鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法
2023-10-06 19:51:04 1
專利名稱：鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法
技術領域：
本發明涉及鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法，特別涉及用玉米籽粒含油量作為 標記鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法。
背景技術：
玉米是雌雄同株異花、進行有性生殖的作物。玉米育種工作中主要是利用玉米 有性生殖的方式選育玉米自交系、配製玉米組合、繁制玉米雜交種。但是在培育玉 米自交系的過程中，必須經過多代的自交和選擇。通常選育一個品種需要上十年的 時間，需要消耗大量的人力、物力和財力。因此如何縮短育種進程、提高育種效率 是育種家們一直追求的目標。
玉米單倍體是配子體無融合生殖的產物，包括孤雄生殖和孤雌生殖兩大類。對 獲得的單倍體進行人工加倍，只需一個世代就可以獲得純合二倍體，大大縮短育種 時間。自從Guha (Guha S， Maheshwari S C. In vitro production of embryos from anther of Dature[J]. Nature, 1964， 204:497)經過花葯培養單倍體而揭示了通過實驗 途徑可以獲得單倍體後，通過組培途徑選育自交系的方法被認為很有希望的方法。 但是由於花葯培養難度大，技術操作複雜，並且基因型依賴性很強，並且選育出的 自交系不一定是優良的自交系，難以在生產中利用。
孤雌生殖單倍體可以通過生物誘導和非生物誘導如化學誘導等途徑產生，但非 生物誘導的問題與花葯組培一樣存在很多困難，很難在育種上應用。生物誘導是利 用生物誘導材料使誘導對象產生單倍體。Coe (Coe EH. A line of maize with high haploid frequency [J] .Am Nat， 1959,93:381-382)在1959年發現了玉米孤雌生殖 誘導系Stock6。後來在其基礎上不斷改造，如轉入Navajo (ACR-nj)遺傳標記基因， 通過籽粒顏色和植株顏色鑑定出單倍體，從而使雜交誘導單倍體進行單倍體育種成 為了可能。但是在實踐應用中也發現，Stock6的誘導率也很低(約為3%)，並且存 在很多嚴重的缺陷，如雄花對溫度敏感，自交結實性差，穗粒腐病嚴重，Navajo 遺傳標記較弱。因此，利用Stock6誘導單倍體的關鍵是要在保持其誘導能力的前 提下克服上述缺點。國外在這方面起步較早，並已取得了較大進展，成功選育出了 一些優良的誘導系，如法國的WS14 (Lashermes P， Beckert M. Genetic control of
maternal haploidy in maize (Zea mays L.) and selection of haploid inducing lines [J]. Theor Appl Genet, 1988， 76(3): 405-410)、前蘇聯的KEMS (Shatskaya 0 A. et al， Mass induction of maternal haploids in corn[J].Maize Genet Coop Newslett， 1994,68:51)，摩爾多瓦的MHI (ChalykST. Creating new haploid-inducing lines of maize[J]. Maize Genet Coop Newslett, 1999， 73: 53 -54)，德國的 RWS(F. K. Rober et al. ， In vivo haploid induction in maize-Performance of new inducers and significance of doubled haploid lines in hybrid breeding[J].Maydica， 2005， 50:275-283)等等。這些新選的誘導系不但適應當地的 環境，而且其誘導率及遺傳標記也進一步提高，利用價值已經大大超出了Stock6，
單倍體誘導率的大大提高使生物誘導單倍體育種的可行性大大提高，但是單倍 體的鑑定還是一個挑戰。目前單倍體的鑑定主要依賴於A1A2C1C2BP1R-nj顯性標記 系統。它首先根據籽粒Navajo標記性狀(由AlA2ClC2R-nj基因控制)分揀出可能 的單倍體籽粒，再經過苗期植株顏色(由A1A2BP1基因控制)來確定單倍體植株的 真偽。但是在實踐中發現，該標記系統的基因型選擇性比較強，不同的材料標記表 達差別很大，有的材料幾乎不能用籽粒Navajo標記鑑定；而且不同的環境條件對 標記的表達影響也很大。另外利用籽粒顏色進行單倍體鑑定需要花費大量的人力物 力。因此開發出新的標記以高效鑑定單倍體對單倍體育種非常重要，同時機械化迸 行單倍體挑選也是亟待解決的問題。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種快速、高效地鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法。 本發明所提供的鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法，包括以下步驟
