毛蒟提取物在製備治療或預防急慢性肝損傷藥物中的應用的製作方法

2023-10-07 04:58:09 1

專利名稱：毛蒟提取物在製備治療或預防急慢性肝損傷藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及製藥領域，特別是一種毛蒴提取物在製備治療或預防急慢性肝損傷藥 物中的應用。
背景技術：
肝臟疾病是一類嚴重危害人類健康的疾病，發病率高，包括病毒性肝炎、肝硬化、 脂肪肝、酒精肝、藥物性肝病、遺傳性肝病等，這些肝病在急性起病、慢性急性發作病程中易 出現肝損傷，尤其是急性肝損傷。目前尚無急性肝損傷的統一定義，廣義而言，任何原因導 致肝功能指標異常，均提示肝損傷(美國國家臨床學會推薦，ALT、AST高於正常限值，可考 慮急性肝損傷)。引起急性肝損傷的常見原因有1、感染以各型肝炎病毒常見，其次非肝 炎病毒；2、藥物中毒對乙醯氨基酚、四氯化碳、酒精等；3、缺血或充血性循環障礙心包積 液、心衰、休克等；4、免疫功能失調多見自身免疫性肝炎；5、代謝性疾病妊娠急性脂肪 肝、肝豆狀核變核、遺傳性高酪氨酸血症等；其它如肝臟腫瘤、肝硬化等。我國是一個肝病大 國，肝病的發病率居世界第3位。急性肝損傷是臨床常見的肝病，病情進一步進展可出現肝功能障礙、肝性腦病，嚴 重者可出現死亡。因此，急性肝損傷早期診斷、早期治療是成功的關鍵。目前針對肝病損傷 的治療主要是藥物治療，傳統常見保肝藥物有門冬氨酸鉀鎂、還原性穀胱甘肽、硫普羅寧、 甘草酸二胺等，保肝作用機制與抗炎、保護肝細胞膜及代謝有關，上述藥物使用中，存在個 體差異大，使用後部分病人會出現血壓改變、腹脹、皮疹、發熱、噁心、嘔吐等胃腸不良反應。 隨著一些新型抗病毒、免疫調控劑、細胞因子的使用，肝病的治療近年得到一定的發展，但 仍存在著價格昂貴、個體差異大、過敏等問題，限制了其在臨床肝病治療中的應用。我國傳 統中醫藥在治療肝臟疾病方面有著豐富的經驗積累。大量的研究證明中草藥在抗肝細胞損 傷治療中具有良好的效果和獨特的優勢。中草藥不僅有來源廣泛、種類及數量多、不良反應少等優點，而且有多環節、多層 次、多靶點綜合作用的特點，在治療肝病方面具備獨特的優勢。因此從傳統的中草藥中尋找 高效、低毒治療肝臟疾病的新型藥物已成為研究的熱點。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種毛蒴提取物在製備治療或預防急慢性 肝損傷藥物中的應用。本發明是這樣實現的毛蒴提取物在製備治療或預防急慢性肝損傷藥物中的應 用，將毛蒴提取物應用在製備治療或預防急慢性肝損傷藥物中。毛蒴提取物包括毛蒴水提物及毛蒴醇提物。毛蒴為胡椒科胡椒屬藤本植物，主要分布在廣東、雲南、貴州，生於林下或潮溼谷 地，常攀援於石上或樹上，全株藥用，傳統用於行氣止痛、活血祛風、治胃痛等。毛蒴在貴州 民間廣泛用於肝病的治療，並取得了較好的療效，其具有來源廣泛，價格便宜，容易採集等特點。為了驗證毛蒴提取物的藥用效果，對其提取物進行藥效試驗，首先要對毛蒴提取 物進行提取試驗。一、毛蒴提取試驗 1、實驗材料
1.1、主要實驗儀器
50 - X900mm玻璃層析柱(上海琪特分析儀器有限公司RE — 2000旋轉蒸發儀(上海 亞榮生化儀器廠)，BSS - 110電子分析天平(北京賽多利斯電子天平有限公司)，SHHW電熱 恆溫三用水浴鍋(北京永光明醫療儀器廠)，SHB-IIlA循環水式多用真空泵(鄭州長城科工 茂有限公司)，DHG-9123A電熱恆溫鼓風乾燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，KL-R0-20艾 柯超純水機(成都康寧實驗專用純水設備廠)，M0DULY0D-230冷凍乾燥機(ThermoeIectron corporation)。1.2、藥品和試劑
1.2. 1、受試藥新鮮毛蒴來源於貴州省黔東南州錦屏縣。1. 2. 2、主要試劑D-101大孔吸附樹脂(上海摩速科學器材有限公司)，酒石酸鉀 鈉、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、結晶硫酸酮、三氯化鋁(成都市科龍化工試劑廠)，氫氧化鉀 (成都金山化學試劑有限公司)，三氯化鐵、碘化鉀、苦味酸、醋酐、醋酸鉛(天津市大茂化學 試劑廠)，明膠、α -奈酚(湖南湘中化學試劑開發中心)，其餘試劑均為分析純級。2、實驗方法
2.1、毛蒴提取工藝條件
2.1. 1藥材的預處理
新鮮毛蒴以純化水適當衝洗去除泥土，於40 °C烘箱中低溫乾燥，粉碎成粗粉，密 封於一容器內備用。2. 1.2毛蒴的提取方法
準確稱取10 g毛蒴乾燥粗粉末放置於圓底燒瓶中，按一定比例加入蒸餾水(料液比)， 浸泡合適的時間(浸泡時間)，加熱提取數小時(提取時間)，加熱結束後，趁熱真空抽濾，收 集濾液。殘渣用蒸餾水洗入圓底燒瓶中，再次加熱回流提取，提取數次(提取次數)後，同樣 趁熱真空抽濾，合併濾液。濾液於旋轉蒸發儀減壓回收溶劑，濃縮至膏狀，放置於冷凍乾燥 機乾燥得毛蒴總提取物。2. 1. 3、提取工藝單因素實驗 2.1.3.1、料液比單因素實驗
分別稱取10 g毛蒴粗粉末5份，於圓底燒瓶中，加入100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、 500 mL (料液比為1 :10、1 :20、1 :30、1 :40、1 50)蒸餾水，浸泡2 h，固定提取溫度，提取時
間2 h的條件下，提取3次，考察料液比對粗提取物的質量提取率的影響。每一條件重複3 次，取平均值。2. 1. 3. 2、提取次數單因素實驗
分別稱取10 g毛蒴粗粉末5份，於圓底燒瓶中，加入「2.1.3.1」項下質量提取率最高 的體積比的水，浸泡2 h，固定提取溫度，提取時間2 h的條件下，提取1、2、3、4次，考察提取 次數對粗提取物的質量提取率的影響。每一條件重複3次，取平均值。
2. 1.3. 3、提取時間單因素實驗
分別稱取10 g毛蒴粗粉末5份，於圓底燒瓶中，加入「2.1.3.1」項下質量提取率 最高的體積比的水，浸泡2 h,固定提取溫度，提取時間0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h 的條件下，提取「2. 1. 3. 2」項下質量提取率最高的次數，考察提取時間對粗提取物的質量提 取率的影響。每一條件重複3次，取平均值。2. 1. 3. 4、藥材浸泡時間單因素實驗
分別稱取10 g毛蒴粗粉末5份，於圓底燒瓶中，加入「2.1.3.1」項下質量提 取率最高的體積比的水，浸泡0.5 h、l h、1.5 h、2 h、2. 5 h，固定提取溫度，提取時間為 「2. 1. 3. 3」項下質量提取率最高的時間，提取「2. 1. 3. 2」項下質量提取率最高的次數，考察 藥材浸泡時間對質量提取率的影響。每一條件重複3次，取平均值。2. 1. 4、提取工藝正交實驗
在單因素實驗的基礎上，以料液比(A)、浸泡時間(B)、提取次數(C)、提取時間(D)為考 察因素。以質量提取率為指標，選用L9 (34)正交表根據「2. 1.2」項下的方法安排實驗進行 提取。每一水平重複3次，取其平均值。採用直觀分析方法，根據極差大小和方差分析確定 影響提取因素的主次順序。正交實驗因素水平，如表1所示。表1提取正交實驗因素水平表
注質量提取率=冷凍乾燥後提取物粉末質量/毛蒴粗粉末質量X100% 2. 1. 5、提取工藝參數的驗證實驗
準確稱取毛蒴粗粉末10 g各3份，用「2. 1.4」優選出來的最佳提取工藝參數照 「2. 1. 2」項下的方法進行重複性實驗3次，分別計算質量提取率，以此來驗證提取工藝的穩 定性和可行性。2. 1. 6、毛蒴總提取物的製備
10.0 Kg，粉碎，用1 :30體積比的蒸餾水浸泡2 h，冷凝回流3次，每次回流時間為2 h， 真空抽濾後合併濾液，減壓濃縮後冷凍乾燥，得得毛蒴總提取物(以下簡稱總提物)。2. 1. 7、毛蒴總提取物的分離 2. 2、取提物定性實驗
(1)胺基酸、多肽、蛋白質的定性檢測 ①茚三酮(Ninhydrin)實驗
分別取總提液2 mL於試管中，加試劑3飛滴，在沸水浴上加熱5 min，冷卻後有藍色 或藍紫色出現。以乙醇液為對照，同法進行操作。②雙縮脲(Biuret)反應
分別取總提液2 mL於試管中，加入試劑，搖動，冷卻時候顯綠色一紫紅色。以乙醇液為 對照，同法進行操作。(2)生物鹼的定性檢測①碘_碘化鉀(Wagner)實驗
分別取總提液2mL於試管中，加入試劑，生成棕色沉澱。以乙醇液為對照，同法進行操作。②碘化汞鉀(Mayer )實驗
分別取總提液2 mL於試管中，加入試劑，生成紅棕色沉澱。以乙醇液為對照，同法進行 操作。③苦味酸試劑
分別取總提液2 mL於試管中，加入試劑，生成棕黃色沉澱。以乙醇液為對照，同法進行 操作。(3)留體或三萜類的定性檢測 ① Liebrmann-Burchand 反應
分別取總提液0.5 mL懸浮於1 mL醋酐中，沿試管壁緩慢滴加1 mL濃硫酸，溶液逐 漸呈紫紅色。以乙醇液為對照，同法進行操作。(4)黃酮的定性檢測 ①鉛鹽反應
分別取總提液2mL於試管中，加入試劑，生成棕黃色沉澱。以乙醇液為對照，同法進行 操作。②三氯化鋁_乙醇實驗
分別取總提液2mL於試管中，加入試劑，充分振搖，於365 nm下呈現明顯綠色或黃綠色 螢光。以乙醇液為對照，同法進行操作。(5)皂苷的定性檢測 ①泡沫實驗
分別取總提液2 mL於試管中，充分振搖，產生蜂窩狀泡沫，10 min不退，加入少量95% 乙醇泡沫也無明顯減少。以乙醇液為對照，同法進行操作。(6)多糖、還原糖及糖甙的定性檢測 ①α-萘酚試劑反應
分別取總提液2 mL於試管中，加入5% α-萘酚乙醇溶液3飛滴，充分振搖，再沿試管 壁緩慢滴加0.5 mL濃硫酸，在試液與濃硫酸交界處形成紫色環。以乙醇液為對照，同法進 行操作。②費林(Fehling)試劑反應
分別取總提液2 mL於試管中，加試劑3飛滴，充分振搖，在沸水浴上加熱5 min，有磚 紅色沉澱生成。以乙醇液為對照，同法進行操作。③多糖實驗
分別取總提液2mL於試管中，分加入一倍量的95%乙醇，出現絮狀懸浮物或沉澱。以蒸 餾水為對照，同法進行操作。(7)香豆素及萜類內酯化合物的定性檢測 ①開環閉環反應
分別取總提液1 mL於試管中，加入1%氫氧化鈉溶液2 mL在沸水浴上加熱;Γ4 min, 再加入2%鹽酸酸化，放置一段時間液體出現渾濁或沉澱。以乙醇液為對照，同法進行操作。
(8)酚類和鞣質的定性檢測 ①氯化鈉_明膠試劑反應
分別取總提液各2mL於試管中，加入試劑，出現白色沉澱。以乙醇液為對照，同法進行 操作。②三氯化鐵試劑反應
分別取總提液2 mL於試管中，滴加纊3滴醋酸酸化，搖勻，再加入試劑，呈藍或墨綠 色。以乙醇液為對照，同法進行操作。表2定性檢測實驗現象
2. 3定性檢測結果
總提物、水洗物、醇洗物初步定性實驗結果見表3。
表3定性實驗結果
、結論
(1)本實驗採用水提法進行提取，在提取工藝中，設置提取時間、提取次數、浸泡時間 和料液比四個參數，先對這四個參數進行單因素實驗，確定正交實驗方案，優化最佳工藝參 數，即料液比1 :30，浸泡2 h，提取3次，提取時間為3 h，在此組工藝參數水平下平均質量 提取率為27. 31%。(2)對提取物進行了初步定性檢測。提取物中含有胺基酸、多肽、蛋白質、生物鹼、 甾體或三萜類、黃酮、皂苷、多糖、還原糖及糖甙、香豆素及萜類內酯化合物、酚類和鞣質成 分。二、毛蒴提取物藥效測定
本實驗通過觀察毛蒴提取物對CCL4誘導的急慢性肝損傷動物模型的防治作用，並探索 其作用機制，從而為毛蒴提取物用於肝損傷的開發研究提供基礎藥理學依據。1、實驗材料
1.1、主要儀器721型紫外-可見分光光度計(上海申化儀表自控公司)，-80 ° C低溫 冰櫃(日本三洋公司),Milli QA純水處理器(Mi 11 ipore公司)，3K30型高速冷凍離心機(德 國Sigma公司)，BSS — 110電子分析天平(北京賽多利斯電子天平有限公司)，SHHW電熱恆溫 三用水浴鍋(北京永光明醫療儀器廠)，Leica細胞圖像儀(德國Leica Microsystems Ltd)寸。1.2、試劑和藥品=CL4分析醇(重慶市九龍化學試劑廠)，花生油，考馬斯亮蘭、牛 血清白蛋白(Solarbio 公司)，TNF-a (ELISA)試劑盒(Biotechnology systems)，丙二酸 (MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試盒(南京建成生物工程研究所)。1.3、實驗動物
昆明種小鼠，雌雄兼用，清潔級，體重20-22 g，由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心 提供，許可證號=ScxK (渝)2007-0005。飼養環境安靜，室溫22-23 ° C，光照/暗時間為 12/12 h循環，各組實驗小鼠自由進食、飲水。2、實驗方法
2. 1、對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠模型的影響2. 1. 1、實驗分組和給藥和制模
取小鼠60隻，隨機分成6組，空白對照組、模型組、毛蒴總提取物低劑量組、高劑量 組；水洗物低、高劑量組；醇洗物低、高劑量組；陽性藥組。小鼠每天上午分別灌胃濃度為 0. 5g/kg、1. Og/ kg的毛蒴提物物(0. lml/10g,)，陽性藥組0. 15g/ kg,為空白對照組及肝 損傷模型組小鼠均灌胃蒸餾水0.1ml/ IOg，每天1次，連續7d。末次給藥後2h，除空 白組，其餘各組小鼠均腹腔注射0. 15%四氯化碳花生油溶液IOml/ kg，造模24h後眼眶 取血，分離血清；小鼠取血完畢，將其拉頸處死，迅速取出肝臟，用預冷的生理鹽水漂洗3-4 次去除積血，剪除結締組織及脂肪，於濾紙上拭乾水分，稱重；取小鼠肝組織左葉相同部位， 用10%中性福馬林溶液固定，餘下的肝臟留存於EP管中，置於一 80°C冰箱保存用於後述 製備肝勻漿測定相關指標。稱取肝臟和體重，計算肝臟系。2. 1. 2、小鼠肝臟溼重指數的測定
小鼠處死前稱重，處死後取出肝臟，稱重，肝臟指數=肝臟重(g)/小鼠體重 (g) X 100%
2. 1. 3、血清ALT、AST的測定
取製備好的血清採用全自動生化分析儀進行ALT、AST檢測。2. 1.4、肝臟組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定。稱取肝組織塊O。3 0. 5 g放入10 mL的小燒杯裡加入預冷的生理鹽水，研磨製 成10%的肝組織勻漿。低溫高速離心機3000 r/min離心10 min，吸取上清液，待檢。2. 1. 4. 1、肝勻漿蛋白含量的測定
10%肝組織勻漿液用生理鹽水稀釋成1%，用移液槍吸取此稀釋液200 ml於5mL具 塞試管中，加入0. 1 mg/mLBrandford顯色劑4.0mL，用漩渦混勻器混勻，以蒸餾水同法為空 白，在室溫放置5 min後在595 nm處測定吸收度值，代入回歸方程計算蛋白含量。2. 1. 4. 2、肝組織丙二醛含量的測定
原理MDA可與硫代巴比妥酸結合，形成紅色產物。此紅色產物在532 nm處有最大吸 收峰。取10%的肝組織勻漿，按表4的步驟加樣 表4肝勻漿蛋白含量的測定
旋渦混勻器充分混勻，95°C水浴40 min，取出後流水冷卻，然後3500 r/min，離心10 min，取上清液，532 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測各管OD值。根據下列公式計算 MDA 值。 MDA (nmol/mgprot)=(測定管OD值一標準空白管OD值)/ (標準管OD值一標準 空白管OD值)X標準管溶度(nmol/mL)/樣品蛋白含量(mg/mL)。
2. 1. 4. 3、肝組織總超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定
原理超氧化物歧化酶對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽 減少，而亞硝酸鹽在顯色劑作用下呈現紫紅色，可測定吸光度求出其活力。實驗前按照試劑五試劑六冰乙酸=3 3 2的體積比配製顯色劑，4°C避光冷藏。 取10%的肝組織勻漿，按表5的步驟加樣
表5肝組織總超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定
混勻，室溫放置10 min,于波長550nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，比色。根據下列公式計算SOD值。
SOD (U/mgprot)=(對照管OD值一測定管OD值)/對照管OD值/50%X反應液總體 積/取液量(mL) /樣品蛋白含量(mg/mL)。2. 1. 5、TNF-a 含量的測定
TNF-a ELISA試劑盒檢測靈敏度為13.0 pg/mL。TNF_a標準品濃度為2000 pg/mLU000 pg/mL、500 pg/mL, 250 pg/mL、125 pg/mL,62. 5 pg/mL, 31. 2 pg/mL，據吸光度(OD)值繪製 出標準曲線，以(OD)值對濃度進行回歸得回歸方程為Y=1301.9X — 60. 64，R=O. 9970。具 體測定步驟如下
(1)從一80°C冰箱中取出血樣，用前融解；
(2)從密封條中取出酶標板條；
(3)每孔中加入稀釋液100ml ；
(4)每孔中加入標準品液、對照液或樣本液100ml，室溫下(25°C)在震蕩器上孵育2 h ；洗板4次；
(5)每孔加入200ml conjugate (酶結合物)，室溫下震蕩器上孵育2 h ；洗板4次；
(6)每孔加入200ml Substrate solution (底物液)，室溫下孵育30 min，注意避光；
(7)每孔加入100ml終止液，30 min內，在450 nm讀取光密度(0D)。據標準曲線得 TNF-a 樣品濃度(pg/mL)。2. 1. 6、肝臟組織的病理學檢測
將固定於10 %中性福馬林溶液中的肝臟取出，然後用流水衝洗24 h，各級酒精逐級 脫水和二甲苯透明。常規石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin, H. Ε.) 染色。
2. 2、對D-半乳糖胺誘導的急性肝損傷小鼠模型影響
分組與給藥方法同上，造模的方法為腹腔注射6. 5% D-半乳糖胺溶液10ml/ kg，造模
1024h後眼眶取血，分離血清，測定ALT、AST測定，計算肝臟係數。2. 3、對酒精誘導的急性肝損傷小鼠模型的影響
分組與給藥方法同上，造模的方法是每天下午灌胃給予56度的北京二鍋頭 0. lml/10g,連續7d。造模24h後眼眶取血，分離血清，測定ALT、AST和計算肝臟係數。2. 4、對CCL4誘導的慢性肝損傷大鼠模型的影響
2. 4. 1、實驗分組和給藥SD大鼠80隻，雌雄兼有，體重180 士 10g，飼養溫度18 25°C， 在實驗環境下餵養一周後，將大鼠隨機分為6組，每組10隻，即空白對照組、模型組、毛蒴 提物低、中、高劑量組，陽性對照組。每天上午分別灌胃濃度為0. 7g/kg、l. 4 g/kg、2. 8 g/kg 的毛蒴水提物2. 0ml/100g,醇提物低、中、高給藥組每天上午分別灌胃濃度為0. 7g/kg、l. 4 g/kg,2. 8 g/kg的毛蒴醇提物2. 0ml/100g，空白對照組及模型組每天均灌胃蒸餾水20ml/ kg,陽性對照組每天灌胃聯苯雙酯100mg/kg.
2.4. 2、模型製作實驗第1天，除空白對照組外其餘各組均皮下注射40% CCL植物油 溶液5ml/kg，以後每隔3 — 4天皮下注射3ml/kg。各組均在造模同時開始，連續45天。於 第45天用2%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉後處死動物，檢測指標。2.4. 3、生化指標測定
在全自動生化分析儀上測定血清AST，ALT活性；用黃嘌呤氧化酶法測定組織SOD活 性，用硫代巴比妥酸法測定肝組織中MDA含量，肝組織中蛋白含量以考馬斯亮藍法測定， 所有的測定方法按試劑盒說明進行。2. 4. 4、病理組織切片觀察
取大鼠相同部位肝組織，用10%的福馬林溶液固定，石蠟包埋切片，常規HE染色， 光鏡下觀察肝組織病理學變化。2. 5、數據的統計分析
實驗數據用SPSS13.0統計軟體統計，所有數據以(Mean 士 SE)表示，多組間比較採 用ONE-WAY ANOVA處理，方差齊使用LSD法，方差不齊Games-Howell法，/7 <0. 05有統計學
眉、ο 注#P <0. 05, VS control group ； *P <0. 05 VS model group ； **P <0. 01 VS model group3. 1. 2.毛蒴提取物對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠血清的ALT、AST顯著升高(P < 0. 01)；與模型組比較， 陽性對照組、提物低、高劑量組均顯著降低升高的ALT ( P<0.05，P<0.01)。結果見表7。
表7毛蒴提取物對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠肝組織中 ALT 和 AST 的影響(Mean 士 SE)
注少 <0.05，VS control group ；務P <0.05 VS model group ； ； ^P <0.01 VS model group
3. 1. 3、毛蒴提取物對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠肝臟病理變化的影響 顯微鏡下可見，正常組小鼠肝細胞排列整齊，無水腫、壞死、無炎症細胞浸潤等病理改 變；模型組部分肝小葉結構欠清、肝細胞瀰漫性氣球樣變，可見散在小灶性壞死伴炎細胞浸 潤，提示造模成功。提物高、低劑量組肝細胞結構較正常，肝組織輕度水腫。光學顯微鏡下 觀察肝細胞結構、變性、壞死、炎症反應等病理改變。
3. 1.4毛蒴提取物對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠肝組織中MDA含量、SOD活性的影 響與空白對照組比較，肝損傷模型組MDA含量明顯升高(P<0. 01)，SOD活性明顯降低(P <0.01)；與模型組比較，提物高、低劑量組均能顯著降低肝勻漿MDA含量(P <0.01) ；SOD活 性均明顯升高(P <0.01)，結果見表8。 表8毛蒴提取物對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠肝組織中
MDA含量和SOD活性的影響(Mean士SE) 士SE)
注 fP <0. 05, VS control group ； ^P <0. 05 VS model group ； ^P <0. 01 VS model group
3. 1. 5、毛蒴提取物對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠血清中TNF-a的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-a含量顯著升高0.01)；與模型組比 較，提物高、低劑量組組小鼠血清中TNF-a含量均明顯降低。結果見表9。
表9毛蒴提取物對CCL4誘導的急性肝損傷小鼠血清中 TNF-a 的影響(Mean 士 SE)
注 ，P <0. 05, VS control group ； ^P <0. 05 VS model group ； ^P <0. 01 VS model group
3. 2、毛蒴提取物對D-半乳糖胺肝損傷小鼠血清ALT、AST和肝臟係數的影響 從表10結果可見，用D-半乳糖胺處理誘導的急性肝損傷的小鼠模型，其血清ALT、AST 顯著高於空白組(P<0. 01);用毛蒴水提取物防治的小鼠，低、中劑量組AL T、AST值明顯 低於肝損傷模型組(P <0. 05),高劑量組ALT、AST值也明顯低於肝損傷模型組(P0. 05)。結果見表10。
表10毛蒴提取物對D-半乳糖胺肝損傷小鼠血清ALT、AST 和肝臟係數的影響(η=10，χ 士s)
注與空白組比較**P < 0. 01 ；與肝損傷模型組比較# P < 0. 01 3. 3、毛蒴提取物對酒精所致肝損傷小鼠血清ALT和肝臟係數的影響 從表11結果可見，用酒精處理導致肝損傷的小鼠，其血清AL T顯著高於空白組(P <0. 01)；毛蒴提取物預處理的小鼠，低劑量組其ALT值明顯低於肝損傷模型組(P <0. 05 )，中、高劑量組其ALT值明顯低於肝損傷模型組(P 0· 05)，結果見表11。
表11毛蒴提取物對酒精肝損傷小鼠血清ALT和肝臟係數的影響(η=10，χ 士s)
注與空白組比較*P < 0. 05;與模型組比較# P < 0. 05 3. 4、毛蒴提取物對CC14致慢性肝損傷大鼠模型的的影響 3. 4. 1、毛蒴提取物對CC14致慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST活性的影響 實驗結果表明，模型組大鼠血清中ALT、AST活性明顯高於正常組(P < 0.05 P < 0. 01)，與模型組比較，毛蒴提物各劑量組(0.25、0.5、1.0g/kg)均能明顯降低大鼠血清ALT 、AS 活性(P < 0. 05，P < 0. 01)，結果見表 12。
表12毛蒴水提物對CC14致慢性肝損傷大鼠血清AST和ALT 活性的影響(η = 8，χ 士 s)
注與模型組比較Ρ<0.05，與空白對照組比較P<0. 01 3. 4. 2、毛蒴提取物對CC14致大鼠慢性肝損傷肝組織病理學的影響 病理觀察結果表明，正常對照組小鼠肝組織結構正常，無變性、壞死等病理改變，而 CCl4模型組小鼠肝組織結構光鏡下可見肝細胞不同程度的變性與壞死，纖維組織明顯增生 並包膜成肝細胞團塊，其中肝細胞脂肪變性，部分肝細胞有氣泡樣變，部分肝細胞核大，深 染，核分裂像易見等炎性細胞浸潤，而毛蒴水提物各劑量組的肝細胞壞死，變性及炎性細 胞浸潤程度均明顯減輕。結果發現毛蒴水提物對CC14致大鼠慢性肝損傷肝組織病理學損 傷均明顯的改善作用。4、結論
結果表明，毛蒴提取物對CCL4,酒精，D-半乳糖所誘導的急性肝損傷，CCL4所致的慢性 肝損傷均具有防治作用，其機制與抗氧化，抑制TNF-a產生有關；對CCL4誘導慢性肝損傷具 有防治作用。本發明將毛蒴提取物應用在治療或預防急慢性肝損傷的藥物中，通過一些列的藥 效試驗，充分證明了它在治療或預防急慢性肝損傷中的療效。本發明具有材料來源廣泛，成本低廉，副作用小等優點。


附圖1為本發明的提取工藝流程圖； 附圖2為本發明的分離工藝流程圖。
具體實施例方式本發明的實施例1 稱取IOOOg毛蒴乾燥粗粉，按1:30的料液比(質量比)加入蒸 餾水，浸泡2小時後，在固定提取溫度，提取時間為2 h的條件下，對物料進行加熱提取；在 加熱結束後，趁熱真空抽濾，收集濾液；向提取後的殘渣中繼續加入蒸餾水至初始料液比， 然後再次進行加熱回流提取，提取3次後，同樣趁熱真空抽濾，合併濾液；將濾液減壓回收 溶劑，濃縮至膏狀，放置於冷凍乾燥機乾燥得毛蒴總提取物。將毛蒴總提取物進行分離，採用D-101大孔樹脂，將其進行酸、鹼處理，得到大孔 樹脂填裝，再將大孔樹脂填裝進行醇、水處理，得到待用大孔樹脂；將上一步驟中得到的毛 蒴總提取物溶解、離心，得到總提物上清液；將總提物上清液緩慢加入待用大孔樹脂內進 行水洗脫；將水洗脫畢後的水洗液減壓回收溶劑，得到水洗浸膏，再將該水洗浸膏冷凍乾燥 後，即得到毛蒴水提物；另外，將水洗脫畢的餘下物進行醇洗脫，將得到的醇洗液減壓回收 溶劑，得到醇洗浸膏，將該醇洗浸膏冷凍乾燥後，即得到毛蒴醇提物。將該毛蒴水提物與賦形劑(澱粉、玉米漿、硬脂酸鎂)分別以質量比1 :1、1 :2及1 3的比例，按常規粒片劑方法製成粒壓片。本發明的實施例2 將該毛蒴醇提物與填料輔劑(澱粉、硬脂酸鎂)按常規硬膠囊制 劑方法製成膠囊。本發明的實施例3 將該毛蒴水提物溶解於2mL丙二醇中，再通過微孔濾膜過濾， 所得溶液在無菌條件下裝入安剖瓶中。
1權利要求
一種毛蒟提取物在製備治療或預防急慢性肝損傷藥物中的應用，其特徵在於將毛蒟提取物應用在製備治療或預防急慢性肝損傷藥物中。
2.根據權利要求1所述的毛蒴提取物在製備治療或預防急慢性肝損傷藥物中的應用， 其特徵在於毛蒴提取物包括毛蒴水提物及毛蒴醇提物。
全文摘要
本發明公開了一種毛蒟提取物在製備治療或預防急慢性肝損傷藥物中的應用。本發明將毛蒟提取物應用在治療或預防急慢性肝損傷的藥物中，通過一系列的藥效試驗，充分證明了毛蒟在治療或預防急慢性肝損傷中的療效。本發明具有材料來源廣泛，成本低廉，副作用小等優點。
文檔編號A61P1/16GK101926851SQ20101027639
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月9日 優先權日2010年9月9日
發明者劉傑, 吳芹, 楊豔, 石京山, 龔其海 申請人:遵義醫學院