一種抑菌組合物的製作方法

2023-10-07 05:08:44 1

本發明屬於醫藥
技術領域：
，具體涉及一種抑菌組合物。
背景技術：
：抗生素從發現至今，在人類醫療上扮演著十分重要的角色，拯救了無數的生命，並為人類的健康做出了貢獻。但是，由於目前抗生素的廣泛使用和濫用，微生物對抗生素的耐藥性也越來越強，使許多抗生素對微生物的抗感染能力明顯降低，而且長期使用抗生素對人體也有一定的毒副作用。因此必須尋找新的、更有效的抗菌劑。銀是一種銀白色金屬，其對革蘭氏陽性及陰性細菌、真菌具有廣譜的抗菌功能，並具有防止細菌粘附的能力。德國產科醫生Crede在1884年把濃度1％的硝酸銀溶液滴入新生兒眼中預防新生兒結膜炎，使嬰兒的失明率從10％降至0.2％。直到今天為止，許多國家仍在使用Crede預防法。20世紀60年代，Moyer將0.5％硝酸銀溶液用於燒傷的治療，使含銀藥物再次得到應用。近幾十年國內外的科學家的研究表明一定濃度的銀離子對各種細菌、病毒、真菌等微生物均有廣泛的殺滅作用。銀的另一形態——銀納米，是國內外研究人員目前關注的熱點之一。它是一類新型抗菌劑，具有廣譜抗菌、無耐藥性和安全性高的特點。國內外研究人員研製出的相應的銀納米產品已應用於各領域。隨著抗生素耐藥性的日益嚴重，銀納米在消毒殺菌領域的研究和應用越來越受到了廣泛關注，成為極具發展前景的一代抗菌藥物。研究表明，銀納米具有殺菌作用是銀納米粒子所釋放的銀離子和納米效應共同作用的：1.銀離子擾亂細菌內部的代謝活動，代謝酶中二硫鍵的合成，使細菌的代謝酶失去活性；增加活性氧的產生，阻礙呼吸鏈中Fe-Sclusters的生成；2.銀離子與細菌細胞壁上肽聚糖反應，同時銀納米通過納米效應幹擾細胞壁的組成的化合鍵的鍵能，使細胞壁更易斷裂；3.銀納米進入細菌內部，可幹擾DNA合成，抑制其轉錄。雖然銀離子和銀納米殺菌作用較強，但最新研究表明，它們的毒副作用也不容忽 視。銀離子由於處於離子狀態更容易進出細胞，而銀納米也可以通過細胞的內吞和向外釋放作用，穿過一些特定細胞組成的生理屏障，對該部位的組織及細胞造成損傷。因此，為解決上述技術問題，確有必要提供一種抗菌方案，在不影響抗菌效果的同時又降低銀或銀納米使用濃度。聯合用藥是目前臨床上最簡便易行的克服細菌耐藥性的策略之一，聯合用藥的理論優勢：不同藥物作用於細菌代謝不同階段；作用於不同分子靶位；使得抗菌效果大大高於單藥，從而可以減少單藥劑量，並減少毒副作用、減少耐藥發生。例如，中國專利CN101394741B中，涉及一種抑黴唑和銀化合物的組合，其提供改善的殺生物作用，用於保護所有有生命的或無生命的材料。但並不是任何兩種抗菌物質組合起來都能有更好的效果，常用於聯合用藥評價的指標是協同指數，只有協同指數在一定範圍內時，才被認為具有聯合用藥的可能性。而銀元素可以與哪些抗生素聯合使用、聯合使用的劑量範圍、以及對於哪些微生物具有比較優異的滅殺效果等問題，迄今為止還沒有很明確的研究結果。技術實現要素：本案發明人通過將銀化合物和銀納米分別與多種不同的抗生素聯用，考察其對於不同微生物的抗菌活性，結果發現，當銀化合物或銀納米與多黏菌素B聯用時，對於抗鮑曼不動桿菌(Ab)具有較為明顯的協同增效作用，因而可以顯著降低銀和多黏菌素B的用量，使得銀可以被用於體內使用，對於新抗菌藥物的開發具有重要意義。因此，本申請的第一個目的在於提供一種抑菌組合物，可以減少抗生素和銀的單藥劑量，從而減少毒副作用，減少耐藥發生等。一種抑菌組合物，其主要成份為抗生素和銀，其中，所述抗生素為多黏菌素B，所述銀包括銀化合物和銀納米。根據本發明，所述銀納米與多黏菌素B的重量比為40:1～5:4。優選的，所述銀納米與多黏菌素B的重量比為20:1～5:2。根據本發明，所述銀化合物為硝酸銀。進一步的，所述硝酸銀與多黏菌素B的重量比為80:1～5:4。優選的，所述硝酸銀與多黏菌素B的重量比為40:1～5:2。本發明的第二個目的，在於提供所述抑菌組合物用於製備治療鮑曼不動桿菌引起的感染的藥物的應用。根據本發明的優選實施例，所述藥物的劑型優選為注射劑。根據本發明，所述注射劑還包括注射用水和輔料，所述包括輔料為胺基酸、甘露醇、PVP。本發明運用水相檸檬酸三鈉-硼氫化鈉還原法製備銀納米Ag-cit，運用PVP穩定乙醇還原法製備銀納米Ag-PVP，本發明的銀化合物選用硝酸銀。本發明採用微量稀釋法測定藥物敏感性，評價銀化合物或銀納米和多黏菌素B的抑菌組合物抗鮑曼不動桿菌的抑菌活性。相較單獨銀化合物、銀納米或多黏菌素B的抗鮑曼不動桿菌，本發明具有如下優點：1、銀化合物或銀納米與多黏菌素B聯用對鮑曼不動桿菌具有協同效應，可以減少多黏菌素B、銀化合物或銀納米對鮑曼不動桿菌的單藥劑量，從而減少毒副作用，減少耐藥發生。2、銀化合物或銀納米與多黏菌素B聯用在體內增強了殺菌效果，同時，可大大減少體內活菌量。3、本發明將銀化合物或銀納米與多黏菌素B製成抑菌注射劑，具有抑菌效果好、成本較低等諸多優點，其對鮑曼不動桿菌有較強抑制作用。4、降低銀化合物或銀納米使用濃度，進一步提高銀化合物或銀納米作為抑菌注射劑的安全性。附圖說明圖1為Ag-PVP的TEM圖；圖2為Ag-PVP粒徑分布圖；圖3為Ag-cit的TEM圖；圖4為Ag-cit粒徑分布圖；圖5為銀納米、硝酸銀與PMB聯用對小鼠腎臟帶菌的抑菌效果圖；圖6為銀納米、硝酸銀與PMB聯用對小鼠肺帶菌的抑菌效果圖；圖7為銀納米、硝酸銀與PMB聯用對小鼠血液帶菌的抑菌效果圖；圖8為銀納米、硝酸銀與PMB聯用對小鼠腹水帶菌的抑菌效果圖。具體實施方式以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本發明而非用於限制本發明的範圍。實施例2和實施例9均採用具有耐碳青黴烯類抗生素的鮑曼不動桿菌(華山醫院aba1604)作為測試菌；實施例2～9的銀納米均為採用實施例1的方法合成的銀納米。實施例1銀納米的合成Ag-PVP合成：將稱取的0.78gPVP和49mL無水乙醇加入三頸圓底燒瓶中，超聲充分混勻，置於70℃油浴中，同時，磁力攪拌器攪拌溶液，15min後緩慢加入1mL的1％AgNO3溶液，保持70℃加熱120min。待反應液冷卻至室溫，此時溶膠的顏色呈橙黃色。TEM檢測，圖1為此方法製備的銀納米的TEM圖，圖2為銀納米粒徑分布，平均粒徑為13nm。Ag-cit合成：將20mL的1％檸檬酸三鈉溶液和75mL水加入三頸圓底燒瓶中，置於70℃油浴中，同時，磁力攪拌器攪拌溶液，15min後加入1.7mL的1％AgNO3溶液，然後迅速添加2mL新配製的0.1％NaBH4溶液。攪拌速度400r/min，反應1小時後結束反應。待反應液冷卻至室溫，加水稀釋至100mL，此時溶膠的顏色呈淺黃色。TEM檢測，圖3為此方法製備的銀納米的TEM圖，圖4為銀納米粒徑分布，平均粒徑為8nm。實施例2銀及多黏菌素B的抑菌實驗1、方法(1)硝酸銀或銀納米和抗生素敏感性測定：先將硝酸銀或銀納米和多黏菌素B分別在滅菌的96空平板上對比稀釋成一系列濃度，硝酸銀濃度分別為50、25、12.5、6.3、3.1、1.6ppm，銀納米濃度分別為25、12.5、6.3、3.1、1.6ppm，多黏菌素B。用接種環挑取生長於LB平板的新鮮菌落置於LB培養基中，37℃孵18h，LB培養基稀釋至0.5麥氏濁度，再稀釋10,000倍，使最終菌液濃度為5×105CFU/mL。