(1) 用玉米單倍體誘導系作為父本與母本玉米進行雜交，收穫雜交當代籽粒；
(2) 確定鑑別標準值；
(3) 檢測待測單個所述雜交當代籽粒的含油量，若所述待測單個雜交當代籽 粒的含油量《所述鑑別標準值，則所述待測單個雜交當代籽粒為單倍體；
所述鑑別標準值可以按照如下方法確定隨機抽取所述雜交當代籽粒，計算所
述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值和標準差，再按照如下公式計算所述鑑
別標準值
所述鑑別標準值二所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值-AX所述隨機 抽取的雜交當代籽粒的含油量標準差；1. 96《所述A《2. 58。
其中，所述A具體還可以按照如下方法確定
(1) 當參考值K參考值2時，A值為2.58;
(2) 當參考值2 <參考值1 <參考值3時，A值為2. 24;
(3) 當參考值3<參考值1<參考值4時，A值為1.96;
(4) 當參考值4<參考值1時，A值為1.96;
所述參考值1=隨機抽取的自交當代籽粒的含油量平均值+1. 96X隨機抽取的自 交當代籽粒的含油量標準差；
所述參考值2=所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值-2. 58X所述隨機
抽取的雜交當代籽粒的含油量標準差；
所述參考值3=所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值-2. 24X所述隨機 抽取的雜交當代籽粒的含油量標準差；
所述參考值4=所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值-1. 96X所述隨機 抽取的雜交當代籽粒的含油量標準差；
所述隨機抽取的自交當代籽粒按照如下方法獲得用所述母本玉米進行自交. 收穫自交當代籽粒，隨機抽取所述自交當代籽粒。
一般情況下，所述隨機抽取所述雜交當代籽粒大於等於50粒即可；所述隨機 抽取所述自交當代籽粒大於等於50粒即可。
所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值和標準差是按照如下方法得到 的從所述隨機抽取的雜交當代籽粒中去掉含油量異常的雜交當代籽粒，然後再計 算得到所述平均值和標準差；所述含油量異常的雜交當代籽粒為含油量與所有隨機 抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值相差2個百分點以上的籽粒；
所述隨機抽取的自交當代籽粒的含油量平均值和標準差是按照如下方法得到 的從所述隨機抽取的自交當代籽粒中去掉含油量異常的自交當代籽粒，然後再計 算得到所述平均值和標準差；所述含油量異常的自交當代籽粒為含油量與所有隨機 抽取的自交當代籽粒含油量的平均值相差2個百分點以上的籽粒。
所述玉米單倍體誘導系的籽粒含油量大於等於6% (質量百分含量)。
本發明的另一個目的是提供另一種鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法，該方法是 將上述油份鑑定方法與籽粒顏色鑑定方法相結合。
本發明所提供的另一種鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法，包括以下步驟 (1)用玉米單倍體誘導系作為父本與母本玉米進行雜交，收穫雜交當代籽粒;
7 (2) 鑑定所述雜交當代籽粒的顏色，將胚乳為紫色、胚芽非紫色的所述雜交
當代籽粒鑑定為擬單倍體籽粒；將胚乳為紫色、胚芽為紫色的所述雜交當代籽粒鑑 定為非單倍體籽粒；
(3) 確定鑑別標準值；
(3)檢測待測單個擬單倍體籽粒的含油量，若所述待測單個擬單倍體籽粒的 含油量《所述鑑別標準值，則所述待測單個擬單倍體籽粒為單倍體
所述鑑別標準值按照如下方法確定隨機抽取所述非單倍體籽粒，計算所述隨 機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值和標準差，再按照如下公式計算所述鑑別標 準值
所述鑑別標準值=所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值-AX所述隨機 抽取的非單倍體籽粒的含油量標準差；1. 96《所述A《2. 58。 其中，所述A還可以按照如下方法確定
(1) 當參考值K參考值2時，A值為2.58;
(2) 當參考值2<參考值1<參考值3時，A值為2.24;
(3) 當參考值3<參考值1<參考值4時，A值為1.96;
(4) 當參考值4 <參考值1時，A值為1. 96;
所述參考值1=隨機抽取的自交當代籽粒的含油量平均值+1. 96X隨機抽取的自 交當代籽粒的含油量標準差；
所述參考值2=所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值-2. 58X所述隨機 抽取的擬單倍體籽粒的含油量標準差；
所述參考值3=所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值-2. 24X所述隨機 抽取的擬單倍體籽粒的含油量標準差；
所述參考值4=所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值-1. 96X所述隨機 抽取的擬單倍體籽粒的含油量標準差；
所述隨機抽取的自交當代籽粒按照如下方法獲得用所述母本玉米進行自交， 收穫自交當代籽粒，隨機抽取所述自交當代籽粒。
所述隨機抽取所述非單倍體籽粒大於等於50粒；所述隨機抽取所述自交當代 籽粒大於等於50粒。
所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值和標準差是按照如下方法得到 的從所述隨機抽取的非單倍體籽粒中去掉含油量異常的雜交當代籽粒，然後再計
算得到所述平均值和標準差；所述含油量異常的非單倍體籽粒為含油量與所有隨機 抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值相差2個百分點以上的籽粒；
所述隨機抽取的自交當代籽粒的含油量平均值和標準差是按照如下方法得到 的從所述隨機抽取的自交當代籽粒中去掉含油量異常的自交當代籽粒，然後再計 算得到所述平均值和標準差；所述含油量異常的自交當代籽粒為含油量與所有隨機 抽取的自交當代籽粒含油量的平均值相差2個百分點以上的籽粒。
所述玉米單倍體誘導系的籽粒含油量大於等於6% (質量百分含量)。 所述母本可為符合育種目標或者研究目標的玉米自交系、玉米基礎群體或玉米
雜交種。
其中，所述的基礎群體指由多個自交系或品種按一定方式混合授粉後形成的玉 米群體。
所述的雜交種指單交種、三交種或者雙交種。
上述方法中，籽粒含油量可以通過核磁共振儀(醒R)或者近紅外單粒測定儀 (NIR)等方法進行測定。
本發明油份鑑別方法只要通過檢測籽粒的含油量即可鑑別出單倍體籽粒，其中 的油份標記性狀很穩定；尤其是當選用高油型單倍體誘導系作雜交父本時，能使當 代雜交二倍體籽粒的含油量大大提高，提高了當代單倍體籽粒與當代雜交二倍體籽 粒含油量的差異，從而使鑑定效率顯著提高。實驗結果表明，與傳統的籽粒顏色標 記鑑別方法相比，本發明鑑別方法鑑定效率提高了約12.7%。另一方面，傳統的籽 粒顏色標記鑑別方法在誘導系不具有籽粒顏色標記、籽粒顏色表達受到抑制或者籽 粒顏色標記表達不明顯時就會受到限制，而本發明油份鑑別方法不會受籽粒顏色深 淺的影響。因此，與傳統方法比，本發明油份鑑別方法具有操作簡便、省時省力、 鑑定效率高的特點。
本發明鑑別方法以油份作為新的遺傳標記，為單倍體鑑定開闢了新的途徑，使 鑑定不僅依賴於籽粒顏色和植株形態等方法，大大擴展了應用範圍，並可以進行大 規模操作，為機械化進行單倍體挑選提供了可能，進而為提高育種效率提供了保證。
本發明的將油份鑑別和籽粒顏色鑑別相結合的方法，可以使單倍體鑑定的操作 更加靈活，可以先依靠籽粒顏色把那些非常明顯肯定不是單倍體的籽粒去除掉，然 後再利用油份高效率地鑑定出單倍體籽粒，使鑑定的準確性更高。
圖1為利用油份鑑定單倍體的方法流程圖。 圖2為籽粒顏色、油份含量結合的單倍體鑑定方法流程圖。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
本發明中所述的籽粒油份含量(或籽粒含油量、或籽粒油份)是指每個玉米籽 粒中油的質量佔籽粒總質量的百分比。
普通玉米含油量為4-5%，高油玉米是指籽粒油份含量較高的玉米， 一般指含 油量大於等於6% (質量百分含量)的玉米。
用核磁共振儀對籽粒進行油份的單粒測定方法採用宋同明描述的方法進行油 份測定(宋同明，脈衝核磁共振儀對作物種子含油量的快速測定，作物學報，1989， 15 (2) : 160-166)。
實施例l、單倍體油份的倍性效應
一、 實驗材料
父本玉米孤雌生殖單倍體誘導系Stock6 (Coe E H. A line of maize w他high haploidfrequency[J].AmNat,1959，93:381-382)(中國農業大學)，含油量2. 95%;
母本雜交種農大108 (北京金色農華種業科技有限公司)、雜交種鄭單958 (北京德農種業有限公司)、雜交種先玉335 (美國先鋒公司)、雜交種ND5598 (黎 亮，C.Friedrich H.Longin，孫文濤等.華北平原夏玉米氮利用效率的遺傳參數估 計[J].中國農業大學學報，2007， 12(6) :50-56)(高油品種，含油量約6. 5%)(中 國農業大學)；
二、 誘導單倍體及鑑定
1、 單倍體誘導
實驗採用隨機區組設計，共設如下4個處理，每個處理中雜交10穗，收穫雜 交籽粒並風乾。
實驗處理l:用農大108作母本，玉米孤雌生殖單倍體誘導系Stock6作父本； 實驗處理2:用鄭單958作母本，玉米孤雌生殖單倍體誘導系Stock6作父本； 實驗處理3:用先玉335作母本，玉米孤雌生殖單倍體誘導系Stock6作父本； 實驗處理4:用ND5598作母本，玉米孤雌生殖單倍體誘導系Stock6作父本。
2、 單倍體鑑定
首先，採用顏色標記法進行初步鑑定，即依據雜交當代籽粒胚芽的Navajo標
記來進行鑑別糊粉層為紫色、紫色胚芽的雜交當代籽粒為雜合籽粒；糊粉層為紫 色、無紫色胚芽的雜交當代籽粒為擬單倍體籽粒。然後，將擬單倍體單粒測油後種 植于田間，通過植株形態和育性進一步判斷，單倍體表現為植株弱小且高度不育。 由以上兩步鑑定出單倍體籽粒。同時也將雜合籽粒(即雜交二倍體籽粒)用核磁共 振儀測定籽粒油份，以備下步的統計分析。 三、含油量統計分析
分別取每個處理誘導中的單倍體和非單倍體籽粒各100粒，統計其含油量。結 果如下
處理l (農大108):單倍體籽粒平均油份為3. 15%,雜交二倍體的籽粒的平均 油份為3. 63%，雜交二倍體籽粒比單倍體籽粒油份增加15. 27%;
處理2 (鄭單958):單倍體籽粒的平均油份為3. 01%，雜交二倍體籽粒的平均 油份為3. 53%,雜交二倍體籽粒比單倍體籽粒油份增加17. 47%;
處理3 (先玉335):單倍體籽粒平均油份為2. 28%，雜交二倍體籽粒的平均油 份為2. 57%，雜交二倍體籽粒比單倍體籽粒油份增加12. 75%;
處理4 (ND5598):單倍體籽粒的平均油份為5. 09%，雜交二倍體籽粒的平均 油份為5. 38%，雜交二倍體籽粒比單倍體籽粒油份增加5. 62%。
以上結果表明，單倍體籽粒的油份略低於雜交二倍體籽粒的油份。
實施例2、高油型誘導系油份的花粉直感效應
油份的花粉直感效應指當用高油材料作父本時能提高當代雜交二倍體籽粒的. 油份。
一、 實驗材料
父本(即誘導系)高油型誘導系農大高誘l號(劉志增，宋同明.玉米高頻 率孤雌生殖單倍體誘導系的選育與鑑定.作物學報，2000， 26 (5) : 570-574)(中 國農業大學)；
母本178、 4F1、昌7-2、丹598、鄭58，均來自於中國農業科學院作物品種 資源研究所國家作物種質庫。
二、 實驗方法
實驗設計為完全隨機區組設計，共設如下10個處理。
1、單倍體誘導處理每個處理雜交5穗，收穫當代雜交籽粒並風乾。
處理l:以178為母本，以農大高誘l號為父本； 處理2:以4F1為母本，以農大高誘l號為父本； 處理3:以昌7-2為母本，以農大高誘l號為父本； 處理4:以丹598為母本，以農大高誘l號為父本； 處理5:以鄭58為母本，以農大高誘l號為父本。 2、對照處理每個處理自交3穗，收穫當代自交籽粒並風乾。 處理6: 178自交；處理7: 4F1自交；處理8:昌7-2自交；處理9:丹598 自交；處理10:鄭58自交。
分別取每個處理的籽粒100粒，用核磁共振儀測定單籽粒油份。 三、實驗結果
處理1收穫籽粒的平均油份為5. 45%，處理6收穫籽粒的平均油份為3. 77%; 處理1比處理6油份提高1. 68個百分點，提高了 44. 56%;
處理2收穫籽粒的平均油份為5. 68%，處理7收穫籽粒的平均油份為3. 42%。 處理7比處理2的籽粒平均油份提高了 2. 26個百分點，提高了 66. 08%;
處理3收穫籽粒的平均油份為6. 18%，處理8收穫籽粒的平均油份為3. 54%， 處理3比處理8的籽粒平均油份提高了 2. 64個百分點，提高了 74. 58%;
處理4收穫籽粒的平均油份為4. 10%，處理9收穫籽粒的平均油份為2. 51%, 處理4比處理9的籽粒平均油份提高了 1. 59個百分點，提高了 63. 35%;
處理5收穫籽粒的平均油份為5. 03%，處理10收穫籽粒的平均油份為3. 13%， 處理5比處理10的籽粒平均油份提高了 1. 90個百分點，提高了 60. 70%。
表明，高油型誘導系農大高誘1號具有花粉直感效應。
實施例3、利用油份進行單倍體鑑定
一、 實驗材料
母本雜交種鄭單958 (北京德農種業有限公司)；父本高油型誘導系農大 高誘l號(劉志增，宋同明.玉米高頻率孤雌生殖單倍體誘導系的選育與鑑定作物 學報，2000， 26 (5) : 570-574)(中國農業大學)。
二、 單倍體誘導實驗方法
田間種植鄭單958，錯期種植單倍體誘導系農大高誘1號，用高誘1號作父本 與鄭單958雜交15穗，同時鄭單958自交2穗，收穫雜交當代籽粒和自交當代籽
粒並風乾。共收穫5000粒雜交籽粒，500粒自交籽粒。 三、單倍體鑑定
(一) 按照籽粒顏色標記對雜交籽粒進行單倍體鑑定
標準如下胚乳為紫色而胚芽無紫色的為擬單倍體，胚乳紫色而胚芽紫色的為
非單倍體，胚乳為紫色而胚芽淡紫色的為可能單倍體。胚芽顏色判斷是根據AATCC 六色九級卡進行的，紫色0-3級為無紫色，紫色4-6級為淡紫色，紫色7-9級為紫 色。胚芽顏色一共就有如上三種情況。將除了紫色(7-9級)以外的顏色都定義為 非紫色。
結果，從5000粒雜當代交籽粒中挑選出非單倍體籽粒4695粒，擬單倍體籽粒 210粒，可能單倍體籽粒95粒。
(二) 以油份作為標記進行單倍體鑑定(圖l)
1、 隨機抽取籽粒
從5000粒雜交籽粒中隨機抽取100粒籽粒，進行單粒測油，並記錄數據；從 500粒自交籽粒中隨機抽取100粒籽粒，進行單粒測油，並記錄數據。
2、 去掉含油量異常的籽粒
含油量異常的自交籽粒為含油量與所有隨機抽取的100粒自交籽粒含油量的平 均值相差2個百分點的籽粒；含油量異常的雜交籽粒為含油量與所有隨機抽取的 100粒雜交籽粒含油量的平均值相差2個百分點的籽粒。去掉異常籽粒後，雜交籽 粒剩餘95粒，自交籽粒剩餘100粒。
3、 分別計算隨機抽取的雜交籽粒和自交籽粒的平均值和標準差 計算公式如下formula see original document page 13
Xi為每粒的含油量；N為用於計算的籽粒的數目即去掉異常籽粒後的籽粒數目； 去掉異常雜交籽粒後，剩餘的雜交籽粒的含油量平均值為6. 09%，標準差為 0. 56%;
去掉異常自交籽粒後，剩餘的自交籽粒的含油量平均值為3.53%，標準差為 0. 49%。
4、確定A值 (1)計算四個參考值
參考值1=自交籽粒油份平均值+1. 96 X自交籽粒油份標準差；參考值
1=3. 53%+0. 49% X 1. 96=4. 45%;
參考值2=雜交籽粒油份平均值-2. 58X雜交籽粒油份標準差；參考值2=4. 65%; 參考值3=雜交籽粒油份平均值-2. 24X雜交籽粒油份標準差；參考值3=4. 84%; 參考值4=雜交籽粒油份平均值-1. 96X雜交籽粒油份標準差；參考值4=4. 99%。 (2)比較4個參考值，確定A值
① 當參考值2 >參考值1時，A值選擇2. 58;
② 當參考值2 <參考值1 <參考值3時，A值選擇2. 24;
③ 當參考值3 <參考值1 參考值4時，A值也選擇1. 96。
本實驗中，比較結果表明，參考值K參考值2，屬於第一種情況，因此將A 值確定為2.58。
5、 確定油份鑑定標準值
油份鑑定標準值的計算公式如下油份鑑定標準值:雜交籽粒油份平均值-AX 雜交籽粒油份標準差。
因此，油份鑑定標準值=4. 65%。
6、 油份比較進行鑑定
用核磁共振儀對上述5000粒雜交當代籽粒全部進行油份的單粒測定，然後將 單粒雜交籽粒的含油量與上述油份鑑定標準值(4.65%)進行比較，若籽粒油份小 於或等於標準值，則待測籽粒被認為是單倍體，若籽粒油份大於標準值，則待測籽 粒被認為是非單倍體。
結果表明，5000粒雜交籽粒中，255粒被鑑定為單倍體。 (三)田間種植鑑定
將上述5000粒雜交籽粒測油後，分別進行單粒播種，然後根據植株顏色、株 高、育性三個標準進行鑑定單倍體植株肯定表現為植株無紫色，如果植株紫色的 判斷為非單倍體；單倍體植株一般表現相對矮小，如果植株非常高大，則判斷為非
單倍體；育性作為輔助判斷的手段，單倍體一般表現為高度不育或部分可育，如果 表現為高度不育且植株綠色、株高相對矮小可判斷為單倍體，高度可育且植株高大 或者高度可育且植株紫色都判斷為非單倍體。
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結果表明，5000粒雜交籽粒中，245粒被鑑定為單倍體，4755粒被鑑定為非單 倍體。由此可統計出高油誘1號的單倍體誘導率為4.9% (誘導率=(205+40) /5000=4.9%)。
(四) 油份鑑定法和籽粒顏色鑑定法的效率比較
(1) 田間鑑定結果表明，5000粒雜交籽粒中，有245粒為單倍體(即田間鑑 定出的單倍體數為245)。
(2) 油份標記鑑定法結果，5000粒雜交籽粒中，有255粒為單倍體(即油份 法挑選出的單倍體總數為255);經田間鑑定後，被鑑定為單倍體的255粒中，實 際的單倍體數目為231個(即油份法挑選出的單倍體總數中的實際單倍體數為 231)，有24粒本來不是單倍體而被認為是單倍體(即誤選數為24)，還有14粒 本來是單倍體，但是本方法沒有鑑定出來(即漏選數為14)。
油份標記鑑定方法(簡稱油份法)的鑑定效率=油份法挑選出的單倍體總數中 的實際單倍體數/田間種植擬單倍體數，其中，田間種植擬單倍體數=田間鑑定出的
單倍體數-油份法漏選數+油份法誤選數。
油份標記鑑定方法的鑑定效率=油份法挑選出的單倍體總數中的實際單倍體數 /田間種植擬單倍體數=231/ (245-14+24) =231/255=90.56%。
(3) 籽粒顏色標記鑑定方法，5000粒雜交籽粒中，擬單倍體籽粒210粒，可 能單倍體籽粒95粒。
籽粒顏色標記法的鑑定效率為籽粒顏色標記法的鑑定效率=田間鑑定出的單 倍體數/ (籽粒法鑑定出的擬單倍體籽粒數目+籽粒法鑑定出的可能單倍體籽粒數 目)=245/305=80. 33%。
以上兩種鑑定方法的鑑定結果表明，本發明的油份標記鑑定方法的鑑定效率 (90. 56%)比籽粒顏色標記法的鑑定效率(80. 33%)提高了 12. 7%(90. 56%-80. 33%) /80. 33%=12. 7%。
(五) 以油份作為標記的鑑定效率
以田間鑑定結果為參考，對所有測油數據進行整理統計。統計表明，非單倍體 籽粒的油份和單倍體籽粒的油份都符合正態分布。非單倍體籽粒的平均油份為 6.09%，標準差為O. 56%;單倍體籽粒的平均油份為3. 71%,標準差為0. 61%。由此 可見雜交二倍體籽粒的油份大大高於單倍體籽粒的油份。
由於誘導的非單倍體籽粒和單倍體籽粒的油份都是隨機分布的，因此需要設置一個合理的標準來判斷是否為單倍體，這樣既能保證不要漏掉很多單倍體，也要保 證不要把很多非單倍體誤判為單倍體從而降低鑑定效率。為此提出幾個參數漏選 率、誤選率、鑑定效率。
漏選率指實際為單倍體而被判斷為非單倍體的比例，漏選率=被誤判為非單倍 體的單倍體數/實際單倍體總數；
誤選率指實際為非單倍體而被判斷為單倍體的比例，誤選率=被誤判為單倍體 的非單倍體數/非單倍體總數；
油份標記鑑定方法(簡稱油份法)的鑑定效率=油份法挑選出的單倍體總數中 的實際單倍體數/田間種植擬單倍體數，其中，田間種植擬單倍體數=田間鑑定出的
單倍體數-油份法漏選數+油份法誤選數。
當鑑定係數A值設為2.58、誤選率為0.5%時，誤選籽粒數為24粒，油份選擇 的標準為4. 65%=6. 09%-2. 58X0. 56>。，此時漏選率為6%，即漏選籽粒數為14粒， 鑑定效率為90. 56%= (245-14) / (245-14+24);
當鑑定係數A值設為2. 24、誤選率為1. 25%，誤選籽粒數為60粒，油份的鑑 定標準為4.84%=6. 09%-2.24X0.56%，此時漏選率為3%，漏選籽粒為7粒，鑑定效 率為79. 9%= (245-7) / (245-7+60);
當鑑定係數A設為1.96、誤選率為2.5%時，即誤選籽粒為118粒，油份選擇 標準為4.99%=6.09%-1.96X0. 56%，此時漏選率為1%，即漏選率為2粒，鑑定效率 為67%= (245-3) / (245-3+118)。
表明，隨著A值的縮小，誤選率越來越大，漏選率越來越小，鑑定效率越來越小。
在實際生產中，可以根據實際需要來選擇A值。例如，若待選的籽粒非常多時， 應該儘量減小誤選率，以保證鑑定效率，那麼此時就應該選擇較大的A值，可以將 A值定為2.58;若待選的籽粒不是很多時，誤選率的大小對鑑定結果不會產生太大 的影響，此時A值的選擇就可以靈活些，再根據其它不同的目的選擇不同的值。還 可以根據上述步驟三(二)中所述方法確定A值。
實施例4、本發明油份鑑定方法與籽粒顏色鑑定方法的結合的效果檢測(圖2) 一、實驗材料
母本普通雜交種先玉335 (美國先鋒公司)、農大10S (北京金色農華種業
科技有限公司)，高油雜交種ND5598 (黎亮，C.FriedrichH.Longin，孫文濤等.華 北平原夏玉米氮利用效率的遺傳參數估計[J].中國農業大學學報， 2007， 12(6) :50-56)(中國農業大學); 父本誘導系農大高誘l號。
二、 單倍體誘導
實驗採取隨機區組設計，共設如下3個處理。
處理l:以農大108作母本、農大高誘1號作父本進行雜交，共雜交10穗；同 時以農大108自交3穗為對照；收穫自交當代和雜交當代籽粒並風乾；
處理2:用先玉335作母本、農大高誘1號作父本進行雜交，共雜交10穗；同 時以先玉335自交3穗為對照；收穫自交當代和雜交當代籽粒並風乾；
處理3:用ND5598作母本、農大高誘1號作父本進行雜交，共雜交10穗；同 時以5598自交3穗為對照；收穫自交當代和雜交當代籽粒並風乾。
三、 用籽粒顏色標記法和油份標記法相結合進行單倍體鑑定
1、 方法
將每個處理收穫的所有雜交籽粒根據籽粒顏色標記進行單倍體初步鑑定，標準
如下胚乳紫色而胚芽紫色的為非單倍體，胚乳為紫色而胚芽非紫色的為擬單倍體。
胚芽顏色判斷是根據AATCC六色九級卡進行的，紫色7-9級為紫色，除了紫色(7-9 級)以外的顏色都認為是非紫色。
從每個處理的非單倍體籽粒中各隨機抽取50粒，進行單粒含油量測定；再從 每個處理的自交籽粒中各隨機抽取50粒，進行單粒含油量測定；然後按照實施例3 中所述的油份標記法確定油份鑑別標準值，再將所有擬單倍體籽粒的含油量分別與 油份鑑別標準值進行比較，以進行進一步鑑定。
將所有籽粒測完油後，再將各處理中的擬單倍體籽粒隨機抽取IOO粒分別種植 于田間進行單倍體的田間鑑定。
2、 結果
結果表明，處理1非單倍體籽粒的油份為6. 13%±0. 76%，故雜交油份參考值分 別為4. 16%， 4.43%， 4.64%;自交籽粒的油份為3. 15%±0. 57%，故自交油份參考值 為4. 27%。根據油份鑑定標準的確定原則，油份標準值為4. 43%。
處理2非單倍體籽粒的油份為5. 05%±0. 61%，故雜交油份參考值為3. 48%， 3.68%,3.85%;自交籽粒的油份為2.81%±0.43%，故自交油份參考值為3. 65%。根據
油份鑑定標準的確定原則，油份標準值為3. 68%。
處理3非單倍體籽粒的油份為8. 97%±0. 96%,故雜交油份參考值為6. 49%， 6.81%， 7.09%;自交籽粒的油份為6.31%±0.41%，故自交油份參考值為7. 11%。根 據油份鑑定標準的確定原則，油份標準值為7.09%。
根據油份的鑑定標準將每種處理的擬單倍體籽粒分為兩類，I類是油份小於或 等於標準值，即利用油份鑑定法認為是單倍體的籽粒；II類是油份大於標準值，即 利用油份鑑定法認為是非單倍體的籽粒。分別將每種處理的兩類籽粒種植于田間進 行單倍體的進一步鑑定。
處理l:油份鑑定結果I類籽粒44粒，有41粒田間表現為單倍體；II類籽
粒有56粒，有2粒田間表現為單倍體；因此利用籽粒顏色標記和油份標記相結合 的方法的單倍體鑑定效率為41/44=93. 2%。
因此利用籽粒顏色鑑定單倍體鑑的效率為(41+2) /100=43%。
處理2: I類籽粒45粒，有43粒田間表現為單倍體；n類籽粒55粒，有8粒 田間表現為單倍體。因此利用籽粒顏色標記和油份標記相結合的方法的單倍體鑑定 效率為43/45=95. 6%;利用籽粒顏色的鑑定效率為(43+8) /100=51%。
處理3: I類籽粒52粒，有44粒田間表現為單倍體；n類籽粒48粒，有6粒 田間表現為單倍體。因此利用籽粒顏色標記和油份標記相結合的方法的單倍體鑑定 效率為44/52=84. 6%;利用籽粒顏色的鑑定效率為(44+6) /100=50%。
由此可見，利用籽粒顏色標記和籽粒油份標記相結合的方法也可以提高單倍體 的鑑定效率。
權利要求
1、一種鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法，包括以下步驟(1)用玉米單倍體誘導系作為父本與母本玉米進行雜交，收穫雜交當代籽粒；(2)確定鑑別標準值；(3)檢測待測單個所述雜交當代籽粒的含油量，若所述待測單個雜交當代籽粒的含油量≤所述鑑別標準值，則所述待測單個雜交當代籽粒為單倍體；所述鑑別標準值按照如下方法確定隨機抽取所述雜交當代籽粒，計算所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值和標準差，再按照如下公式計算所述鑑別標準值所述鑑別標準值＝所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值-A×所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量標準差；1.96≤所述A≤2.58。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述A按照如下方法確定(1) 當參考值K參考值2時，A值為2.58;(2) 當參考值2 <參考值1 <參考值3時，A值為2. 24;(3) 當參考值3<參考值1<參考值4時，A值為1.96;(4) 當參考值4<參考值1時，A值為1.96;所述參考值1=隨機抽取的自交當代籽粒的含油量平均值+1. %X隨機抽取的自 交當代籽粒的含油量標準差；所述參考值2=所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值-2. 58X所述隨機 抽取的雜交當代籽粒的含油量標準差；所述參考值3=所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值-2. 24X所述隨機 抽取的雜交當代籽粒的含油量標準差；所述參考值4=所述隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均值_1. 96X所述隨機 抽取的雜交當代籽粒的含油量標準差；所述隨機抽取的自交當代籽粒按照如下方法獲得用所述母本玉米進行自交， 收穫自交當代籽粒，隨機抽取所述自交當代籽粒。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述隨機抽取所述雜交當 代籽粒大於等於50粒；所述隨機抽取所述自交當代籽粒大於等於50粒。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述隨機抽取的雜交當代籽粒 的含油量平均值和標準差是按照如下方法得到的從所述隨機抽取的雜交當代籽粒 中去掉含油量異常的雜交當代籽粒，然後再計算得到所述平均值和標準差；所述含 油量異常的雜交當代籽粒為含油量與所有隨機抽取的雜交當代籽粒的含油量平均 值相差2個百分點以上的籽粒；所述隨機抽取的自交當代籽粒的含油量平均值和標準差是按照如下方法得到 的從所述隨機抽取的自交當代籽粒中去掉含油量異常的自交當代籽粒，然後再計 箅得到所述平均值和標準差；所述含油量異常的自交當代籽粒為含油量與所有隨機 抽取的自交當代籽粒含油量的平均值相差2個百分點以上的籽粒。
5、 根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於所述玉米單倍體誘導系的籽粒含油量大於等於6% (質量百分含量)。
6、 一種鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法，包括以下步驟(1) 用玉米單倍體誘導系作為父本與母本玉米進行雜交，收穫雜交當代籽粒；(2) 鑑定所述雜交當代籽粒的顏色，將胚乳為紫色且胚芽非紫色的雜交當代籽粒鑑定為擬單倍體籽粒，將胚乳為紫色且胚芽為紫色的雜交當代籽粒鑑定為非單倍體籽粒；(3) 確定鑑別標準值；(3)檢測待測單個擬單倍體籽粒的含油量，若所述待測單個擬單倍體籽粒的 含油量《所述鑑別標準值，則所述待測單個擬單倍體籽粒為單倍體；所述鑑別標準值按照如下方法確定隨機抽取所述非單倍體籽粒，計算所述隨 機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值和標準差，再按照如下公式計算所述鑑別標 準值所述鑑別標準值=所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值-AX所述隨機 抽取的非單倍體籽粒的含油量標準差；1. 96《所述A《2. 58。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述A按照如下方法確定(1) 當參考值K參考值2時，A值為2.58;(2) 當參考值2 <參考值1 <參考值3時，A值為2. 24;(3) 當參考值3<參考值1<參考值4時，A值為1.96;(4) 當參考值4<參考值1時，A值為1.96;所述參考值1=隨機抽取的自交當代籽粒的含油量平均值+1. 96X隨機抽取的自 交當代籽粒的含油量標準差； 所述參考值2=所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值-2. 58X所述隨機 抽取的擬單倍體籽粒的含油量標準差；所述參考值3=所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值-2. 24X所述隨機 抽取的擬單倍體籽粒的含油量標準差；所述參考值4=所述隨機抽取的非單倍體籽粒的含油量平均值-1. 96X所述隨機 抽取的擬單倍體籽粒的含油量標準差；所述隨機抽取的自交當代籽粒按照如下方法獲得用所述母本玉米進行自交， 收穫自交當代籽粒，隨機抽取所述自交當代籽粒。
8、 根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於所述隨機抽取所述非單倍 體籽粒大於等於50粒；所述隨機抽取所述自交當代籽粒大於等於50粒。
9、 根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述隨機抽取的非單倍體籽粒 的含油量平均值和標準差是按照如下方法得到的從所述隨機抽取的非單倍體籽粒 中去掉含油量異常的雜交當代籽粒，然後再計算得到所述平均值和標準差；所述含油量異常的非單倍體籽粒為含油量與所有隨機抽取的擬單倍體籽粒的含油量平均值相差2個百分點以上的籽粒；所述隨機抽取的自交當代籽粒的含油量平均值和標準差是按照如下方法得到的從所述隨機抽取的自交當代籽粒中去掉含油量異常的自交當代籽粒，然後再計 算得到所述平均值和標準差；所述含油量異常的自交當代籽粒為含油量與所有隨機 抽取的自交當代籽粒含油量的平均值相差2個百分點以上的籽粒。
10、 根據權利要求6-9中任一所述的方法，其特徵在於所述玉米單倍體誘導 系的籽粒含油量大於等於6% (質量百分含量)。
全文摘要
本發明公開了鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法。本發明的一種鑑別玉米孤雌生殖單倍體的方法包括以下步驟(1)用玉米單倍體誘導系作為父本與母本玉米進行雜交，收穫雜交當代籽粒；(2)確定鑑別標準值；(3)檢測待測單個所述雜交當代籽粒的含油量，若所述待測單個雜交當代籽粒的含油量≤所述鑑別標準值，則所述待測單個雜交當代籽粒為單倍體。與傳統方法比，本發明鑑別方法具有操作簡便、省時省力、鑑定效率高的特點。本發明鑑別方法為單倍體鑑定開闢了新的途徑，可以進行大規模操作，為機械化進行單倍體挑選提供了可能，進而為提高育種效率提供了保證。
文檔編號G01N33/02GK101377481SQ200810223529
公開日2009年3月4日 申請日期2008年10月6日 優先權日2008年10月6日
發明者陳紹江, 亮 黎 申請人:中國農業大學