擴繁植物雄性不育系的高效種子標記方法
2024-02-29 00:39:15
專利名稱:擴繁植物雄性不育系的高效種子標記方法
技術領域：
本發明涉及一種擴繁植物雄性不育系的新方法，該方法利用細胞核雄性不育基因、控制籽粒特殊形狀(如大小、長短、寬窄、薄厚等)基因及轉基因技術擴繁植物雄性不育系，屬於植物遺傳育種及種子生產領域。
背景技術：
由於雜種優勢的存在，使得雜交種的生物量、抗病蟲能力、耐脅迫(乾旱、高溫、低溫、鹽鹼等)能力較其雙親有相當的提升，如雜交玉米、雜交水稻的產量遠遠高於純合的雙 親。生產雜交種通常採用的方法為將雌性親本和雄性親本種在一起，將雌性親本的雄穗去除，而保留雄性親本的雄穗，雌性親本收穫的種子即為雜交種。
自然界中的植物存在自花授粉、異花授粉及常異花授粉三種類型，自花授粉指一株植物的花粉，對同一個體的雌蕊進行授粉的現象。在兩性花的植物中，又可分為同一花的雄蕊與雌蕊間進行授粉的同花授粉(菜豆屬)和在一個花序(個體)中不同花間進行授粉的鄰花授粉，以及同株不同花間進行授粉的同株異花授粉。有的植物雄蕊和雌蕊不長在同一朵花裡，甚至不長在同一棵植株上，無法自花授粉，它們的雌蕊只能得到其他花的花粉，這叫做異花授粉。將天然雜交率高於50%且自交衰退的一類作物歸為常異花授粉作物，如玉米。
玉米為雌雄同株，並且雌雄花位於植株的不同部位，玉米既可通過自花授粉也可通過異花授粉繁衍後代，自然條件下，當風將花粉從雄穗吹到雌穗的花絲上時即完成了天然授粉。
在玉米育種中首先應開發出純合的玉米自交系，然後將兩個自交系進行雜交，對雜交的後代進行產量、抗逆性等進行評估，以確定其是否具有商業化潛力。其中每個自交系都可能具有另一個自交系所缺乏的一種或多種優良性狀，或補充另一個自交系的一種或多種不良性狀。兩個自交系雜交的第一代種子為Fl代種子，Fl代的種子發芽後獲得Fl代植株，Fl代植株較兩個自交系親本(父母本)更健壯，同時擁有更多的生物量。
可以通過對母本人工去雄來生產雜交種，即將未散粉的母本(其可與父本在田間間隔播種，如播種5行母本，一行父本)雄穗去除，保留父本雄穗。隨後，只要對外來玉米花粉進行隔離，母本雌穗只能接受父本的花粉，得到的種子即為雜交種(Fl)，該雜交種即可用於農業生產。
在生產雜交種的過程中由於環境的變化可能導致去雄完成後植株又雄穗化，或去雄不完全，以上兩種情況均能導致母本自交授粉，致使生產的雜交種中混雜了母本自交系的種子，母本自交系的產量遠低於雜交種的產量，這樣的種子為不合格產品，即會影響農民收入又會影響制種公司信譽，嚴重的將導致制種公司承擔相應的賠償責任。
也可採用機器對母本進行去雄，機器去雄和手工去雄的可靠性基本相同，但更快並且成本更低。然而，較之手工去雄，大多數去雄機器會對植株造成更大的破壞，因此，目前沒有令人完全滿意的去雄手段，人們仍在尋找成本更低，去雄更徹底的替換方法。[0009]穩定的雄性不育系統提供了簡單高效的手段，通過使用核-質互作雄性不育(CMS)自交系，可以在一些基因型中得以避免繁重的去雄工作。該手段包括三個主要材料，即不育系雄性不育材料，保持系可以為不育系提供花粉，使不育系的後代仍為不育系，恢復系可以恢復不育系的育性。不育系與恢復系雜交產生F1，即用於農業生產的雜交種。更具體的說，核-質互作不育型，表現為核-質互作遺傳。不但需要細胞質有不育基因S，而且需要細胞核裡有純合的不育基因(rfrf)，二者同時存在，方能使植株表現為雄性不育。如胞質基因為可育N，則不論核基因是可育(RfRf)還是不育(rfrf)，都表現為雄性可育。同樣，如核裡具有可育基因(RfRf)或(Rfrf)，則不論胞質基因是可育N還是不育S，也都表現為雄性可育。這種由核-質互作形成的雄性不育系，其遺傳組成為S(rfrf)，不能產生正常的花粉，但可作為雜交母本。由於能找到保持系N(rfrf)[用它與不育系雜交，所產生的Fl仍能保持雄性不育，即S(rfrf)(早)XN(rfrf) — S (rfrf)(不育)]並能接受恢復系S(RfRf)或N(RfRf)[用它們與不育系雜交，所產生的Fl都是可育的，S卩S(rfrf)(早)X S (RfRf) — S (Rfrf) (Fl)(可育)，或 S (rfrf)(早)XN(RfRf) — S (Rfrf) (Fl)(可 育)]的花粉，使Fl恢復為雄性可育，Fl植株自交產生F2，所以在農業生產上可以廣泛應用。雄性不育系可以免除人工去雄，節約人力，降低種子成本，還可保證種子的純度。目前水稻、玉米、高粱、洋蔥、蓖麻、甜菜和油菜等作物已經利用核質互作雄性不育進行雜交種子的生產；對其他作物的核_質互作雄性不育系，也正在進行廣泛的研究。
CMS也有它的缺陷，一是觀察到個別CMS材料容易感病，二是恢復系比較難尋找，這些問題阻礙了 CMS系統在制種中的廣泛應用。
Brar et al的美國專利4654465和4727219中公開了一種類型的遺傳不育性。但是，這種類型的遺傳不育需要在基因組內的多個不同位點保持相應的基因型，需要每代對這些位點進行分子標記跟蹤檢測。Patterson還描述了一種可能有用的染色體易位基因系統，但該系統更為複雜(見美國專利No. 3861709和3710511)。
人們一直在嘗試對雄性不育系統進行優化,例如,Fabijanski,et al.開發了使植物雄性不育的方法(EP0 89/3010153. 8公開號329308和作為WO 90/08828公開的PCT申請PCT/CA90/00037)。主要是通過以下兩種途徑抑制植株的雄花育性，一種方法是將雄性組織特意表達的啟動子與細胞毒素基因相連轉入植株中，使雄花不能正常散粉同時不影響其他性狀；另一種是通過基因幹擾手段，將已經克隆的控制植株雄花育性的基因通過轉基因的手段將其幹擾，從而使其不能正常行使功能。還有通過一些基因調控元件來抑制基因表達，從而影響植株育性的手段(W090/08829)。
在多數情況下，只有控制雄性不育的核基因隱性純合(msms)植株才會表現為雄性不育，由於雄性不育植株無法自交，因此只能通過雜合植株(Msms)與其雜交，才會得到雄性不育植株(msms)。並且在同一果穗上雄性不育籽粒(msms)與可育的雜合籽粒(Msms)同時存在，通過籽粒無法分辨哪些是不育籽粒，哪些是可育籽粒，只能通過播種後，植株散粉時才可分辨。
近年來，也有利用轉基因的手段來保持雄性不育植株的不育性(US6743968)。該方法將花粉致死基因與雄性生育能力恢復基因構建在一個載體中，導入雄性不育植株中，轉基因後代表現為可育，但只能產生不含恢復基因的花粉。當這樣的植株與雄性不育植株雜交，便保持了隱性不育植株的純合隱性狀態。其首先構建一個轉基因載體，該載體含有一個花粉細胞致死基因，同時該載體還含有一個恢復植株育性的顯性基因。將該載體轉入雄性不育植株，並且該載體在轉基因植株中以雜合狀態存在，由於恢復育性基因的存在使得植株可育，當其與雄性不育植株雜交，由於含有恢復基因的花粉(Msms)同時含有致死基因，使得花粉敗育，因此只有不含恢復基因的花粉(ms)才能與雄性不育植株雌配子(ms)進行雜交，後代均為隱性純合個體(msms)。
如前文所述，採用雄性不育系統制種的很多工作的一個重要問題在於如何利用雄性不育基因及如何分辨雄性不育種子及可育種子，同時還需要考慮如何將不育個體的不育性保持下來。
在玉米中已經鑑定了多種雄性不育突變體(Skibbe et al. 2005)，具體見下表
表一由核基因引起的雄性不育突變體
權利要求
1. 一種方法，用於保持雄性不育植株的純合隱性狀態，所述方法包括 (a)提供第一植株，其包含使植物雄性不育的純合隱性等位基因； (b)提供第二植株，該植株包含同第一植株相同使植物雄性不育的純合隱性等位基因，並且含有下述構建體，所述構建體在植株中以雜合狀態存在，所述構建體包含 ·1.第一核苷酸序列，當在第一植株中表達時將恢復其雄性生育力； ii.第二核苷酸序列，當其以雜合狀態存在時即可影響籽粒特殊形狀(如大小、長短、寬窄、薄厚等)，通過肉眼或儀器可以分辨含有該構建體的籽粒和不含有該構建體的籽粒； iii.第一核苷酸序列與第二核苷酸序列緊密相連，這兩個核苷酸序列在植株中同時存在。
(c)用所述第二植株的雄性配子與第一植株的雌性配子受精，以產生保持了所述第一植株純合隱性狀態的後代。
2.—種DNA構建物，該構建物如權利要求
I所述的構建物。
3.—種植物,該植物如權利要求
I所述的第二植株。
4.一種植物，利用權利要求
I所述方法產生的純合隱性的雄性不育植株。
5.利用權利要求
I所述方法產生的純合隱性雄性不育植株在生產雜交種中的用途。
專利摘要
本發明公開了一種高效的種子標記方法，利用該方法可以擴繁植物雄性不育種子，為雜交制種帶來便利。進一步，本發明利用控制植物雄性生育能力、籽粒特殊形狀(如大小、長短、寬窄、薄厚等)的核苷酸序列及轉基因技術，發明了一種高效擴繁植物雄性不育系的新方法。本發明將控制雄性生育能力的野生型核苷酸序列和籽粒形狀的核苷酸序列連在一起轉入常規玉米，然後回交到純合隱性雄性不育系植株，利用獲得的轉基因植株與純合隱性不育系雜交後，可以同時得到大量的不育系和保持系種子。由於控制籽粒形狀核苷酸序列的作用，可以通過籽粒形狀區分不育系和保持系。其中形狀正常的種子為不育系(不含轉基因序列)，形狀異常(如籽粒變小)的種子為保持系。
文檔編號C12N15/63GKCN102960234SQ201210406155
公開日2013年3月13日 申請日期2012年10月23日
發明者賴錦盛, 趙海銘, 宋偉彬, 崔陽 申請人:中國農業大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan