步用氧化鋯珠研磨，再用聚乙烯珠進行深度打磨。將研磨液分裝至西林瓶中進行冷凍乾燥，得到骨架型黃體酮緩釋微球。實施例2-4中的處方及相關工藝參見表2：

表2實施例2-4中的處方及相關工藝參數

實施例5-7不同理論載藥量黃體酮緩釋微球

將黃體酮與plga(50：50；10000)分別以1：2、2：3、1：1的質量比進行物理混合，加入輔料並混合均勻。將混合均勻的物料投入雙螺杆擠出機中進行熱熔擠出，雙螺杆轉速為160rpm，各區溫度設為1區，80℃；2區，90℃；3區，115℃；4區，110℃。擠出物冷卻後進行低溫粉碎，粉碎物於溼法循環式球磨機中進行研磨處理，初步用氧化鋯珠研磨，再用聚乙烯珠進行深度打磨。將研磨液分裝至西林瓶中進行冷凍乾燥，得到骨架型黃體酮緩釋微球。實施例5-7中的處方及相關工藝參見表3：

表3實施例5-7中的處方及相關工藝參數

實施例8-10不同親水性載體用量

將黃體酮與plga(50：50；13000)以1：2的質量比進行物理混合，分別加入5％、10％、15％的泊洛沙姆(5％、10％、15％為泊洛沙姆佔黃體酮與plga總重(30g)的質量百分比)，混合均勻。將混合均勻的物料投入雙螺杆擠出機中進行熱熔擠出，雙螺杆轉速為160rpm，各區溫度設為1區，80℃；2區，90℃；3區，115℃；4區，110℃。擠出物冷卻後進行低溫粉碎，粉碎物於溼法循環式球磨機中進行研磨處理，初步用氧化鋯珠研磨，再用聚乙烯珠進行深度打磨。將研磨液分裝至西林瓶中進行冷凍乾燥，得到骨架型黃體酮緩釋微球。實施例8-10中的處方及相關工藝參見表4：

表4實施例8-10中的處方及相關工藝參數

洛沙姆為注射級別藥用輔料，可根據釋放需求改變泊洛沙姆的用量從而調節釋放情況。本發明實施例中親水性載體泊洛沙姆用量在0-20％，最優方案為10％，藥物釋放調節效果較好。

實施例11-13不同增塑劑對擠出的影響

將黃體酮與plga(50：50；13000)分別以1：2的質量比進行物理混合，加入各處方種類的增塑劑，加入其他輔料並混合均勻。將混合均勻的物料投入雙螺杆擠出機中進行熱熔擠出，雙螺杆轉速為160rpm，各區溫度設為1區，80℃；2區，90℃；3區，115℃；4區，110℃。擠出物冷卻後進行低溫粉碎，粉碎物於溼法循環式球磨機中進行研磨處理，初步用氧化鋯珠研磨，再用聚乙烯珠進行深度打磨。將研磨液分裝至西林瓶中進行冷凍乾燥，得到骨架型黃體酮緩釋微球。實施例11-13中的處方及相關工藝參見表5：

表5實施例11-13中的處方及相關工藝參數

增塑劑的主要功能為提高載體的易使用性、彈性及膨脹性；通過增大載體鏈之間的自由空間，降低了載體的熔點，使熱熔融擠出工藝可以在低溫和低扭力矩下進行；增加了活性成分和載體的穩定性。本發明實施例中，增塑劑的使用可降低載體的相變溫度，使其在低於藥物的熔點擠出，可保證藥物在固體分散體中以晶體形式存在，釋放減慢。

實施例14

本發明的黃體酮緩釋微球的藥物動力學分析

根據實施例9方法所製備的2.52mg(以黃體酮計)的緩釋製劑，對sd大鼠(體重大約200g)的後腿股二頭肌進行肌肉注射，並以市售的黃體酮注射液(廠家：浙江仙琚製藥股份有限公司，批號：h33020828)為對照試驗。本發明緩釋製劑中的注射用溶劑即常規的注射用微球復溶劑，成分(藥用級)包括無水檸檬酸、無水磷酸氫二鈉、聚山梨酯20、cmc-na、氯化鈉以及注射用水(本注射用溶劑成分參考市售利培酮(恆德)說明書)。

對受試大鼠定期眼後靜脈叢取血，通過建立lc-ms法測定血漿中黃體酮的藥物濃度。給藥0-180h的血藥濃度參見圖1，圖1為本發明實施例黃體酮緩釋製劑與現有產品的血藥濃度曲線圖。從圖1可以看出，本發明長效注射劑大鼠體內突釋量低於黃體酮注射劑，血藥濃度較平穩，未有明顯波動，可達到一周以上的緩釋效果。

實施例15

黃體酮緩釋製劑特性測試

1、粒徑和粒徑分布。將上述實施例1製備出的黃體酮緩釋微球用蒸餾水及0.1％cmc-na(0.1g/100ml，藥用級)配成混懸液，應用百特雷射粒度儀進行粒度測定，實施例1製備出的黃體酮緩釋微球的粒度測定結果見圖2和表6，圖2為實施例1製備出的黃體酮緩釋微球的粒度測定結果。由以上結果可知，微球d50為3.00μm，span2.523，粒徑分布較均一；表明該製劑粒度分布均勻，微粒粒徑控制在1-10μm範圍內，通針性好。

表6實施例1製備出的黃體酮緩釋微球的粒度測定數據

2、載藥量和包封率。精密量取上述實施例製備出的黃體酮緩釋微球10mg置25ml容量瓶中，加入1ml乙腈振蕩溶解，用乙腈定容至刻度，混勻，用0.45μm微孔濾膜過濾即可。用hplc法測定載藥量和包封率，計算公式如下，結果參見表7。由以下結果可知，本發明製劑載藥量高。

表7實施例5-7載藥量、包封率測定結果

3、藥物在載體中的分散狀態

將黃體酮原料藥、plga空白輔料、黃體酮-plga載藥微球、物理混合物(40％)分別做dsc分析。取樣品適量，置於差示掃描量熱儀的鋁盤中，以氧化鋁為參比物，在氮氣流中，從30℃起，以10℃/min的速率升溫至350℃，得dsc曲線，如圖3所示；亦可獲得樣品的熔融焓，通過和對照對比，應用相應分析軟體可計算出微球中藥物的結晶度。圖3中，a)為prg曲線，b)為plga曲線，c)為prg-plga載藥微球曲線，d)為物理混合物(40％)曲線。由圖3可見，黃體酮在熱熔擠出-研磨法製備微球仍以晶體形式存在，因此具有緩釋效果。

實施例16釋放行為

關於體外釋放度方法的建立，本發明考慮體內外相關性，採用模擬半固體製劑的franz擴散池法測定體外釋放，製劑和釋放介質由半透膜分離開，藥物釋放經過跨膜過程，最大限度模擬體內肌肉注射的釋放機制。釋放介質為0.5％sds水溶液，透皮擴散池恆溫水浴37℃，300rpm攪拌。

實施例2、3、4的對比測定結果參見圖4和表8，圖4為實施例2-4製備出的黃體酮緩釋微球的體外釋放曲線，體外釋放結果如下表8。其中，所使用plga材料分子量不同，三個實施例釋放周期均為一周，累計釋放90％以上；差別在於突釋量(24h)和一周完全釋放量(7d)。

表8實施例2-4製備出的黃體酮緩釋微球的體外釋放結果

綜上所述，本發明的黃體酮控釋微球中，黃體酮可在一周內釋放完，且釋放過程平穩，無明顯突釋現象，保證了臨床上一周給藥一次的治療方案。