由1－苯磺醯－3－胺基酸側鏈－4－(2－核酸鹼基(乙醯基)－哌嗪－2－酮製備的肽核酸...的製作方法

2023-10-07 08:27:49

專利名稱：由1－苯磺醯－3－胺基酸側鏈－4－(2－核酸鹼基(乙醯基)－哌嗪－2－酮製備的肽核酸 ...的製作方法
背景技術：
1.發明背景本發明涉及適合製造PNA寡聚物的單體。本發明還涉及所述單體的前體和從該前體製造PNA單體的方法。此外，本發明涉及用PNA單體製造PNA寡聚物的方法。
2.技術背景和現狀在最近20年中，通過修飾磷酸基、核糖環或核酸鹼基來最優化寡核苷酸的性質的努力導致了許多新寡核苷酸衍生物的發現，這些衍生物可以反義和反義基因的形式用於DNA診斷和治療的領域，以及用於對分子生物學和生物技術的基礎研究(U.Englisch和D.H.Gauss，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1991，30，613-629；A.D.Mesmaeker等，Curr.Opinion Struct.Biol.1995，5，343-355；P.E.Nielsen，Curr.Opin.Biotech.，2001，12，16-20)。最顯著的發現是由Nielsen，Egholm，Buchardt和Berg組成的丹麥小組報導的肽核酸(P.E.Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500)。PNA是DNA類似物，其中N-(2-氨基乙基)甘氨酸聚醯胺代替了磷酸-核糖環主鏈和亞甲基-羰基接頭將天然和非天然核酸鹼基連接到N-(2-氨基乙基)甘氨酸中間的胺上。儘管對天然的結構進行了基團的改變，但PNA仍能夠遵守Watson-Crick鹼基配對規則序列特異性地與DNA結合。PNA以高於其天然對應物的親和力與互補的核酸結合。這一部分是由於主鏈上缺乏負電荷，從而減小了電荷-電荷之間的斥力，也由於有利的幾何因素(S.K.Kim等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，6477-6481；B.Hyrup等，J.Am.Chem.Soc.，1994，116，7964-7970；M.Egholm等，Nature，1993，365，566-568；K.L.Dueholm等，New J.Chem.，1997，21，19-31；P.Wittung等，J.Am.Chem.Soc.，1996，118，7049-7054；M.Leijon等，Biochemistry，1994，9820-9825)。還證實所得PNA/DNA雙鏈體的熱穩定性與雜交溶液的鹽濃度無關(H.Orum等，BioTechniques，1995，19，472-480；S.Tomac等，J.Am.Chem.Soc.，1996，118，5544-5552)。而且，PNA可以平行或逆平行的方式結合，逆平行模式是優選的(E.Uhlman等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1996，35，2632-2635)。
PNA/DNA雙鏈體的錯配遠比DNA/DNA雙鏈體的錯配不穩定。一個鹼基的錯配將導致PNA/DNA和DNA/DNA的Tm分別降低15℃和11℃。全嘧啶PNA寡聚物和有高嘧啶/嘌呤比例的PNA寡聚物可與互補DNA結合形成異常穩定的PNA2/DNA三螺旋(P.E.Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；L.Betts等，Science，1995，270，1838-1841；H.Knudsen等，Nucleic Acids Res.，1996，24，494-500)。儘管PNA有醯胺鍵和核酸鹼基，PNA對核酸酶和蛋白酶都顯出很強的抗性。與DNA相比(DNA用強酸處理會脫嘌呤，用鹼金屬氫氧化物處理會水解)，PNA是完全酸穩定的且對弱鹼足夠穩定。
通常，PNA寡聚物是用已知的固相肽合成法合成的。一些研究小組獨立開發了新的單體策略以優化PNA寡聚物的合成。PNA單體的製備可分為合成適當保護的N-氨基乙基甘氨酸和適當保護的核酸鹼基乙酸衍生物，然後將這兩者偶聯。
據報導，PNA寡聚物合成的第一個合成策略是採用t-Boc/苄氧羰基保護基的Merrifield固相合成，其中，用t-Boc保護主鏈氨基，用苄氧羰基保護核酸鹼基的環外氨基(P.E.Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，9677-9678；M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895-1897；M.Egholm等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1993，800-801；K.L.Dueholm等，J.Org.Chem.，1994，59，5767-5773；WO 92/20702)。用t-Boc/苄氧羰基保護的PNA單體現在可在商業上獲得，但不便於使用，因為需要用TFA反覆處理以將t-Boc去保護，同時需要用苛刻的HF或三氟甲烷磺酸處理以從樹脂上切下並從核酸鹼基的環外胺上除去苄氧羰基的保護。因此，這種方法不能用來合成許多類型的經過修飾的PNA寡聚物，如PNA-DNA嵌合體。此外，考慮到從操作人員的安全和對自動化設備和生產線的腐蝕作用，使用危險的酸如HF或三氟甲烷磺酸在商業上不可取。此外，t-Boc/苄氧羰基保護法是一種區分的策略，它定義為保護基系統，其中，保護基用相同種類的試劑或條件去除，但依賴於不同的相對反應速度以依次除去各個保護基。例如，在t-Boc/苄氧羰基保護法中，兩種保護基都是酸不穩定的，但需要較強的酸以有效去除苄氧羰基。當使用酸完全去除更加酸不穩定的t-Boc基時，存在同時去除部分苄氧羰基的可能性。不幸的是，在合成寡聚物的每個合成循環中都必需從主鏈氨基上去除t-Boc基。因此，TFA足以將部分側鏈苄氧羰基過早地去保護，這就可能造成寡聚物分支並降低所需產物的總產率。
在尋找用於PNA寡聚物合成的較溫和的，與DNA寡聚物的合成不矛盾的去保護法的其它努力中，，一些研究小組開發出了用Mmt/醯基保護的PNA單體，其中，用Mmt保護主鏈氨基，用醯基保護核酸鹼基的環外氨基，如對胞嘧啶或腺嘌呤用苯甲醯基、甲氧苯醯基和叔丁基苯甲醯基，對鳥嘌呤用異丁烯基、乙醯基(D.W.Will等，Tetrahedron，1995，51，12069-12082；P.J.Finn等，Nucleic Acid Research，1996，24，3357-3363；D.A.Stetsenko等，Tetrahedron Lett.1996，3571-3574；G.Breipohl等，Tetrahedron，1997，14671-14686)。
其它用Fmoc/二苯甲基氧羰基保護的PNA單體也可在商業上獲得，其中，用Fmoc保護主鏈氨基，用二苯甲基氧羰基保護核鹼基的環外氨基(J.M.Coull等，US6,133,444)。但Fmoc/二苯甲基氧羰基法也有一些缺點，如Fmoc去保護時發生的副反應和溶液中單體的不穩定性。最重要的副反應是在Fmoc去保護條件下，核酸鹼基乙醯基從仲氨基官能團遷移到氨基乙基甘氨酸主鏈的游離N-末端氨基官能團(L.Christensen等，J.Pept.Sci.1995，1，175-183)。寡聚物合成每個循環中的N-乙醯基轉移反應導致副產物的積累，這種副產物由於有類似的極性和同樣的分子量而難以分離。而且，Fmoc保護基在痕量胺存在時非常不穩定。因此，選擇PNA單體的溶劑必需小心。通常，推薦高質量的N-甲基吡咯烷酮是。這在合成PNA寡聚物時需要較高花費。
還報導了使用Fmoc/苄氧羰基(S.A.Thomson等，Tetrahedron，1995，6179-6194)和Fmoc/Mmt(G.Breipohl等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1996，6，665-670)保護單體用於PNA寡聚物的合成。然而，就單體溶解性和製備、苛刻的反應條件和單體合成和/或PNA寡聚物合成中發生的副反應而言，所有這些方法都有嚴重缺點。
在其它尋找新單體的努力中，ISIS和Biocept報導了環狀單體。ISIS研究的第一種方法用嗎啉酮(morpholinone)代替被保護的主鏈(美國專利No.5,539,083)，但該方法有嚴重的缺點，即偶聯反應產生的羥基官能團需要在寡聚物合成的每個延伸步驟中轉化為胺官能團。或者，用N-t-Boc-哌嗪酮(piperazinone)代替被保護的氨基乙基甘氨酸部分(WO 00/02899)。但該方法也有嚴重的缺點，即寡聚化過程中單體的反應性，以及在上述線性t-Boc法中出現的同樣的問題。
儘管最近有發展，仍需要一種可提高產率、降低合成費用且適合自動合成和平行合成的新的單體。
發明概述本發明提供了新的單體，這種單體在PNA寡聚物合成中具有提高的功效且簡便。另一個目的是提供可方便地用於合成PNA寡聚物的自動合成儀等設備的PNA單體。
本發明的新單體是具有通式I的化合物 其中，R1、R2、R3、R4、R5分別可以是H，滷素，如F、Cl、Br或I，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的(如F和Cl)C1-C4烷基或滷化的(如F和Cl)C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基，R6可以是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈，和B是天然或非天然的核酸鹼基，其中，當所述核酸鹼基具有環外氨基官能團時，所述官能團受保護基保護，所述保護基在酸性條件下不穩定但在弱鹼性至中等鹼性條件下穩定。
本發明還提供了從通式V的化合物製造通式I的化合物的方法。
在另一個實施方案中，本發明提供了通式V的化合物和從通式II的化合物製備通式化合物的方法。
其中，R1、R2、R3、R4、R5分別可以是H，滷素，如F、Cl、Br或I，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的(如F和Cl)C1-C4烷基或滷化的(如F和Cl)C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基，R6可以是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈，R7可以是H，(C1-C4)烷基或芳基，和
B是天然或非天然的核酸鹼基，其中，當所述核酸鹼基具有環外氨基官能團時，所述官能團受保護基保護，所述保護基在酸性條件下不穩定但在弱鹼性至中等鹼性條件下穩定。
本發明還提供了從通式IV的化合物製備式I的化合物的方法。
本發明還提供了通式IV的化合物及其游離酸形式，以及它們的製備方法 其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定義，和HY是有機或無機酸。
本發明還提供了從通式II的化合物製備通式IV的化合物的方法。
同時，本發明提供了式II的化合物和它們的製備方法 其中，R1、R2、R3、R4、R5，R6和R7如上定義。
本發明涉及式I的化合物，其殘基如上定義。特別地，R6殘基可以是H或天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈.在另一個實施方案中，B可以是胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)。更特別地，B的保護基可以是苄氧羰基或二苯甲基氧代羰基。在其它實施方案中，式I的單體化合物可具有以下構造R1是硝基和R3是滷素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。或者，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。或者，R3是硝基和R1、R2、R4和R5是H。再或者，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。
本發明還涉及製造式I的化合物的方法，包括在通常用於肽合成的偶聯劑或混合酐存在下環化式VI的化合物(圖6)。式VI的殘基如上定義。
本發明還涉及製造式I的化合物的方法，包括在非親核的有機鹼和通常用於肽合成的偶聯劑存在下使式IV的化合物與核酸鹼基乙酸部分發生偶聯反應。
本發明涉及式V的化合物，其殘基如上定義。特別地，R6殘基可以是H或天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈。在另一個實施方案中，B可以是胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)。更特別地，B的保護基可以是苄氧羰基或二苯甲基氧羰基.在其它實施方案中，所述式V的化合物可有以下構造R1是硝基和R3是滷素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。或者，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。更特別地，R3是硝基和R1、R2、R4和R5是H。再則，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。再則，R7可以是甲基，乙基或叔丁基。
在另一個實施方案中，本發明涉及製造式V的化合物的方法，包括在非親核的有機鹼和通常用於肽合成的偶聯劑存在下使式II的化合物與核酸鹼基乙酸部分發生偶聯反應。
本發明涉及式II的化合物，其殘基如上定義。特別地，R6殘基可以是H或天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈。在其它實施方案中，所述式II的化合物可有以下構造R1是硝基和R3是滷素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。或者，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。或者，R3是硝基和R1、R2、R4和R5是H。再則，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。
本發明還涉及製造式II的化合物的方法，包括在非親核的有機鹼存在下使2-氨基乙基磺醯胺衍生物與滷代乙酸衍生物發生親核取代反應。
本發明還涉及具有式IV的化合物及其游離酸形式。式IV的殘基如上定義。但特別地，R6殘基可以是H或天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈。在其它實施方案中，所述式IV的化合物可有以下構造R1是硝基和R3是滷素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。或者，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。或者，R3是硝基和R1、R2、R4和R5是H。再則，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。再則，HY可以是HCl或TFA。
本發明還涉及製造式IV的化合物的方法，包括在通常用於肽合成的偶聯劑或混合酐存在下環化式III的化合物，然後在酸中將t-Boc去除。
本發明還涉及製造PNA寡聚物的方法，包括將式I的化合物連接在一起。
應當理解，上述「R」基團適用於所有式I-VI的化合物，包括特定實施方案中提到的R基團。還應理解，R基團適用於用本發明方法處理的化合物。
通過以下對本發明的描述、附圖和權利要求和將更全面地理解本發明的這些目的和其它目的。
附圖簡述通過下面的詳細描述和附圖將更全面地理解本發明，附圖僅以例舉方式給出，因此不是要限制本發明，其中

圖1顯示了用於DNA識別的天然和非天然產生的核酸鹼基的化學結構圖。
圖2顯示了用於DNA識別的天然和非天然產生的核酸鹼基的另一張化學結構圖。
圖3顯示了合成被保護的主鏈的略圖。
圖4顯示了另一種合成被保護的主鏈的略圖。
圖5顯示了合成作為單體前體的被保護的哌嗪酮的略圖。
圖6顯示了合成PNA單體的略圖。
圖7顯示了另一種合成PNA單體的略圖。
圖8顯示了合成PNA胸腺嘧啶單體的略圖。
圖9顯示了另一種合成PNA胸腺嘧啶單體的略圖。
圖10顯示了合成PNA胞嘧啶單體的略圖。
圖11顯示了另一種合成PNA胞嘧啶單體的略圖。
圖12顯示了合成PNA腺嘌呤單體的略圖。
圖13顯示了另一種合成PNA腺嘌呤單體的略圖。
圖14顯示了合成PNA或鳥嘌呤單體的略圖。
圖15顯示了另一種合成PNA或鳥嘌呤單體的略圖。
圖16顯示了從PNA單體合成PNA寡聚物的略圖。
優選實施方案詳述在本發明中，通式I的化合物的硝基苯磺醯基發揮重要作用，它不僅作為主鏈胺的保護基，而且作為偶聯反應的活化基團。具有上述特徵的單體被用於通過手動或自動合成儀合成PNA寡聚物，以及通過組合化學製備PNA寡聚物文庫。通式I的核酸鹼基B自然連接在天然發現的位置上，即胸腺嘧啶或胞嘧啶的1位和腺嘌呤或鳥嘌呤的9位，以及非天然產生的核酸鹼基(核酸鹼基類似物)或核酸鹼基連接部分。一些核鹼基和說明性的合成核酸鹼基顯示在圖1和圖2中。
製備被保護的主鏈製備通式I的新型單體的第一個步驟是合成式II的[2-(硝基苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物 R1、R2、R3、R4、R5，R6和R7如上定義。
參考圖3，N-[2-(硝基苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物的合成優選通過乙二胺用硝基苯磺醯氯的單保護反應，然後在非親核的有機鹼存在下使所得產物與滷代乙酸發生親核取代反應。硝基苯磺醯氯是通過商業獲得的或用已知方法製造的，如美國專利No.4,204,870中所述的方法。硝基苯磺醯氯是具有以下通式的化合物 R1、R2、R3，R4和R5如上定義。
滷代乙酸酯是具有以下通式的化合物 其中，X是滷素基團，如Cl、Br和I，和R7如上定義。
參考圖3，單-磺醯化反應可將硝基苯磺醯氯緩慢加入在不存在有機鹼的合適溶劑中的過量乙二胺溶液完成。上述反應的溶劑的例子有甲苯，苯，乙酸乙酯，四氫呋喃，二異丙醚，二乙醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳和乙腈。優選的溶劑是二氯甲烷。反應完成後，反應混合物用鹽水洗滌，用無水硫酸鈉乾燥並過濾。所需產物通過在濾液中加入乙酸固化。親核取代反應通過在合適溶劑中的單-磺醯化產物和非親核的有機鹼的混合物中加入滷代乙酸酯進行。上述反應的溶劑的例子有乙酸乙酯，四氫呋喃，二氯甲烷，氯仿，DMF和N-甲基吡咯烷酮。優選的溶劑是二氯甲烷。非親核的有機鹼的例子包括但不限於三乙胺、三丙胺、N，N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉和N-乙基嗎啉。優選的非親核的有機鹼是三乙胺。
或者，優選的N-[2-(硝基苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物是使2-氨基甘氨酸衍生物的伯胺與硝基苯磺醯氯的選擇性反應合成的(圖4)，2-氨基甘氨酸衍生物是用已知方法製造的(例如，其中R1是H，見S.A.Thomson等，Tetrahedron，1995，6179-6194；其中R1是被保護或未被保護的天然或非天然α-胺基酸的側鏈，見A.Puschl等，Tetrahedron Lett.，1998，39，4707-4710)。製備N-[2-(硝基苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物的偶聯反應是在室溫下在非親核的有機鹼存在下在N-(2-氨基乙基)-甘氨酸衍生物溶液中緩慢加入硝基苯磺醯氯進行的。上述反應的溶劑的例子有水，甲苯，苯，乙酸乙酯，四氫呋喃，二異丙醚，二乙醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳和乙腈。優選的溶劑是二氯甲烷。非親核的有機鹼的例子包括但不限於三乙胺，三丙胺N，N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉和N-乙基嗎啉。優選的非親核的有機鹼是三乙胺。通過薄層層析(TLC)監測反應完成後，反應混合物用水洗滌，乾燥並減壓蒸發以得到以得到所需產物。
製備1-(硝基苯磺醯基)-哌嗪-2-酮用來合成通式I的單體的具有式IV的第一個前體合成子是從式II的N-[2-(硝基苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物，通過水解，保護仲胺，環化和去除仲胺的保護基製備的(圖5)。
R1、R2、R3、R4、R5，R6和HY如上定義。
首先，通過添加過量的氫氧離子源將式II的N-[2-(硝基苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物轉化成相應的酸。優選的R2是甲基或乙基。氫氧離子源的例子包括但不限於氫氧化鋰，氫氧化鈉和氫氧化鉀。優選的氫氧離子源是氫氧化鋰。然後無需後處理用二-叔丁基二碳酸酯處理反應混合物來保護仲胺以提供具有以下通式的化合物
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定義。
水解反應優選通過在室溫下在N-[2-(硝基苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸衍生物溶液中加入氫氧化鋰(2當量)水溶液進行。通過TLC分析確定反應完成後，在反應混合物中加入氫氧化鋰水溶液(再1當量)。將反應混合物攪拌足夠長的時間。然後用乙酸乙酯提取除去過量的二-叔丁基二碳酸酯。然後酸化該水溶液，用二氯甲烷提取，乾燥並減壓蒸發以得到固體。上述反應的溶劑的例子是四氫呋喃水溶液，二噁烷水溶液和1，2-二甲氧基乙烷水溶液。優選的溶劑是四氫呋喃水溶液。
其次，使通式III的羧酸發生環化反應，然後將t-Boc去保護以得到通式IV的哌嗪酮衍生物。所述環化反應與羧酸的活化同時發生。羧酸的活化可通過肽合成的常規偶聯劑在室溫下完成。偶聯劑的例子包括但不限於HATU(L.A.Carpino等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，4397-4398)，HAPyU，TAPipU(A.Ehrlich等，TetrahedronLett.，1993，4781-4784)，HBTU(V.Dourtoglou等，Synthesis，1984，572-574)，TBTU，TPTU，TSTU，TNTU(R.Knorr等，Tetrahedron Lett.，1989，1927-1930)，TOTU，BOP(B.Castro等，Tetrahedron Lett.，1975，1219-1222)，PyBOP(J.Coste等，Tetrahedron Lett.，1990，205-208)，BroP(J.Coste等，Tetrahedron Lett.，1990，669-672)，PyBroP(J.Coste等，Tetrahedron Lett.，1991，1967-1970)，BOI(K.Akaji等，Tetrahedron Lett.，1992，3177-3180)，MSNT(B.Blankemeyer-Menge等，Tetrahedron Lett.，1990，1701-1704)，TDO(R.Kirstgen等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1987，1870-1871)，DCC，EDC。羧酸溶劑可選自四氫呋喃，二氯甲烷，氯仿，DMF和N-甲基吡咯烷酮。優選的溶劑是DMF。
或者，羧酸的活化可通過用烷基氯甲酸酯或烷醯基氯化物和非親核的有機鹼形成混合酐完成。烷基滷代甲酸酯或烷醯基氯化物的例子包括但不限於氯甲酸甲酯，氯甲酸乙酯，氯甲酸丙酯，氯甲酸丁酯，氯甲酸異丁酯，新戊醯氯化物和金剛羧基氯化物。最優選的醯基氯是氯甲酸異丁酯。使用氯甲酸異丁酯的環化反應是通過在-20℃-0℃下，向在合適的無水溶劑中的通式III的羧酸和非親核的有機鹼的反應液緩慢加入氯甲酸異丁酯進行的。非親核的有機鹼的例子包括但不限於三乙胺，三丙胺、N，N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉和N-乙基嗎啉。優選的非親核的有機鹼是N-甲基嗎啉。合適的無水溶劑的例子包括但不限於乙腈，氯仿，二氯甲烷，1，2-二甲氧基乙烷，二乙醚，二異丙醚和四氫呋喃。優選的溶劑是二氯甲烷和四氫呋喃。最優選的反應溫度是在-20℃完全加入氯甲酸異丁酯後使反應混合物緩慢升溫至0℃的溫度。
參考圖5，在酸的存在下將t-Boc基團去保護。酸的例子包括但不限於HCl，HBr，HF，HI，硝酸，硫酸，甲烷磺酸，TFA和三氟甲烷磺酸。優選的酸是HCl。去保護反應的溶劑包括二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，乙酸乙酯，甲苯和苯。最優選的溶劑是二氯甲烷。
PNA單體的合成根據本發明的方法，通式I的PNA單體可用至少兩種方法合成。參考圖6，第一種合成PNA單體的方法是在環化反應之前將被保護或未被保護的核酸鹼基乙酸部分引入受保護的線性主鏈。或者，PNA單體可從受保護的線性主鏈的環化開始合成，然後偶聯被保護或未被保護的核酸鹼基乙酸部分以產生所需產物。
方法1具有通式V的線性部分是通過用偶聯劑乙醯化核酸鹼基的乙酸部分從受保護的具有通式II的線性主鏈製備的。見圖6。
參考圖6，偶聯反應是將偶聯劑加入具有通式II的受保護的線性主鏈、核酸鹼基乙酸部分和非親核的有機鹼在合適的無水溶劑中的混合物中進行的。偶聯劑的例子包括但不限於HATU、HAPyU，TAPip，HBTU，TBTU，TPTU，TSTU，TNTU，TOTU，BOP，PyBOP，BroP，MSNT，TDO，DCC，EDC。優選的偶聯劑是PyBOP。非親核的有機鹼的例子包括但不限於三乙胺，三丙胺，N，N-二異丙基乙胺，N-甲基嗎啉和N-乙基嗎啉。優選的非親核的有機鹼是二異丙基乙胺。合適的無水溶劑的例子包括但不限於氯仿，二氯甲烷，1，2-二甲氧基乙烷，四氫呋喃，DMF和N-甲基吡咯烷酮。優選的溶劑是DMF。
通過加入過量的氫氧離子源將具有通式V的化合物轉化成相應的式VI的酸。優選的R2是甲基或乙基。氫氧離子源的例子包括但不限於氫氧化鋰，氫氧化鈉和氫氧化鉀。優選的氫氧離子源是氫氧化鋰。

R1、R2、R3、R4、R5，R6和B如上定義。
參考圖6，在羧酸活化的同時使羧酸發生環化反應製得通式I的PNA單體。羧酸的活化可在室溫下通過肽合成的常規偶聯劑進行。偶聯劑的例子包括但不限於HATU，HAPyU，TAPip，HBTU，TBTU，TPTU，TSTU，TNTU，TOTU，BOP，PyBOP，BroP，MSNT，TDO，DCC，EDC。優選的偶聯劑是PyBOP.非親核的有機鹼的例子包括但不限於三乙胺，三丙胺，N，N-二異丙基乙胺，N-甲基嗎啉和N-乙基嗎啉。優選的非親核的有機鹼是N，N-二異丙基乙胺。羧酸溶劑可選自四氫呋喃，二氯甲烷，氯仿，DMF和N-甲基吡咯烷酮。優選的溶劑是DMF。
或者，羧酸的活化可通過用烷基氯甲酸酯或烷醯基氯化物和非親核的有機鹼形成混合酐完成。烷基滷代甲酸酯或烷醯基氯化物的例子包括但不限於氯甲酸甲酯，氯甲酸乙酯，氯甲酸丙酯，氯甲酸丁酯，氯甲酸異丁酯，新戊醯氯化物和金剛烷羧基氯化物。最優選的醯基氯是氯甲酸異丁酯。使用氯甲酸異丁酯的環化反應是通過在-20℃-0℃下，向在合適的無水溶劑中的通式III的羧酸和非親核的有機鹼反應液緩慢加入氯甲酸異丁酯進行的。非親核的有機鹼的例子包括但不限於三乙胺，三丙胺、N，N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉和N-乙基嗎啉。優選的非親核的有機鹼是N-甲基嗎啉。合適的無水溶劑的例子包括但不限於乙腈，氯仿，二氯甲烷，1，2-二甲氧基乙烷，二乙醚，二異丙醚和四氫呋喃。優選的溶劑是二氯甲烷和四氫呋喃。最優選的反應溫度是在-20℃完全加入氯甲酸異丁酯後使反應混合物緩慢升溫至0℃的溫度。
方法2另一種方法是，本發明的PNA單體可通過將被保護或未被保護的核酸鹼基乙酸部分偶聯到通式IV的環狀前體來製備 R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定義。
參考圖7，環狀前體與被保護或未被保護的核酸鹼基乙酸部分的偶聯反應是在室溫下用肽合成的常規偶聯劑和非親核的有機鹼進行的。偶聯劑的例子包括但不限於HATU，HAPyU，TAPip，HBTU，TBTU，TPTU，TSTU，TNTU，TOTU，BOP，PyBOP，BroP，MSNT，TDO，DCC，EDC。優選的偶聯劑是PyBOP。非親核的有機鹼的例子包括但不限於三乙胺，三丙胺，N，N-二異丙基乙胺，N-甲基嗎啉和N-乙基嗎啉。優選的非親核的有機鹼是N，N-二異丙基乙胺.The溶劑可選自四氫呋喃，二氯甲烷，氯仿，DMF和N-甲基吡咯烷酮。優選的溶劑是DMF。
核酸鹼基和保護基本發明核酸鹼基的例子包括但不限於腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，尿苷，2，6-二氨基嘌呤和天然或非天然產生的核酸鹼基，如圖1和圖2所示。優選的核鹼基是腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤和胸腺嘧啶。核酸鹼基可以用保護基保護，用於合成PNA寡聚物酸。保護基可以是，但不限於，Boc，金剛烷氧基羰基(adamantyloxy羰基)，苄氧羰基(P.E.Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，9677-9679；M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895-1897；M.Egholm等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1993，800-801；K.L.Dueholm等，J.Org.Chem.，1994，59，5767-5773；WO 92/20702)，p-甲氧基苄氧羰基，二苯甲基氧羰基(美國專利No.6,133,444)，2-甲基硫代乙氧羰基(美國專利No.6,063,569)，Mmt(G.Breipohl等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1996，6，665-670)或酸不穩定保護基(T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Group in OrganicSynthesis，第三版，494-653頁)。
T-單體的合成T-單體是具有通式I-t的化合物 R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定義。
優選的單體是R1是硝基，R3可以是吸電子基團(electron withdrawing group)如F，Cl或三氟甲基。
R3是硝基，R1或R5可以是吸電子基團如F或Cl。
T-單體的前體，(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(如下所示)，是用已知方法製備的(K.L.Dueholm等，J.Org.Chem.，1994，59，5767-5773；WO 92/20702)。
參考圖8，通式V-t的化合物是在偶聯劑存在下使(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸與通式II的硝基苯磺醯基保護的主鏈酯發生偶聯反應製得的，從而得到具有以下通式的化合物 R1、R2、R3、R4、R5，R6和R7如上定義。
優選的R7是甲基或乙基。
通過加入過量的氫氧離子源將通式V-t的化合物轉化成相應的酸以得到具有通式VI-t的化合物。
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定義。
參考圖8，在羧酸活化的同時使羧酸發生環化反應製得通式I-t的PNA T-單體。羧酸的活化可通過肽合成的常規偶聯劑或混合酐進行。反應條件和試劑與上述相同。
或者，參考圖9，PNA T-單體可通過將(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸偶聯到通式IV的哌嗪酮衍生物來製備。反應條件和試劑與上述相同。
合成C-單體C-單體是通式I-c的化合物 R8可以是苄基或二苯甲基。
R1、R2、R3、R4、R5和R6如上定義。
優選的單體是R1是硝基，R3可以是吸電子基團如F，Cl或三氟甲基。或R3是硝基，R1或R5可以是吸電子基團如F或Cl。
PNA C-單體的前體，適當保護的(胞嘧啶-1-基)-乙酸(如下所示)，是用已知方法或其改進方法製造的，如美國專利No.6,133,444；美國專利No.6,063,569；Dueholm等，J.Org.Chem.，1994，59，5767-5773；WO 92/20702中所述的方法，在此將其全文併入以供參考。
R8可以是苄基或二苯甲基。
參考圖10，PNAC-單體是在偶聯劑存在下使適當保護的(胞嘧啶-1-基)-乙酸與通式II的硝基苯磺醯基保護的主鏈酯發生偶聯反應製備的，從而得到具有以下通式的化合物 R1、R2、R3、R4、R5，R6，R7和R8如上定義。
通過加入過量的氫氧離子源將通式V-c的化合物轉化成相應的酸以得到具有通式VI-c的化合物。
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定義。
參考圖10，在羧酸活化的同時使羧酸發生環化反應製得通式I-c的PNA單體。羧酸的活化可通過肽合成的常規偶聯劑或混合酐進行。反應條件和試劑與上述相同。
或者，參考圖11，PNA C-單體可通過將(胞嘧啶-1-基)-乙酸偶聯到通式IV的哌嗪酮衍生物來製備。反應條件和試劑與上述相同。
合成A-單體A-單體是通式I-a的化合物
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定義。
優選的單體是R1是硝基，R3可以是吸電子基團如F，Cl或三氟甲基。或者，R3是硝基，R1或R5可以是吸電子基團如F或Cl。
PNA A-單體的前體，適當保護的(腺嘌呤-9-基)-乙酸(如下所示)，是用已知方法或其改進方法製造的，如美國專利No.6,133,444；和S.A.Thomson等，Tetrahedron，1995，6179-6194中所述的方法，在此將其全文併入以供參考。。
R8選自苄基或二苯甲基。
參考圖12，PNA C-單體是在偶聯劑存在下使適當保護的(腺嘌呤-9-基)-乙酸與通式II的硝基苯磺醯基保護的主鏈酯發生偶聯反應製備的，從而得到通式V-a的化合物
R1、R2、R3、R4、R5，R6，R7和R8如上定義。
通過加入過量的氫氧離子源將通式V-a的化合物轉化成相應的酸以得到具有通式VI-a的化合物 R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定義參考圖12，在羧酸活化的同時使羧酸發生環化反應製得通式I-a的PNA單體。羧酸的活化可通過肽合成的常規偶聯劑或混合酐進行。反應條件和試劑與上述相同。
或者，參考圖13，PNA A-單體可通過將(腺嘌呤-9-基)-乙酸偶聯到通式IV的哌嗪酮衍生物來製備。反應條件和試劑與上述相同。
合成G-單體G-單體是通式I-g的化合物
R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定義。
優選的單體是R1是硝基和R3可以是吸電子基團如F，Cl或三氟甲基。或者，R3是硝基和R1或R5可以是吸電子基團如F或Cl。
PNA G-單體的前體，適當保護的(鳥嘌呤-9-基)-乙酸(如下所示)，是用已知方法或其改進方法製造的，如美國專利No.6,172,226中所示的方法。
R8可以是苄基或二苯甲基。
參考圖14，PNA G-單體是在偶聯劑存在下使適當保護的(鳥嘌呤-9-基)-乙酸與通式II的硝基苯磺醯基保護的主鏈酯發生偶聯反應製備的，從而得到通式V-g的化合物 R1、R2、R3、R4、R5，R6，R7和R8如上定義通過加入過量的氫氧離子源將通式V-g的化合物轉化成相應的酸以得到具有通式VI-g的化合物 R1、R2、R3、R4、R5，R6和R8如上定義參考圖14，在羧酸活化的同時使羧酸發生環化反應製得通式I-g的PNA單體。羧酸的活化可通過肽合成的常規偶聯劑或混合酐進行。反應條件和試劑與上述相同。
或者，參考圖15，PNA G-單體可通過將(鳥嘌呤-9-基)-乙酸偶聯到通式IV的哌嗪酮衍生物來製備。反應條件和試劑與上述相同。
合成PNA寡聚物化學文獻中報導的各種組合合成法通常可用於用本發明的單體合成PNA寡聚物。這些方法包括但不限於固相合成法和溶液相合成法。用上述方法合成PNA單體後，通過固相合成法在合適的支承材料(例如但不限於聚苯乙烯，聚氧乙烯-修飾的聚苯乙烯，如，例如Tentagel，受控多孔玻璃(Controlled Pore Glass))上構建PNA寡聚物，支承材料上有錨定基，潛在含有可切割的胺官能團。在固相合成法中，本發明的第一個PNA單體通過偶聯反應連接到固體支承物上。然後，下一個步驟是系統加工所需PNA寡聚物序列。這種加工包括反覆去保護/偶聯/帽化循環。在最後一個偶聯單體上的主鏈保護基硝基苯磺醯基在有機鹼存在下用合適的硫醇處理定量去除以釋放末端游離胺。一旦完成PNA寡聚物合成，通過在室溫下在含有甲酚作為陽離子清除劑的TFA中培育1-2小時將寡聚物從固體支承物上切下，並同時去除核酸鹼基保護基。
以下是合成PNA寡聚物的常規循環1.從樹脂上去除保護基以活化胺官能團。
2.在樹脂上連接胺基酸、接頭或具有末端保護的胺基的PNA單體。
3.洗滌。
4.在有機鹼存在下用乙酸酐帽化。
5.洗滌。
6.切除磺醯胺中過度反應的乙醯基。
7.洗滌。
8.將磺醯基去保護。
9.洗滌。
10.加入單體。
11.返回步驟3並重複步驟4-11。
在寡聚物合成的單體偶聯反應過程中，可用催化劑加速醯化反應，催化劑如乙酸汞、四甲基氟化銨，四乙基氟化銨，四丁基氟化銨，苄基三甲基氟化銨，氟化銫，三丁基膦，三苯基膦。優選的催化劑是四丁基氟化銨。反應速率還取決於溶劑和溫度。溶劑的例子包括但不限於DMF，N-甲基吡咯烷酮，二甲氧基乙烷，二氯甲烷，1，2-二氯甲烷，DMSO，四氫呋喃，六甲基磷醯胺(phophoramide)，四亞甲基碸，異丙醇，乙醇和所選溶劑的混合物。優選的溶劑是DMF。N-末端氨基保護基用硫醇去除，其溶劑中含有有機鹼。硫醇的例子包括但不限於C2-C20烷基硫醇，4-甲氧基甲苯硫醇，4-甲基苯硫醇，3，6-二噁-1，8-辛烷硫醇，4-氯甲苯硫醇，苄基硫醇，N-乙醯基半胱氨酸，N-(t-Boc)半胱氨酸甲酯，3-巰基丙酸甲酯，4-甲氧基苯硫醇。有機鹼的例子包括但不限於三乙胺，N，N-二異丙基乙胺，哌啶，N-甲基嗎啉和1，8-二氮雜二環[5，4，0]十一烷-7-酮。優選的有機鹼是N，N-二異丙基乙胺。
縮寫表。
t-Boc 叔丁氧羰基BOI 2-(苯並三唑-1-基)氧-1，3-二甲基-咪唑鎓六氟磷酸鹽BOP 苯並三唑基-1-氧-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽BroP溴代三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽DMF 二甲基甲醯胺Fmoc9-芴基甲氧羰基HAPyU O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-二(四亞甲基)脲鎓六氟磷酸鹽HATUO-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽HBTUO-(苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽MSNT2，4，6-均三甲苯磺醯-3-硝基-1，2，4-三唑(triazolide)Mmt 4-甲氧基苯基二苯基甲基PyBOP 苯並三唑基-1-氧-三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽PyBroP 溴代三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽TAPipU O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-二(五亞甲基)脲鎓四氟硼酸鹽
TBTU O-(苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽TDO 2，5-二苯基-2，3-二氫-3-氧代-4-羥基噻吩二氧化物TFA 三氟乙酸TNTU O-[(5-降冰片烯-2，3-二羧醯亞胺基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(O-[(5-Norbonene-2，3-dicarboximido)-1，1，3，3-tetramethylruoniumtetrafluoroborate)TOTU O-[(氰基(乙氧羰基)亞甲基)氨基]-1，1，3.3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽TPTU O-(1，2-二氫-2-氧代-1-吡啶基-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽TSTU O-(N-琥珀醯亞胺基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽通過以下實施例更聚體描述了本發明，除非另有說明，這些實施例不是要限制本發明。
實施例實施例1-N-(2-氨基乙基)-2-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽將1.2-乙二胺(60.1g，1.00mol)溶於二氯甲烷(1L)。在3小時內逐滴加入溶於二氯甲烷(100mL)的2-硝基-苯磺醯氯(22.16g，0.100mol)溶液。在攪拌30分鐘後，反應混合物用鹽水洗滌(1L×4)。有機層用硫酸鎂乾燥並過濾。在濾液中加入乙酸(6.0g，0.1mol)以沉澱固體。將固體濾出，用二氯甲烷(200mL)洗滌並在真空下乾燥以得到黃色固體狀的標題化合物(23.1g，76％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.01-7.95(m，2H)，7.88-7.83(m，2H)，2.90(t，2H)，2.60(t，2H)，1.87(s，3H)。
實施例2-N-(2-氨基乙基)-4-氯-2-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽標題化合物(22.5g，66％)是按照實施例1的方法由4-氯-2-硝基-苯磺醯氯(25.61g，0.1mol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.26(d，1H)，8.01-7.97(m，2H)，2.97(t，2H)，2.69(t，2H)，1.91(s，3H)。
實施例3-N-(2-氨基乙基)-4-氟-2-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽標題化合物(21.7g，67％)是按照實施例1的方法由4-氟-2-硝基-苯磺醯氯(23.96g，0.10mol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.11-8.06(m，2H)，7.78(m，1H)，2.94(t，2H)，2.67(t，2H)，1.89(s，3H)。
實施例4-N-(2-氨基乙基)-2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯胺乙酸鹽標題化合物(23.62g，63％)是按照實施例1的方法由2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯氯(28.96g，0.10mol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.56(s，1H)，8.28(d，1H)，8.24(d，1H)，2.92(t，2H)，2.65(t，2H)，1.87(s，3H)。
實施例5-N-(2-氨基乙基)-4-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽標題化合物(2.40g，78％)是按照實施例1的方法由4-硝基-苯磺醯氯(2.22g，10mmol)合成的。
實施例6-N-(2-氨基乙基)-2-氯-4-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽標題化合物(2.38g，70％)是按照實施例1的方法由4-氯-2-硝基-苯磺醯氯(2.56g，0.1mol)合成的。
實施例7-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯室溫下，在溶於二氯甲烷(100mL)的N-(2-氨基乙基)-2-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽(15.15g，49.6mmol)和三乙胺(15.16g，0.15mol)溶液中邊攪拌邊加入溴乙酸乙酯(16.7g，0.100mol)。再攪拌1小時後，反應混合物用鹽水洗滌(100mL)。有機層用硫酸鎂乾燥並過濾。濾液在真空下蒸發並在乙醚(100mL)中研磨殘餘物以得到白色固體狀的標題化合物(8.1g，49％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.02-7.96(m，2H)，7.87-7.84(m，2H)，4.05(q，2H)，3.23(s，2H)，2.95(t，2H)，2.57(t，2H)1.16(t，3H)。
實施例8-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(8.3g，46％)是按照實施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-4-氯-2-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽(16.79g，49.4mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.26(s，1H)，8.01(d，1H)，7.96(d，1H)，4.06(q，2H)，3.23(s，2H)，2.95(t，2H)，2.57(t，2H)，1.16(t，3H)。
實施例9-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(7.7g，42％)是按照實施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-4-氟-2-硝基-苯磺醯胺，乙酸鹽(16.79g，51.9mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.08(m，2H)，7.76(m，1H)，4.06(q，2H)，3.24(s，2H)，2.95(t，2H)，2.57(t，2H)，1.16(t，3H)。
實施例10-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(9.23g，46％)是按照實施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯胺乙酸鹽(18.76g，50.3mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.55(s，1H)，8.27 d，1H)，8.22(d，1H)，4.05(q，2H)，3.22(s，2H)，2.99(t，2H)，2.57(t，2H)，1.16(t，3H)。
實施例11-N-[2-(4-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(826mg，50％)是按照實施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-4-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽(1.52g，5.2mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.41(d，2H)，8.04(d，2H)，4.05(q，2H)，3.23(s，2H)，2.86(t，2H)，2.54(t，2H)，1.16(t，3H)。
實施例12-N-[2-(2-氯-4-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(885mg，48％)是按照實施例7的方法由N-(2-氨基乙基)-2-氯-4-硝基-苯磺醯胺乙酸鹽(1.68g，5mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.43(d，1H)，8.32(dd，1H)，8.22(d，1H)，4.04(q，2H)，3.20(s，2H)，2.96(t，2H)，2.54(t，2H)，1.16(t，3H)。
實施例13-N-[2-(4-甲基-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯室溫下，在溶於二氯甲烷(50mL)的按照Will(D.W.Will等，Tetrahedron，1995，51，12069-12802)所述方法製備的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸乙酯·2HCl(1.10g，5.0mmol)的二氯甲烷溶液中緩慢加入三乙胺(2.02g，20mmol)。然後在室溫下於5分鐘內在反應混合物中加入溶於二氯甲烷(10mL)的4-甲基-2-硝基-苯磺醯氯。將所得反應混合物在室溫下再攪拌2小時，並用水(30mL)洗滌。有機層用MgSO4乾燥並過濾。濾液在真空下蒸發以得到固體狀的所需產物(1.60g，92％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ7.87(d，1H)，7.81(s，1H)，7.66(d，1H)，4.06(q，2H)，3.24(s，2H)，2.91(t，2H)，2.57(t，2H)，2.44(s，3H)，1.17(t，3H)。
實施例14-N-[2-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(1.72g，90％)是按照實施例13的方法，將N-(2-氨基乙基)-甘氨酸、乙酯2HCl(1.10g，5.0mmol)和4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺醯氯(1.36g，5.0mmol)反應合成的。
實施例15-N-[2-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(1.83g，87％)是按照實施例13的方法，將N-(2-氨基乙基)-甘氨酸、乙酯2HCl(1.10g，5.0mmol)和4，6-二氯-2-硝基-苯磺醯氯(1.46g，5.0mmol)反應合成的。
實施例16-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-丙氨酸乙酯按照實施例13的方法，將用Puschl(A.Puschl等，Tetrahedron，1998，39，4707-4710)所述方法製備的N-(2-氨基乙基)-丙氨酸乙酯2HCl(1.165g，5.0mmol)與2-硝基-苯磺醯氯(1.11g 5.0mmol)反應，以得到標題化合物(1.64g，95％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.02-7.96(m，2H)，7.86(m，2H)，4.05(q，2H)，3.16(q，1H)，2.94(t，2H)，2.58(m，1H)，2.43(m，1H)，1.17(t，3H)，1.09(d，3H)。
實施例17-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-苯基甘氨酸甲酯標題化合物(716mg，91％)是按照實施例13的方法，將N-(2-氨基乙基)-苯基甘氨酸甲酯2HCl(416mg，2mmol)和2-硝基-苯磺醯氯(592mg，2.0mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.00-7.94(m，2H)，7.87-7.81(m，2H)，7.34-7.26(m，5H)，4.32(s，1H)，3.57(s，3H)，2.98(t，2H)，2.54-2.41(m，2H)。
實施例18-N-叔丁氧羰基-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸在溶於四氫呋喃(50mL)的N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(6.66g，20.1mmol)溶液中加入溶於水(30mL)的LiOH(1.64g，40mmol)溶液。在室溫下攪拌1小時後，將二-叔丁基二碳酸酯(6.55g，30mmol)加入反應混合物。所得反應混合物攪拌30分鐘，然後加入溶於水(15mL)的LiOH(0.82g，0.02mol)溶液。用TLC監測反應完全後，過濾除去沉澱物並在真空下蒸發四氫呋喃。殘餘溶液用乙醚(100mL)洗滌。加入2N HCl將含水層酸化至pH＝3並用二氯甲烷(100mL)提取。有機層用硫酸鎂乾燥並過濾。在真空下濃縮濾液以得到所需產物(7.9g，98％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.00(m，2H)，7.86(m，2H)，3.80(s，1H)，3.76(s，1H)，3.24(m，2H)，3.05(m，2H)，1.35(s，4.5H)，1.31(s，4.5H)。
實施例19-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(8.1g，92％)是按照實施例18的方法由N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(7.35g，20mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.28(s，1H)，7.97(s，2H)，3.78(s，1H)，3.76(s，1H)，3.24(m，2H)，3.06(m，2H)，1.35(s，4.5H)1.31(s，4.5H)。
實施例20-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(7.9g，89％)是按照實施例18的方法由N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(7.35g，21mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.14-8.02(m，2H)，7.76(m，1H)，3.82(s，1H)，3.77(s，1H)，3.24(m，2H)，3.05(m，2H)，1.36(s，4.5H)，1.32(s，4.5H)。
實施例21-N-叔丁氧羰基-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(8.62g，91％)是按照實施例18的方法由N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(8.00g，20mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.57(d，1H)，8.41(t，0.5H)，8.35(t，0.5H)，8.19(dd，1H)，3.82(s，1H)，3.75(s，1H)，3.24(t，2H)，3.09(m，1H)，1.34(s，4.5H)，1.30(s，4.5H)。
實施例22-N-叔丁氧羰基-[2-(4-甲基-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(7.80g，93％)是按照實施例18的方法由N-[2-(4-甲基-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(6.91g，0.02mol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ7.99-7.93(m，1H)，7.85(dd，1H)，7.82(s，1H)，7.67(d，1H)，3.81(s，1H)，3.76(s，1H)，3.23(m，2H)，3.05(m，2H)，2.44(s，3H)，1.36(s，4.5H)，1.31(s，4.5H)。
實施例23-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(413mg，91％)是按照實施例18的方法由N-[2-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(380mg，0.01mol)合成的。
實施例24-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(417mg，88％)是按照實施例18的方法由N-[2-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(400mg，1.0mmol)合成的。
實施例25-N-叔丁氧羰基-N-[2-(4-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(362mg，90％)是按照實施例18的方法由N-[2-(4-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(331mg，1.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.42(dd，2H)，8.03(d，2H)，8.01(br，1H)，3.80(s，1H)，3.22(m，2H)，2.96(m，2H)，1.34(s，4.5H)，1.31(s，4.5H)。
實施例26-N-叔丁氧羰基-N-[2-(2-氯-4-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(371mg，85％)是按照實施例18的方法由N-[2-(2-氯-4-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(366mg，20mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.44(q，1H)，8.35-8.27(m，2H)，8.20(d，1H)，3.81(s，1H)，3.73(s，1H)，3.22(t，2H)，3.06(m，2H)，1.35(s，4.5H)，1.30(s，4.5H)。
實施例27-N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-丙氨酸在溶於四氫呋喃(10mL)的N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基-乙基)-丙氨酸乙酯(1.04g，3mmol)溶液中加入溶於水(10mL)的LiOH(252mg，6mmol)溶液。在室溫下攪拌1小時後，將二-叔丁基二碳酸酯(983mg，4.5mmol)加入反應混合物。所得反應混合物攪拌5小時，然後加入溶於水(15mL)的LiOH(126mg，3mmol)溶液。用TLC監測反應完全後，過濾除去沉澱物並在真空下蒸發四氫呋喃。殘餘溶液用乙醚(20mL)洗滌。加入2N HCl將含水層酸化至pH＝3並用二氯甲烷(30mL)提取。有機層用硫酸鎂乾燥並過濾。在真空下濃縮濾液以得到所需產物(1.16g，93％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ7.99(m，2H)，7.87(m，2H)，4.31(q，0.4H)，4.03(q，0.6H)，3.37-3.19(m，2H)，3.10-2.95(m，2H)，1.35(s，4.5H)，1.33(s，4.5H)，1.30(d，1.5H)，1.29(d，1.5H)。
實施例28-N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-苯基甘氨酸標題化合物(583mg，81％)是按照實施例27的方法由N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-苯基甘氨酸甲酯(590mg，1.5mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ7.97-7.82(m，4H)，7.35-7.30(m，3H)，7.23-7.21(m，2H)，5.58(s，0.6H)，5.40(s，0.4H)，3.20-2.85(m，4H)，1.46(s，4.5H)，1.37(s，4.5H)。
實施例29-1-(2-硝基苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽在溶於二氯甲烷(100ml)的N-(叔-丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(8.06g，20mmol)溶液中加入二環己基碳二亞胺(5.16g，25mmol)。在室溫下攪拌2小時後，過濾除去沉澱物。將濾液濃縮，將殘餘物溶於乙酸乙酯(50mL)並冷卻至0℃。除去沉澱的固體並在濾液中加入溶於乙酸乙酯(100mL)的2N-HCl。混合物在室溫下再攪拌10小時。濾出沉澱產物，用乙酸乙酯(500mL)洗滌並在真空下乾燥以得到5.39g白色固體狀的標題化合物(79％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ9.95(br.s，2H)，8.38(d，1H)，8.04-7.95(m，2H)，4.09(dd，2H)，3.96(s，2H)，3.56(dd，2H)。
實施例30-1-(4-氯-2-硝基苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(4.3g，67％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(7.92g，18mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.01(br.s，2H)，8.42(d，1H)，8.35(dd，1H)，8.06(dd，1H)，4.07(t，2H)，3.95(s，2H)，3.55(t，2H)。
實施例31-1-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(4.2g，69％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(7.61g，18mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ9.91(br.s，2H)，8.43(m，1H)，8.27(m，1H)，7.87(m，1H)，4.06(dd，2H)，3.96(s，2H)，3.55(dd，2H)。
實施例32-1-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(2.55g，65％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(4.71g，10mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.16(br.s，2H)，8.71(s，1H)，8.60(d，1H)，8.35(d，1H)，4.13(dd，2H)，3.96(s，2H)，3.57(dd，2H)。
實施例33-1-(4-甲基-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(2.40g，71％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-甲基-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(4.19g，10mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ9.87(br.s，1H)，8.23(d，1H)，7.98(s，1H)，7.77(d，1H)，4.06(dd，2H)，3.95(s，2H)，3.55(dd，2H)，2.49(s，3H)。
實施例34-1-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(2.53g，68％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(4.54g，10mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.02(br.s，2H)，8.20(s，1H)，7.96(s，1H)，4.04(dd，2H)，3.96(s，2H)，3.53(dd，2H)，2.67(s，3H)。
實施例35-1-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(2.51g，64％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(4.74g，10mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.06(br.s，2H)，8.43(s，1H)，8.32(s，1H)，4.16(t，2H)，3.99(s，2H)，3.50(t，2H)。
實施例36-1-(4-硝基苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(208mg，65％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(4-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(403mg，1mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ9.92(br.s，2H)，8.43(d，2H)，8.29(d，2H)，4.17(dd，2H)，4.03(s，2H)，3.54(dd，2H)。
實施例37-1-(2-氯-4-硝基苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(239mg，67％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-氯-4-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(437mg，1mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.28(br.s，2H)，8.53(d，1H)，8.45(d，1H)，8.39(dd，1H)，4.25(dd，2H)，3.94(s，2H)，3.54(dd，2H)。
實施例38-1-(2-硝基-苯磺醯基)-3-甲基-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(450mg，67％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-丙氨酸(835mg，2mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.38(d，1H)，8.14(d，1H)，8.03(dd，1H)，7.98(dd，1H)，4.30(m，1H)，4.13(m，2H)，3.70(m，1H)，3.51(m，1H)，1.39(d，3H)。
實施例39-1-(2-硝基-苯磺醯基)-3-苯基-哌嗪-2-酮鹽酸鹽標題化合物(247mg，63％)是按照實施例29的方法由N-(叔丁氧羰基)-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-苯基甘氨酸(480mg，1mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.35(d，1H)，8.15(d，1H)，8.02(t，1H)，7.94(t，1H)，7.40(m，5H)，5.47(br s，1H)，4.24(m，2H)，3.69(m，1H)，3.60(m，1H)。
實施例40-(2-氨基-6-碘代嘌呤-9-基)-乙酸乙酯在溶於DMF(1960mL)的2-氨基-6-碘代-嘌呤(78.3g，0.3mol)溶液中加入溴乙酸乙酯(55.1g，0.33mol)和碳酸鉀(82.9g，0.6mol)。所得反應混合物在室溫下攪拌12小時。反應混合物在真空下濃縮至較小體積(約150mL)並將殘餘物溶於水。將固體濾出，用水和乙醚洗滌並在真空下乾燥以得到標題化合物(98.4g，95％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.06(s，1H)，6.90(br.s，2H)，4.94(s，2H)，4.17(q，2H)，1.22(t，3H)。
實施例41-[2-(二苯甲基氧羰基)-氨基-6-碘代嘌呤-9-基]-乙酸乙酯0℃下，在溶於THF(280mL)的(2-氨基-6-碘代嘌呤-9-基)-乙酸乙酯(13.9g，40mmol)溶液中加入三光氣(5.34g，18mmol)。再攪拌5分鐘後，緩慢加入N，N-二異丙基乙胺(24.4mL)並將和反應混合物在0℃攪拌30分鐘。然後加入二苯基甲醇，使所得反應混合物回復室溫並再攪拌13小時。加入1N HCl溶液中和反應混合物，並用氯化鈉和硫代硫酸鈉飽和。分離有機層並用乙酸乙酯提取含水層(200mL×3)。合併的有機層用鹽水洗滌(200mL×2)，用硫酸鈉乾燥並過濾。將濾液減壓蒸發並通過柱層析純化殘餘物以得到標題化合物(15.15g，68％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.88(bs，1H)，8.45(s，1H)，7.60-7.20(m，10H)，6.79(s，1H)，5.08(s，2H)，4.15(q，2H)，1.17(t，3H)。
實施例42-[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]-乙酸0℃下，在10分鐘內在溶於THF(110mL)的60％NaH(5.04g，126mmol)溶液中加入3-羥基丙腈，並將混合物再攪拌12分鐘。在冰浴中，在所得反應混合物中逐滴緩慢加入[2-(二苯甲基氧羰基)-氨基-6-碘代-嘌呤-9-基]-乙酸(11.12g，21mmol)。加入完全後，除去冰浴並繼續攪拌3.5小時。然後加入20％的檸檬酸水溶液將反應混合物酸化並用氯化鈉飽和。分離有機層並用THF(300mL×2)提取含水層。合併的有機層用硫酸鈉乾燥並過濾。在真空下除去溶劑，殘餘物在乙醇中重結晶。濾出固體，用冷的乙醇洗滌並在真空下乾燥以得到所需產物(9.00g)。
實施例43-[2-(苄氧羰基)-氨基-6-碘代-嘌呤-9-基]-乙酸乙酯標題化合物(12.42g，64.4％)是按照實施例41的方法，將(2-氨基-6-碘代嘌呤-9-基)-乙酸乙酯(13.9g，40mmol)和光氣反應，然後用苄基醇處理製得的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.83(bs，1H)，8.48(s，1H)，7.50-7.30(m，5H)，5.18(s，2H)，5.11(s，2H)，4.19(q，2H)，1.21(t，3H)。
實施例44-[2-(苄氧羰基)-氨基-6-碘代嘌呤-9-基]-乙酸10℃下，在存在於四氫呋喃(50mL)和水(50mL)中的[2-(苄氧羰基)-氨基-6-碘代-嘌呤-9-基]-乙酸乙酯(10.02g，20.8mmol)懸液中加入氫氧化鋰水合物(2.83g，20.8mmol)。所得反應混合物攪拌30分鐘。然後加入1N HCl將所述混合物酸化至pH＝3。濾出沉澱的固體，用水和乙醚洗滌並在真空下乾燥以得到標題化合物(9.81g)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.75(s，1H)，8.44(s，1H)，7.50-7.30(m，5H)，5.17(s，2H)，4.97(s，2H)。
實施例45-[2-N-(苄氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]-乙酸標題化合物(5.44g，79.2％)是按照實施例42的方法由[2-(苄氧羰基)-氨基-6-碘代嘌呤-9-基]-乙酸(9.06g，20mmol)合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ11.54(s，1H)，11.37(s，1H)，7.94(s，1H)，7.46-7.33(m，5H)，5.28(s，2H)，4.87(s，2H)。
實施例46-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸乙酯室溫下，在DMF(15mL)中N-[2-(2-硝基-磺醯氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.67g，5mmol)，(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.92g，5mmol)和PyBOP(3.12g，6mmol)的混合物中加入N，N-二異丙基乙胺(1.31mL，7.5mmol)。所得反應混合物在相同溫度下攪拌7小時，並在真空下除去溶劑。將殘餘物溶於乙酸乙酯(50mL)並用1N HCl水溶液、飽和的碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌。有機層用硫酸鎂乾燥並過濾。將濾液濃縮並用乙醇研磨殘餘物。濾出所得固體並在真空下乾燥以得到白色固體狀的標題化合物(2.35g，93％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.29(s，0.6H)，11.26(s，0.4H)，8.25-7.87(m，5H)，7.30(s，0.6H)，7.23(s，0.4H)，4.64(s，1.2H)，4.46(s，0.8H)，4.29(s，0.8H)，4.16(q，0.8H)，4.07(q，1.2H)，4.00(s，1.2H)，3.49(t，1.2H)，3.21(q，1.2H)，3.12-3.01(m，1.6H)，1.75(s，3H)，1.22(t，1.2H)，1.17(t，1.8H)。
實施例47-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸乙酯標題化合物(2.46g，92％)是按照實施例46的方法將N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.84g，5mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.92g，5mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.6H)，11.28(s，0.4H)，8.31-7.95(m，4H)，7.31(s，0.6H)，7.23(s，0.4H)，4.64(s，1.2H)，4.46(s，0.8H)，4.28(s，0.8H)，4.16(q.0.8H)，4.07(q.1.2H)，4.00(s，1.2H)，3.49(t，1.2H)，3.22(q，1.2H)，3.12-3.01(m，1.6H)，1.74(s，3H)，1.22(t，1.2H)，1.17(t，1.8H)。
實施例48-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸乙酯標題化合物(2.35g，91％)是按照實施例46的方法將N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.76g，5mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.92g，5mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.30(s，0.6H)，11.27(s，0.4H)，8.28-8.05(m，2.8H)，7.78(m，1.2H)，7.31(s，0.6H)，7.23(s，0.4H)，4.65(s，1.2H)，4.47(s，0.8H)，4.30(s，0.8H)，4.16(q.0.8H)，4.07(q.1.2H)，4.00(s，1.2H)，3.49(t，1.2H)，3.22(q，1.2H)，3.12-3.01(m，1.6H)，1.75(s，3H)，1.23(t，1.2H)，1.18(t，1.8H)。
實施例49-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸乙酯標題化合物(2.69g，95％)是按照實施例46的方法將N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(2.00g，5mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.92g，5mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.55H)，11.28(s，0.45H)，8.57(s，0.55H)，8.54(s，0.45H)，8.50(t，0.55H)，8.38(t，0.45H)，8.29-8.18(m，2H)，7.31(s，0.55H)，7.22(s，0.45H)，4.64(s，1.1H)，4.46(s，0.9H)，4.21(s，0.9H)，4.16(q.0.9H)，4.07(q.1.1H)，3.95(s，1.1H)，3.49(t，1.1H)，3.37(q，1.1H)，3.25(t，0.9H)，3.09(t，0.9H)，1.75(s，3H)，1.23(t，1.35H)，1.18(t，1.65H)。
實施例50-N-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(2.45g，88％)是按照實施例46的方法將N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.33g，4mmol)與2-[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酸(1.51g，4mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.99(s，0.6H)，10.98(s，0.4H)，8.30-7.80(m，5H)，7.50-7.25(m，10H)，6.94(t，1H)，6.79(s，1H)，4.79(s，1.2H)，4.61(s，0.8H)，4.33(s，0.8H)，4.15(q，0.8H)，4.05(q，1.2H)，4.01(s，1.2H)，，3.52(t，1.2H)，3.36(t，0.8H)，3.24(q，1.2H)，3.02(q，0.8H)，1.23(t，1.2H)，1.15(t，1.8H)。
實施例51-N-{[4-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯標題化合物(產率78％)是按照實施例46的方法合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.15-8.06(m，1H)，7.84-7.57(m，5H)，7.38-7.32(m，6H)，7.14(t，0.7H)，6.44(t，0.3H)，5.20(s，2H)，4.93(s，1.4H)，4.55(s，0.6H)，4.36(s，0.6H)，4.26(q，0.6H)，4.17(q，1.4H)4.03(s，1.4H)，3.71(t，1.4H)，3.57(t，0.6H)，3.39(q，1.4H)，3.30(q，0.6H)，1.31(t，0.9H)，1.24(t，2.1H)。
實施例52-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸10℃下，在溶於THF(10mL)的N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸乙酯(1.00g，2.0mmol)溶液中加入溶於水(10mL)的氫氧化鋰(210mg，5mmol)。攪拌1.5小時後，加入1N HCl將反應混合物酸化至pH＝2-3。濾出沉澱的固體，用水洗滌並在真空下乾燥以得到白色固體狀的標題產物(896mg，95％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.30(s，0.6H)，11.27(s，0.4H)，8.22-7.85(m，5H)，7.31(d，0.6H)，7.23(d，0.4H)，4.63(s，1.2H)，4.45(s，0.8H)，4.19(s，0.8H)，4.16(q.0.8H)，3.93(s，1.2H)，3.47(t，1.2H)，3.34(t，0.8H)，3.20(q，1.2H)，3.04(q.0.8H)，1.75(s，3H)。
實施例53-N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸標題化合物(1.40g，93％)是按照實施例52的方法由N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸乙酯(1.60g，3.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.55H)，11.28(s，0.45H)，8.33-7.95(m，4H)，7.31(s，0.55H)，7.23(s，0.45H)，4.63(s，1.1H)，4.44(s，0.9H)，4.20(s，0.9H)，4.00(s，1.1H)，3.47(t，1.1H)，3.34(t，0.9H)，3.19(q，1.1H)，3.04(q，0.9H)，1.75(s，3H)。
實施例54-N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸標題化合物(0.92g，94％)是按照實施例52的方法由N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸乙酯(1.03g，2.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.30(s，0.6H)，11.28(s，0.4H)，8.29-8.05(m，2.8H)，7.78(m，1.2H)，7.31(s，0.6H)，7.23(s，0.4H)，4.63(s，1.2H)，4.44(s，0.8H)，4.20(s，0.8H)，3.94(s，1.2H)，3.46(t，1.2H)，3.34(t，0.8H)，3.20(q，1.2H)，3.04(q.0.8H)，1.75(s，3H)。
實施例55-N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸標題化合物(1.02g，95％)是按照實施例52的方法由N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸乙酯(1.14g，2.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.55H)，11.28(s，0.45H)，8.58(s，0.55H)，8.54(s，0.45H)，8.51(t，0.55H)，8.38(t，0.45H)，8.29-8.18(m，2H)，7.31(s，0.55H)，7.22(s，0.45H)，4.63(s，1.1H)，4.45(s，0.9H)，4.20(s，0.9H)，3.94(s，1.1H)，3.48(t，1.1H)，3.37(t，0.9H)，3，24(q，1.1H)，3.09(q，0.9H)，1.75(s，3H)。
實施例56-N-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸10℃下，在溶於THF(10mL)的N-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯(1.91g，2.75mmol)溶液中加入溶於水(9mL)的氫氧化鋰(290mg，6.9mmol)。攪拌1.5小時後，加入1N HCl溶液將反應混合物酸化至pH＝3-4。含水層用氯化鈉飽和並分離有機層。含水層用THF(15mL×2)提取。合併的有機層用硫酸鈉乾燥並過濾。將濾液濃縮並用乙醇研磨以沉澱固體。將沉澱的固體濾出，用水洗滌並在真空下乾燥以得到白色固體狀的標題產物(1.42g，78％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.25-7.80(m，5H)，7.50-7.25(m，10H)，6.94(d，0.6H)，6.92(d，0.4H)，6，79(1H，s)，4.78(s，1.2H)，4.60(s，0.8H)，4.22(s，0.8H)，3.94(s，1.2H)，3.50(t，1.2H)，3.35(t，0.8H)，3.24(q，1.2H)，3.02(q，0.8H)。
實施例57-N-{[4-N-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸標題化合物(產率70％)是按照實施例56的方法由N-{[4-N-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸乙酯合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.26-7.83(m，5H)，7.44-7.33(m，5H)，7.02(d，0.6H)，7.00(d，0.4H)，5.19(s，2H)4.80(s，1.2H)，4.61(s，0.8H)，4.23(s，0.8H)，3.94(s，1.2H)，3.50(t，1.2H)，3.35(t，0.8H)，3.24(q，1.2H)，3.02(q，0.8H)。
實施例58-1-(2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮-20℃下，在溶於THF(10mL)的N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸(469mg，1.0mmol)和N-甲基嗎啉(330μL，3mmol)溶液中加入氯甲酸異丁酯(isobutyl chloroformatre)(205mg，1.5mmol)。使反應混合物在1小時內回復0℃。然後在反應混合物中加入水(10mL)以沉澱固體。將固體濾出，用水洗滌，在真空下乾燥以得到標題化合物(442mg，98％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.32(s，0.6H)，11.30(s，0.4H)，8.35(m，1H)，8.12(dd，1H)，8.04-7.96(m，2H)，7.35(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)， 4.67(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.41(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.04(m，1.2H)，3.95(m，1.2H)，3.90-3.85(m，1.6H)，1.75(s，3H)。
實施例59-1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮)標題化合物(933mg，96％)是按照實施例58的方法由N-[2-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸(1.01g，2.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，0.6H)，11.31(s，0.4H)，8.40(d，1H)，8.33(dd，1H)，8.08(dd，1H)，7.34(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.66(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.41(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，4.02(m，1.2H)，3.94(m，1.2H)，3.89-3.82(m，1.6H)，1.74(s，3H)。
實施例60-1-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(451mg，96％)是按照實施例58的方法由N-[2-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸(487mg，1.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，0.6H)，11.31(s，0.4H)，8.41(m，1H)，8.25(dd，1H)，7.88(m，1H)，7.34(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.66(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.41(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，4.02(m，1.2H)，3.94(m，1.2H)，3.88-3.82(m，1.6H)，1.74(s，3H)。
實施例61-1-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(493mg，95％)是按照實施例58的方法由N-[2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基氨基)-乙基]-N-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-甘氨酸(537mg，1.0mmol)合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，0.6H)，11.31(s，0.4H)，8.69(s，1H)，8.56(dd，1H)，8.39(dd，1H)，7.34(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.67(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.42(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.05(m，1.2H)，3.95(m，1.2H)，3.91-3.85(m，1.6H)，1.75(s，3H)。
實施例62-4-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮在溶於THF(24mL)的N-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸(1.20g，1.8mmol)溶液中加入N-甲基嗎啉(0.6mL，5.42mmol)，然後使混合物冷卻至-20℃。在相同溫度攪拌5分鐘後，在反應混合物中加入氯甲酸異丁酯(0.30mL，2.31mmol)。使所得混合物在1小時內緩慢回復至0℃。然後在真空下蒸發反應混合物並將其溶於乙酸乙酯和乙腈的混合物。用飽和NaCl溶液洗滌該溶液，並用硫酸鈉乾燥並過濾。在真空下蒸發濾液並用甲醇研磨以沉澱固體。濾出固體，用甲醇洗滌並在真空下乾燥以得到標題化合物0.9g(77％)。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ8.35(t，1H)，8.12-7.95(m，3H)，7.90(d，0.6H)，7.84(d，0.4H)，7.48-7.28(m，10H)，6.95(d，0.6H)，6.94(d，0.4H)，6.79(s，1H)，4.82(s，1.2H)，4.73(s，0.8H)，4.45(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.10-3.95(m，2.4H)，3.95-3.80(m，1.6H)。
實施例63-4-{[4-N-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-1-(2-硝基-苯磺醯基)哌嗪-2-酮標題化合物(產率90％)是按照實施例62的方法由N-{[4-N-(苄氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-N-[2-(2-硝基-苯磺醯基氨基)-乙基]-甘氨酸合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ10.76(s，1H)，8.36(t，1H)，8.12(dd，1H)，8.02-7.81(m，3H)，7.41-7.31(m，5H)，7.03(s，0.4H)，7.02(s，0.6H)，5.17(s，2H)，4.82(s，1.2H)，4.74(s，0.8H)，4.45(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.06(m，1.2H)，3.98(m，1.2H)，3.91(m，0.8H)，3.84(m，0.8H)。
實施例64-1-(2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮室溫下，在溶於DMF(11mL)的1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(1.13g，3.5mmol)，(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.64g，3.5mmol)和PyBOP(2.00g，3.85mmol)的混合物中加入N，N-二異丙基乙胺(0.91mL)。再攪拌2小時後，將反應混合物緩慢加入乙醇水溶液以沉澱固體。濾出固體，用乙醇和乙醚洗滌並在真空下乾燥以得到標題化合物(1.50g，95％)。
實施例65-1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(1.60g，94％)是按照權利要求64的方法將1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(1.25g，3.5mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(0.64g，3.5mmol)反應合成的。
實施例66-1-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2酮標題化合物(900mg，96％)是按照權利要求64的方法將1-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(680mg，2.0mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(369mg，2.0mmol)反應合成的。
實施例67-1-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(980mg，94％)是按照權利要求64的方法將1-(2-硝基-4-三氟甲基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(780mg，2mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(369mg，2mmol)反應合成的。
實施例68-1-(4-甲基-2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(888mg，95％)是按照權利要求64的方法將1-(4-甲基-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(672mg，2.0mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(369mg，2.0mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，0.6H)，11.32(s，0.4H)，8.22(m，1H)，7.96(s，1H)，7.78(m，1H)，7.35(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.66(s，1.2H)，4.58(s，0.8H)，4.39(s，0.8H)，4.24(s，1.2H)，4.01(m，1.2H)，3.93(m，1.2H)，3.88-3.81(m，1.6H)，2.49(s，3H)，1.74(s，3H)。
實施例69-1-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(913mg，91％)是按照權利要求64的方法將1-(4-氯-6-甲基-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(740mg，2.0mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(368mg，2.0mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.34(s，0.6H)，11.32(s，0.4H)，8.19(s，1H)，7.95(s，1H)，7.34(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.67(s，1.2H)，4.59(s，0.8H)，4.40(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，3.99(m，1.2H)，3.92(m，1.2H)，3.82(s，1.6H)，2.64(s，3H)，1.74(s，3H)。
實施例70-1-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(919mg，88％)是按照權利要求64的方法將1-(4，6-二氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(781mg，2.0mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(368mg，2.0mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.34(s，0.6H)，11.32(s，0.4H)，8.42(d，0.4H)，8.41(d，0.6H)，8.32(d，0.4H)，8.30(d，0.6H)，7.35(s，0.6H)，7.27(s，0.4H)，4.69(s，1.2H)，4.58(s，0.8H)，4.42(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.11(t，1.2H)，3.97(t，0.8H)，3.93(t，1.2H)，3.82(t，0.8H)，1.74(s，3H)。
實施例71-1-(4-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(151mg，95％)是按照權利要求64的方法將1-(4-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(113mg，0.35mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(64mg，0.35mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，0.6H)，11.29(s，0.4H)，8.44(d，2H)，8.29(d，2H)，7.34(s，0.6H)，7.27(s，0.4H)，4.64(s，1.2H)，4.55(s，0.8H)，4.33(s，0.8H)，4.18(s，1.2H)，4.14(t，1.2H)，4.00(t，0.8H)，3.90(t，1.2H)，3.80(t，0.8H)，1.74(s，3H)。
實施例72-1-(2-氯-4-硝基-苯磺醯基)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)-乙醯基]-哌嗪-2-酮標題化合物(159mg，94％)是按照權利要求64的方法將1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(125mg，0.35mmol)與(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(64mg，0.35mmol)反應合成的。1H-NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.32(s，0.6H)，11.30(s，0.4H)，8.53(d，1H)，8.47-8.40(m，2H)，7.35(s，0.6H)，7.28(s，0.4H)，4.68(s，1.2H)，4.57(s，0.8H)，4.38(s，0.8H)，4.24(s，1.2H)，4.18(t，1.2H)，4.04(t，0.8H)，3.95(t，1.2H)，3.84(t，0.8H)，1.75(s，3H)。
實施例73-4-{[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-1-基]乙醯基}-1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮5℃下，在溶於DMF(20mL)的1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(0.76g，2.36mmol)，[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酸(1.0g，2.47mmol)和PyBOP(1.35g)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(0.95mL)。再攪拌2小時後，反應混合物用乙酸乙酯(200mL)和水(150mL)稀釋。分離有機層並用水、5％碳酸氫鈉水溶液、10％檸檬酸水溶液和鹽水洗滌。有機層用硫酸鈉乾燥並減壓濃縮。殘餘物通過柱層析純化以得到標題化合物(830mg，58％)。1H NMR(DMSO-d6)δ10.95(s，1H)，8.59(s，0.6H)，8.58(s，0.4H)，8.40-8.36(m，1H)，8.33(s，0.6H)，8.31(s，0.4H)，8.14(d，1H)，8.06-7.96(m，2H)，7.54-7.27(m，10H)，6.82(s，1H)，5.39(s，1.2H)，5.30(s，0.8H)，4.56(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.12-4.08(m，2.4H)，3.92-3.86(m，1.6H)。
實施例74-4-{[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-1-基]-乙醯基}-1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮標題化合物(810mg，56％)是按照實施例73的方法將1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(712mg，2.0mmol)與[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酸(779mg，2.0mmol)反應合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ11.05(s，1H)，8.60(s，0.6H)，8.59(s，0.4H)，8.43-8.41(m，1H)，8.37-8.32(m，2H)，8.08(m，1H)，7.53-7.27(m，10H)，6.82(s，1H)，5.39(s，1.2H)，5.31(s，0.8H)，4.56(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.12-4.08(br.m，2.4H)，3.90-3.85(m，1.6H)。
實施例75-4-{[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙醯基}-1-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮標題化合物(805mg，58％)是按照實施例73的方法將1-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(679mg，2.0mmol)與[6-N-(二苯甲基氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酸(807mg，2.0mmol)反應合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ10.95(s，1H)，8.59(s，0.6H)，8.58(s，0.4H)，8.47-8.40(m，1H)，8.33(s，0.6H)，8.30(s，0.4H)，8.26(m，1H)，7.88(m，1H)，7.53-7.27(m，10H)，6.82(s，1H)，5.38(s，1.2H)，5.30(s，0.8H)，4.56(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.12-4.06(m，2.4H)，3.91-3.85(br.m，1.6H)。
實施例76-4-{[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]-乙醯基}-1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮To a溶液of 4-[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]-乙酸(1.89g，4.5mmol)，1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(1.45g，4.5mmol)和PyBOP(2.81g，5.4mmol)在DMF(13mL)中加入N，N-二異丙基乙胺(1.96mL，13mmol)在室溫下.再攪拌1小時後，反應混合物酸化至pH＝3-4 by adding 20％aqueous citric acid溶液.將沉澱的固體濾出，washed with brine和recrystallized from乙腈以得到標題化合物(1.15g，37％)。1H NMR(DMSO-d6)δ11.63(s，1H)，11.24(s，1H)，8.37(m，1H)，8.13(dd，1H)，8.06-7.97(m，2H)，7.82(s，0.6H)，7.78(s，0.4H)，7.46-7.28(m，10H)，6.86(s，1H)，5.15(s，1.2H)，5.07(s，0.8H)，4.52(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.12-4.02(m，2.4H)，3.94-3.83(m，1.6H)。
實施例77--{[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鳥嘌呤-1-基]乙醯基}-1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮10℃下，在溶於DMF(10mL)的4-[2-N-(二苯甲基氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]-乙酸(1.26g，3.0mmol)、1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(1.07g，3.0mmol)和PyBOP(1.87g，3.6mmol)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(1.05ml，6.0mmol)。再攪拌1小時後，減壓濃縮反應混合物並將殘餘物溶於乙酸乙酯。溶液用水、飽和碳酸氫鈉溶液、20％檸檬酸水溶液和鹽水洗滌。有機層用硫酸鎂乾燥和減壓蒸發。殘餘物通過柱層析純化以得到標題化合物(1.25g，58％)。1H NMR(DMSO-d6)δ11.63(br.s，1H)，11.25(br.s，1H)，8.43-8.32(m，2H)，8.09(m，1H)，7.81(s，0.6H)，7.76(s，0.4H)，7.46-7.28(m，10H)，6.86(s，1H)，5.14(s，1.2H)，5.06(s，0.8H)，4.52(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.10-4.00(m，2.4H)，3.92-3.82(m，1.6H)實施例78-4-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙醯基}-1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮標題化合物(2.53g，78％)是按照實施例77的方法將1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(679mg，2.0mmol)與[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酸(1.90g，5.0mmol)反應合成的。
實施例79-4-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]乙醯基}-1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮標題化合物(0.56g，27％)是按照實施例77的方法將1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(1.07g，3.0mmol)與[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]-乙酸(1.14g，3.0mmol)反應合成的7.1H NMR(DMSO-d6)δ10.98(s，1H)，8.40(s，1H)，8.32(m，1H)，8.07(m，1H)，7.89(d，0.6H)，7.85(d，0.4H)，7.46-7.28(m，1H)，6.96(m，1H)，6.79(s，1H)，4.81(s，1.2H)，4.73(s，0.8H)，4.45(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.07-3.97(m，2.4H)，3.90-3.80(m，1.6H)。
實施例80-4-{[4-N-(二苯甲基氧羰基)-胞嘧啶-1-基]乙醯基}-1-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮標題化合物(1.19g，60％)是按照實施例77的方法將1-(4-氟-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(1.02g，3.0mmol)與[4-N-(二苯甲基氧代羰基)-胞嘧啶-1-基]乙酸(1.14g，3.0mmol)反應合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ10.98(s，1H)，8.41(m，1H)，8.24(dd，1H)，7.87(m，2H)，7.50-7.25(m，10H)，6.96(m，1H)，6.79(s，1H)，4.81(s，1.2H)，4.73(s，0.8H)，4.45(s，0.8H)，4.27(s，1.2H)，4.06-3.95(m，2.4H)，3.90-3.80(m，1.6H)。
實施例81-4-{[6-N-(苄氧羰基)-腺嘌呤-9-基]乙醯基}-1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮標題化合物(731mg，61％)是按照實施例77的方法將1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(644mg，2.0mmol)與[6-N-(苄氧羰基)-腺嘌呤-9-基]-乙酸(655mg，2.0mmol)反應合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ10.69(s，1H)，9.00(m，1H)，8.71(m，1H)，8.63-8.58(m，2H)，8.31(s，0.6H)，8.29(s，0.4H)，7.47-7.33(m，5H)，5.39(s，1.2H)，5.29(s，0.8H)，5.21(s，2H)，4.57(s，0.8H)，4.29(s，1.2H)，4.15-4.09(m，2.4H)，3.93-3.86(m，1.6H)。
實施例82-4-{[2-N-(苄氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]乙醯基}-1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮室溫下，在溶於DMF(13mL)的[2-N-(苄氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]-乙酸(1.48g，4.5mmol)，1-(2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(1.45g，4.5mmol)和PyBOP(2.81g，5.4mmol)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(1.96mL，13mmol)。再攪拌40分鐘後，反應混合物用水(80mL)稀釋以沉澱固體。濾出固體，用乙醇洗滌並用乙腈和THF研磨以得到純的產物(1.56g，58％)。1H NMR(DMSO-d6)δ11.47(s，1H)，11.38(s，1H)，8.40-7.96(m，4H)，7.82(s，0.6H)，7.78(s，0.4H)，7.45-7.35(m，5H)，5.25(s，2H)，5.13(s，1.2H)，5.04(s，0.8H)，4.51(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，4.10-4.02(m，2.4H)，3.93-3.83(m，1.6H)。
實施例83-4-{[2-N-(苄氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]乙醯基}-1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮標題化合物(1.32g，60％)是按照權利要求82的方法將1-(4-氯-2-硝基-苯磺醯基)-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(1.25g，3.5mmol)與[2-N-(苄氧羰基)-鳥嘌呤-9-基]-乙酸(1.15g，3.5mmol)反應合成的。1H NMR(DMSO-d6)δ11.46(s，1H)，11.37(s，1H)，8.44-8.31(m，2H)，8.09(m，1H)，7.82(s，0.6H)，7.78(s，0.4H)，7.46-7.33(m，5H)，5.25(s，2H)，5.12(s，1.2H)，5.04(s，0.8H)，4.51(s，0.8H)，4.26(s，1.2H)，4.10-4.00(m，2.4H)，3.92-3.82(m，1.6H)。
實施例84-3-甲基-1-(2-硝基-苯磺醯)-4-[(胸腺嘧啶-1-基)乙醯基]-哌嗪-2酮室溫下，在溶於DMF(1mL)的(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(55mg，0.30mmol)、1-(2-硝基-苯磺醯基)-3-甲基-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(100mg，0.30mmol)和PyBOP(156mg，0.45mmol)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(0.08mL)。在40℃再攪拌2小時後，減壓濃縮反應混合物。殘餘物溶於二氯甲烷並用水洗滌。有機層用無水硫酸鈉乾燥並過濾。將濾液減壓濃縮並通過柱層析純化殘餘物以得到標題化合物(100mg，72％)。1H NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.31(s，1H)，8.33(d，1H)，8.10(d，1H)，8.04-7.93(m，2H)，7.35(s，1H)，4.85-4.60(m，2.5H)，4.55-4.40(m，0.5H)，4.20-4.10(m，0.5H)，4.05-3.90(m，1.5H)，3.78-3.60(m，1H)，3.30(m，1H)，1.74(s，3H)，1.42(d，1H)，1.27(d，2H)。
實施例85-1-(2-硝基-苯磺醯)-3-苯基-4-[(胸腺嘧啶-1-基)乙醯基]-哌嗪-2-酮室溫下，在溶於DMF(0.3mL)的(胸腺嘧啶-1-基)-乙酸(13mg，0.071mmol)，1-(2-硝基-苯磺醯基)-3-苯基-哌嗪-2-酮鹽酸鹽(28mg，0.070mmol)和PyBOP(40mg，0.077mmol)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(0.018mL)。再攪拌27小時後，減壓濃縮反應混合物。殘餘物通過柱層析純化以得到標題化合物(16mg，43％)。1H NMR(500MHz；DMSO-d6)δ11.33(s，1H)，8.36(d，1H)，8.13(d，1H)，8.05-7.94(m，3H)，7.39-7.29(m，5H)，5.93(s，1H)，4.87(d，1H)，4.67(d，1H)，4.22-4.16(m，2H)，3.96(m，1H)，3.78(m，1H)，1.74(s，3H)。
文中提到的所有參考文獻在此全文併入以供參考。
* * * * *那些精通此領域的技術人員將得知，或僅用常規便能夠確定，這裡所述本發明特定實施方案的許多等價變化。這些變化包含在權利要求的範圍之內。
權利要求
1.一種具有式I的化合物 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈；和B是天然或非天然的核酸鹼基，其中，當所述核酸鹼基具有環外氨基官能團時，所述官能團受保護基保護，所述保護基在酸性條件下不穩定但在弱鹼性至中等鹼性條件下穩定。
2.如權利要求1所述的化合物，其中，R6是H或天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈。
3.如權利要求1所述的化合物，其中，B是胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)。
4.如權利要求1所述的化合物，其中，B的保護基是苄氧羰基或二苯甲基氧羰基。
5.如權利要求1所述的化合物，其中，R1是硝基，R3是滷素，三氟甲基或甲基；R2、R4、R5是H。
6.如權利要求1所述的化合物，其中，R1是硝基，R3是Cl，R5是Cl或甲基，R2和R4是H。
7.如權利要求1所述的化合物，其中，R3是硝基，R1、R2、R4和R5是H。
8.如權利要求1所述的化合物，其中，R3是硝基，R1是Cl，R2、R4和R5是H。
9.一種製備權利要求1的化合物的方法，所述方法包括在通常用於肽合成的偶聯劑或混合酐存在下環化式VI的化合物，其中，式VI表示如下 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈；和B是天然或非天然的核酸鹼基，其中，當所述核酸鹼基具有環外氨基官能團時，所述官能團受保護基保護，所述保護基在酸性條件下不穩定但在弱鹼性至中等鹼性條件下穩定。
10.一種製備權利要求1所述化合物的方法，所述方法包括在非親核的有機鹼和通常用於肽合成的偶聯劑存在下使式IV的化合物與核酸鹼基乙酸部分發生偶聯反應，其中，所述式IV表示如下 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈，其中，所述核酸鹼基乙酸部分表示如下 其中，B是天然或非天然的核酸鹼基，其中，當所述核酸鹼基具有環外氨基官能團時，所述官能團受保護基保護，所述保護基在酸性條件下不穩定但在弱鹼性至中等鹼性條件下穩定。
11.一種具有式V的化合物 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈；R7是H，(C1-C4)烷基或芳基；和B是天然或非天然的核酸鹼基，其中，當所述核酸鹼基具有環外氨基官能團時，所述官能團受保護基保護，所述保護基在酸性條件下不穩定但在弱鹼性至中等鹼性條件下穩定。
12.如權利要求11所述的化合物，其中，R7是甲基，乙基或叔丁基。
13.一種製備權利要求11所述化合物的方法，所述方法包括在非親核的有機鹼和通常用於肽合成的偶聯劑存在下使式II的化合物與核酸鹼基乙酸部分發生偶聯反應，其中，式II表示如下 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈；R7是H，(C1-C4)烷基或芳基，其中，所述核酸鹼基乙酸部分表示如下 其中，B是天然或非天然的核酸鹼基，其中，當所述核酸鹼基具有環外氨基官能團時，所述官能團受保護基保護，所述保護基在酸性條件下不穩定但在弱鹼性至中等鹼性條件下穩定。
14.一種具有式II的化合物 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈；和R7是H，(C1-C4)烷基或芳基。
15.一種製備權利要求14所述化合物的方法，所述方法包括在非親核的有機鹼存在下使N-(2-氨基乙基)-甘氨酸衍生物與磺醯氯衍生物發生偶聯反應，其中，所述N-(2-氨基乙基)-甘氨酸衍生物表示如下 其中，R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈；和R7是H，(C1-C4)烷基或芳基，其中，所述磺醯氯衍生物表示如下 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基。
16.一種製備權利要求14所述化合物的方法，所述方法包括在非親核的有機鹼存在下使2-氨基乙基磺醯胺衍生物與滷代乙酸酯衍生物發生親核取代反應，其中，2-氨基乙基磺醯胺衍生物表示如下 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基，和其中，所述滷代乙酸酯衍生物表示如下 其中，R7是H，(C1-C4)烷基或芳基；和X是Cl、Br或I。
17.一種具有式IV的化合物及其游離酸形式 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈；和HY是有機或無機酸。
18.如權利要求17所述的化合物，其中，HY是HCl或TFA。
19.一種製備權利要求17所述化合物的方法，所述方法包括在通常用於肽合成的偶聯劑或混合酐存在下使式III的化合物環化，然後在酸中使t-Boc去保護，其中，所述式III表示如下 其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H，滷素，C1-C4烷基，硝基，腈，C1-C4烷氧基，滷化的C1-C4烷基或滷化的C1-C4烷氧基，其中，至少R1、R3和R5之一是硝基；和R6是H或天然或非天然α-胺基酸的被保護或未被保護的側鏈。
20.一種製造PNA寡聚物的方法，所述方法包括將權利要求1所述的化合物連接在一起。
全文摘要
本申請涉及用來製備PNA(肽核酸)寡聚物的通式(I)的單體，並提供了合成預定序列PNA寡聚物和隨機序列PNA寡聚物的方法其中，R1、R2、R3、R4、R5獨立為H、滷素、C
文檔編號C07H19/00GK1642923SQ03806494
公開日2005年7月20日 申請日期2003年1月23日 優先權日2002年1月24日
發明者金成基, 李賢一, 林鐘燦, 崔勳, 田在勳, 安相烈, 李星熙 申請人:帕那金股份有限公司