將稀釋好的菌液分別移至96孔板內，按不同比例加入稀釋成一系列濃度各樣品。37℃孵育18h，觀察結果，計算抑制率和MIC值。(1)棋盤法測定複方抗菌劑效果聯合藥敏：硝酸銀或銀納米與抗生素按微量LB肉湯稀釋法分別在96孔板縱列和橫列進行稀釋，在每孔含有90μLLB培養基中加入硝酸銀或銀納米抗生素複方抗菌劑10μL，稀釋度根據菌株對硝酸銀或銀納米和抗生素的MIC值結果確定，並隨板留孔做單藥微量肉湯的MIC值測定。將菌株接種至試管中，37℃孵育18h，LB培養基稀釋至0.5麥氏濁度，再稀釋10,000倍，使最終菌液濃度為5×105CFU/mL。37℃孵育18h，觀察結果，計算抑制率，測定MIC值和協同抑制指數(FIC)。2、結果銀化合物或銀納米和多黏菌素B對鮑曼不動桿菌的MIC值範圍結果、以及不同配比下的聯合抑菌效果。表1.銀和多黏菌素B對鮑曼不動桿菌的MIC(ppm)AgNO3銀納米多黏菌素BMIC(ppm)2.51.250.25結論：銀納米對Ab的MIC均為1.25ppm，硝酸銀對Ab的MIC為2.5ppm，多黏菌素B對Ab的MIC為0.25ppm。以下為多黏菌素B與銀聯合抑制鮑曼不動桿菌，多黏菌素B表現出與銀納米或硝酸銀協同抑制鮑曼不動桿菌的作用。其中，FIC≤0.5協同效應；1>FIC>0.5部分協同效應；FIC＝1為相加作用；2>FIC>1無關效應；FIC≥2拮抗效應。表2.銀納米與多黏菌素B聯用優選配比(質量比)研究結論：當銀納米與PMB聯用時，不同配比對鮑曼不動桿菌的活性不同。在40:1～5:4的範圍之內，具有協同或部分協同作用，而在20:1～5:2的範圍之內，具有較強的協同作用。表3.AgNO3與多黏菌素B聯用優選配比(質量比)研究結論：當硝酸銀與PMB聯用時，不同比例對鮑曼不動桿菌的活性不同。在80:1～5:4的範圍之內，具有協同或部分協同作用，而在40:1～5:2的範圍之內，具有較強的協同作用。實施例3注射液製備配方：硝酸銀52g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.5g，甘露醇3.5g，PVP1.5g，共製備1000支。將硝酸銀、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP加入8000ml注射用水中，補加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過濾，滅菌，灌裝。實施例4注射液製備配方：硝酸銀62.5g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.7g，甘露醇3.6g，PVP1.8g，共製備1000支。將硝酸銀、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP加入8000ml注射用水中，補加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過濾，滅菌，灌裝。實施例5注射液製備配方：硝酸銀105g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.8g，甘露醇3.8g，PVP1.7g，共製備1000支。將硝酸銀、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP加入8000ml注射用水中，補加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過濾，滅菌，灌裝。實施例6注射液製備配方：銀納米16g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.5g，甘露醇3.5g，PVP1.5g，共製備1000支。將銀納米、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP和加入8000ml注射用水中，補加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過濾，滅菌，灌裝。實施例7注射液製備配方：銀納米24g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.6g，甘露醇3.7g，PVP1.6g，共製備1000支。將銀納米、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP和加入8000ml注射用水中，補加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過濾，滅菌，灌裝。實施例8注射液製備配方：銀納米31g，多粘菌素B12.5g，甘氨酸1.6g，甘露醇3.8g，PVP1.8g，共製備1000支。將銀納米、多粘菌素B、甘氨酸、甘露醇、PVP加入8000ml注射用水中，補加注射用水至10000ml，加活性炭攪拌，過濾，滅菌，灌裝。實施例9體內抑菌效果評價1、鮑曼不動桿菌小鼠腹腔感染模型建立1.1鮑曼不動桿菌小鼠重度感染模型模型建立：鮑曼不動桿菌置於含LB培養液的試管中，37℃，220rpm培養16h。然後100倍稀釋於新鮮LB培養液中，37℃，220rpm增菌培養3h，生理鹽水稀釋，約5×1011CFU鮑曼不動桿菌注射到小鼠腹腔，小鼠24h死亡。小鼠平均體重為20g。1.2模型建立：腹腔注射500μL1×1011CFU/mL的鮑曼不動桿菌溶液(8％黏蛋白生理鹽水溶液)1.3給藥過程：待模型建立完畢1h後，分別腹腔注射100μL銀納米溶液和硝酸銀溶液，觀察。2、銀納米、硝酸銀的LD50測定健康小鼠腹腔注射100μL銀納米溶液和硝酸銀溶液，測定Ag-PVP、硝酸銀的LD50。銀納米的LD50測定：銀納米溶液濃度為22.431mM，即銀含量為0.2423mg，LD50為12.12mg/kg；硝酸銀LD50測定：硝酸銀溶液濃度為43.285mM，即銀含量為0.4675mg，硝酸銀的LD50為36.79mg/kg。3、銀納米、硝酸銀治療鮑曼不動桿菌小鼠模型劑量確定銀納米、硝酸銀各選用三個治療劑量，分別為高(1/10LD50)、中(1/20LD50)、低(1/30LD50)。小鼠體重按平均每隻20g計。表4.不同銀劑量下小鼠存活比例組與銀納米組在中、低兩個劑量，24h後觀察小鼠存活率均為0％。後續動物實驗中硝酸銀劑量與銀納米劑量選擇在(1/20～1/10)LD50之間。4、銀納米(16.2μg)、硝酸銀(28.9μg)與PMB聯用治療鮑曼不動桿菌感染小鼠模型，16小時後各組小鼠器官帶菌數比較。4.1銀納米、硝酸銀與PMB聯用對小鼠腎臟帶菌的抑菌效果，見圖5。4.2銀納米、硝酸銀與PMB聯用對小鼠肺帶菌的抑菌效果，見圖6。4.3銀納米、硝酸銀與PMB聯用對小鼠血液帶菌的抑菌效果，見圖7。4.4銀納米、硝酸銀與PMB聯用對小鼠腹水帶菌的抑菌效果，見圖8。結論從小鼠各器官帶菌分析，銀與多黏菌素B聯用大大減少了小鼠體內活菌量。可以有效降低銀與多黏菌素B各自的用量。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp