檢測環境化學物的雄性生殖毒性的製劑及模型建立方法
2023-10-07 05:48:44
專利名稱：：檢測環境化學物的雄性生殖毒性的製劑及模型建立方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，特別涉及一種用於檢測環境化學物的雄性生殖毒性的製劑和模型建立方法。
背景技術：
：隨著經濟社會，特別是現代工業的快速發展，人類接觸外源化學物如醫藥、農藥、食品添加劑以及環境中存在的各種汙染物日益增多，其中許多物質反覆接觸後可損傷生殖細胞，引起生殖毒性。在雄性，具體表現為睪丸各級生精細胞受損，繼而導致精液質量下降、精子DNA損傷等，由於精子DNA損傷不僅是引起不育的重要原因，也是輔助生育治療成功率下降的重要因素，而且，攜有DNA損傷的倖存精子可能逃避體內精子選擇機制而將遺傳缺陷傳遞給子代，從而顯著增加先天性缺陷甚至兒童期腫瘤的發生風險，因此研發一種檢測方法和手段，能夠快速、準確評估化學物的雄性生殖毒性、特別是對精子DNA的潛在危害，已經成為環境學、醫學、藥理和毒理學領域迫切需要解決的問題，同時也可為優生優育的提供保證。根據目前國際上檢測外源化學物的雄性生殖毒性的方法，我國2006年11月頒布的《藥物生殖毒性研究技術指導原則》中指出雄性生殖毒性的檢測主要包括以下策略(1)雄性動物(大、小鼠或家兔)交配前染毒或給藥4-10周，交配成功後處死，觀察睪丸組織病理結構，主要觀察終點為生殖器官的退變或壞死、精子計數、精子活力或形態學檢測、交配行為、內分泌功能或總體生育力改變；(2)染毒交配後，觀察胎仔數目和質量，評價父代染毒對子代發育的影響。然而，以上策略耗時很長(一月到數月)且觀察終點比較粗略，不能反映精子遺傳物質的隱性損傷。如果能夠有一種替代方法，可以實現既靈敏又快速的反映化學物造成的雄性生殖危害，將有助於我們更準確的評價化學物的安全性，也有利於縮短藥品的臨床前生殖毒性實驗周期。
發明內容發明目的本發明針對上述技術空白，提供一種用於檢測環境化學物的雄性生殖毒性的製劑和模型建立的方法，該製劑含有特異性的抑制小鼠oggl基因表達的雙鏈siRNA，將其應用於小鼠睪丸微環境敲減基因表達後，能建立快速靈敏檢測環境化合物對雄性生殖毒性的模型。技術方案有助於檢測環境化合物雄性生殖毒性的製劑，該試劑含有以下三段雙鏈siRNA雙鏈1由SEQIDNo1和SEQIDNo2組成；雙鏈2由SEQIDNo3和SEQIDNo4組成；雙鏈3由SEQIDNo5和SEQIDNo6組成。檢測環境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，步驟為選擇剛斷乳的新生雄性ICR小鼠，2%wt戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉後，局部酒精消毒，備皮，恥骨聯合上區手術，暴露小鼠睪丸；顯微注射Wt臺盼藍與上述檢測試劑等體積混合稀釋，檢測試劑的劑量範圍30nmol300nmol，顯微注射至精曲小管充盈，一側睪丸注射混合稀釋後的檢測試劑，另一側睪丸注射對照，術後縫合獲得檢測環境化合物雄性生殖毒性的模型。檢測試劑使用的劑量優選30nmol。原理各種有害環境化學物作用於精子，會產生損傷效應，包括精子DNA的損傷。而機體的損傷修復機制可以對抗損傷、保護遺傳信息穩定性。發明人研究發現，DNA損傷修復基因oggl可保護生殖細胞免受外源化學物所致損傷。利用本發明所保護的雙鏈siRNA製劑特異性敲減oggl基因在小鼠精母細胞的表達，更能靈敏的反映外源化學物的損傷效應(圖1)。進而在小鼠睪丸微環境敲減oggl，可增加雄性生殖系統對受試化學物所致損傷的易感性。由此，建立小鼠睪丸微環境基因敲減模型結合染毒方法評價外源化合物的生殖毒性效應，較之離體實驗更為真實客觀，較之轉基因試驗和普通染毒試驗更為快捷有效，該技術對於一大類具有雄性生殖毒性的環境化學物的檢測和安全評估有一定推廣意義。有益效果本發明提供的用於檢測環境化學物對雄性生殖毒性的試劑和模型建立的方法，可以實現既靈敏又快速的反映化學物造成的雄性生殖危害，將有助於我們更準確的評價化學物的安全性，也有利於縮短藥品的臨床前生殖毒性實驗周期。四圖1，實施例1中，小鼠精母細胞oggl-RNA幹擾後原位雜交驗證敲減效率及外源化學物氰戊菊酯農藥(Fen)25uM染毒後彗星實驗檢測細胞DNA損傷結果。A，C為正常對照，B，D為siRNA雙鏈幹擾組。箭頭顯示oggl典型的核定位表達被敲減。表明，oggl在小鼠精母細胞中有修復DNA損傷、維持遺傳穩定的作用；圖2，實施例1中，小鼠睪丸微環境敲減oggl模型建立成功。術後2周睪丸冰凍切片原位雜交結果顯示oggl敲減成功，且不影響自身的生精過程，適合作為染毒的模型；其中=Oggl敲減A、C，對照序列:B、D，顯微注射:A、B，原位雜交C、D。圖3，實施例2中，不同濃度白消安處理小鼠4周後，睪丸OgglsiRNA敲減組及對照組的精液參數、精子DNA損傷變化情況的柱狀示意圖。*與O周(染毒前)比較，P<0.05;#與O周(染毒前)比較，P<0.01。圖4，實施例2中，睪丸病理HE染色。相同染毒劑量(白消安5mg/kg)染毒4周，oggl敲減組(圖3A，左側睪丸)和對照組(圖3B，右側睪丸)相比，敲減組可以更靈敏的反映外源化合物的睪丸的損傷效應；圖5，實施例2中，睪丸病理透射電鏡。相同染毒劑量(白消安5mg/kg)染毒4周，oggl敲減組(圖4A，左側睪丸)和對照組(圖4B，右側睪丸)相比，敲減組可以更靈敏的反映處源化合物的睪丸的損傷效應；圖6，實施例3中，小鼠白消安染毒(5mg/kg)0、2、4周時間，oggl敲減組及對照組精液參數、精子DNA損傷變化情況的柱狀示意圖。*與O周(染毒前)比較，？<0.05;#與O周(染毒前)比較，P<0.01。圖7，實施例4中，小鼠睪丸微環境oggl基因敲減模型經受試農藥染毒2周後精子DNA損傷情況的柱狀示意圖。*與溶劑對照組比較，P<0.05；#與溶劑對照比較，P<0.01。圖8，實施例4中，小鼠睪丸oggl敲減模型，白消安lmg/kg(A)，受試農藥5mg/kg(B)，受試農藥10mg/kg(C)，受試農藥20mg/kg(D)，染毒2周。結果顯示睪丸oggl敲減的動物模型可以快速、靈敏的反映外源化學物致小鼠睪丸損傷的生殖毒性。五具體實施例方式以下結合實例對本發明作進一步的描述實施例1(1)靶向oggl基因的特定雙鏈SiRNA的幹擾序列的設計、合成。①設計併合成靶向oggl基因的特定的SiRNA幹擾序列。siRNA-oggl序列設計的雙鏈序列如下所示，對照組為無關序列siRNA雙鏈。上述siRNA幹擾片段均設計成雙鏈組合併經化學修飾(主要是末端經過TT修飾)，可穩定至少3周不被降解。②靶向oggl的siRNA雙鏈序列(很可能是下列中的全部或者部分)候選雙鏈1(RNA)-UUGGGAAGCCAUGAUAA⑶GACAUC(RNA)-GAU⑶CACUUAUCAUGGCUUCCCAA候選雙鏈2(RNA)-AGCUGAAUGAGUCGAGGUCCAAAGG(RNA)-CCUUUGGACCUCGACUCAUUCAGCU候選雙鏈3:(RNA)-AAACCAAGUCCAGACGCAGCUCAGA(RNA)-UCUGAGCUGCGUCUGGACUUGGUUU③體外細胞試驗證實靶向oggl的siRNA雙鏈的敲減效率及生物學功能，顯示特異性敲減DNA修復基因oggl在小鼠精母細胞的表達，精母細胞更易受損傷、更能靈敏的反映外源化學物的損傷效應(圖1)。(2)建立小鼠睪丸微環境oggl基因敲減模型。①動物選擇處理選擇剛斷乳的新生雄性ICR小鼠(此發育階段便於觀察精子生成第一個高峰)6隻/組，2%wt戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉後，局部酒精消毒，備皮，恥骨聯合上區雙側腹股溝處手術，切口0.5cm，暴露小鼠左、右雙側睪丸。②顯微注射wt臺盼藍與幹擾siRNA雙鏈(劑量範圍30nmOl300nmol，優選是30nmol)等體積混合稀釋後，顯微注射至精曲小管充盈(圖2)，左側睪丸注射oggl幹擾組，右側睪丸注射對照，每組注射2uL。縫合手術區皮膚並注意小鼠保溫(麻醉後基礎代謝率降低，可能會導致新生鼠死亡)。③證實oggl睪丸敲減的動物模型成功建立小鼠睪丸冰凍切片原位雜交、螢光定量PCR均驗證oggl基因敲減2周後仍有效(圖2)，oggl表達被下調，同時睪丸組織觀察精子數目及睪丸形態、TUNEL試劑盒檢測精子DNA完整性。上述結果顯示，靶向oggl的siRNA敲減有效，睪丸微環境oggl低表達的動物模型建立，且該操作本身不會引起精子DNA的異常。(3)取上述已建立的動物模型，運用待測試化學物(如藥物、化學品、農藥等環境毒物)經口染毒2周，評價該化學物生殖毒性，如睪丸形態、精子數目、特別是精子DNA損傷(TUNEL試劑盒檢測)等，以驗證該動物模型用於生殖毒性評價的靈敏度和快速性。具體內容見下述具體實施案例。實施例2取本發明所涉及的動物模型，不同濃度的陽性藥物(白消安lmg/kg，5mg/kg)經口染毒4周。精子計數及精子DNA損傷(TUNEL值)結果顯示(表1，圖3)在較低濃度劑量濃度染毒時(lmg/kg)，與普通染毒(即右側對照睪丸)比較，左側oggl敲減睪丸更易檢出DNA損傷效應。睪丸病理HE染色(圖4)及透射電鏡(圖5)的結果也同樣顯示相同染毒劑量下(白消安lmg/kg)，oggl敲減組(左睪丸)和對照組(右睪丸)相比，敲減組可以更靈敏的反映外源化合物的睪丸損傷效應。表1不同濃度白消安處理小鼠4周後，ogglSiRNA幹擾組及正常對照組的精液參數及精子DNA損傷變化表tableseeoriginaldocumentpage6*與溶劑對照組比較，P<0.05；#與溶劑對照組比較，P<0.01實施例3取本發明所涉及的動物模型(左側睪丸oggl敲減，右側睪丸對照序列)，同濃度的白消安(5mg/kg)經口染毒，分別於0、2、4周時觀察生殖毒性效應(主要為精子數目、DNA損傷)。結果顯示較之傳統方法，oggl敲減組在更短時間內，即可檢測出DNA損傷效應，(表2，圖6)。表2小鼠白消安染毒(5mg/kg)不同時間段，幹擾組及對照組的精子數及DNA損傷的變化表tableseeoriginaldocumentpage6*與O周(染毒前)比較，P<0.05與O周(染毒前)比較，P<0.01實施例4取本發明所涉及的動物模型，分組溶劑對照組(陰性組)/陽性組(白消安)/受試物(某種擬除蟲菊酯類農藥，其主要成分是氰戊菊酯和眯菊酯)經口染毒。具體方案選擇上述oggl敲減小鼠25隻，每組5隻，受試農藥設3個劑量組(分別是5mg/kg，10mg/kg,20mg/kg)。siRNA片段顯微注射(左側睪丸幹擾組，右側睪丸對照組)。次日開始各組別染毒，灌胃每天一次，持續2周。處死小鼠，取睪丸組織，綜合評價各項效應指標，主要關注精子DNA損傷效應及睪丸病理變化(表3，圖7、圖8)。結果提示oggl敲減的動物模型可以快速、靈敏的檢測出外源化學物致小鼠精子DNA損傷的生殖毒性。表3小鼠睪丸微環境oggl基因敲減模型小鼠受試物染毒2周後精子DNA損傷情況表。tableseeoriginaldocumentpage7*與溶劑對照組比較，P<0.05；#與溶劑對照比較，P<0.0權利要求檢測環境化學物的雄性生殖毒性的製劑，其特徵在於該試劑含有以下三段雙鏈siRNA雙鏈1由SEQIDNo1和SEQIDNo2組成；雙鏈2由SEQIDNo3和SEQIDNo4組成；雙鏈3由SEQIDNo5和SEQIDNo6組成。2.檢測環境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，其特徵在於步驟為a.選擇剛斷乳的新生雄性ICR小鼠，2%wt戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉後，局部酒精消毒，備皮，恥骨聯合上區手術，暴露小鼠睪丸；b.顯微注射wt臺盼藍與上述檢測試劑等體積混合稀釋，檢測試劑的劑量範圍30nmol300nmol，顯微注射至精曲小管充盈，一側睪丸注射混合稀釋後的檢測試劑，另一側睪丸注射對照，術後縫合獲得檢測環境化合物雄性生殖毒性的模型。3.根據權利要求2所述的檢測環境化合物雄性生殖毒性的模型建立方法，其特徵在於檢測試劑使用的劑量為30nmol。全文摘要本發明涉及一種雙鏈siRNA及其應用，特別是涉及一種DNA損傷修復ogg1基因的雙鏈siRNA，將其應用於小鼠睪丸微環境敲減基因表達，可提高雄性生殖系統對環境化學物的損傷作用的敏感性，從而提供一種快速、靈敏的檢測環境化學物的雄性生殖毒性的方法。本發明作為環境化學物生殖毒性的檢測的新方法，可以實現既靈敏又快速的反映化學物造成的雄性生殖危害，將有助於我們更準確的評價化學物的安全性，也有利於縮短藥品的臨床前生殖毒性實驗周期。文檔編號A01K67/027GK101805751SQ201010129228公開日2010年8月18日申請日期2010年3月19日優先權日2010年3月19日發明者吉貴祥,王心如,趙鵬,顧愛華,龍燕申請人:南京醫科大學