一種獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的高效方法與流程
2023-10-06 19:57:04 2
技術領域
本發明涉及遺傳轉化方法技術領域，具體涉及一種獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的高效方法。
背景技術：
胡麻（Linum usitatissimum L.）是油用和油纖兼用亞麻的俗稱，屬亞麻科亞麻屬一年生草本植物，是我國西北和華北地區的重要油料作物。胡麻籽粒中富含多種不飽和脂肪酸，其中α- 亞麻酸含量達45～60%，是α-亞麻酸含量最高的油料作物。現有技術中，農桿菌介導的胡麻轉基因研究多以下胚軸為受體，獲得的轉基因材料為雜合體，穩定慢，容易形成嵌合體。以胡麻花葯為轉基因受體，得到的轉基因單倍體材料經染色體人工加倍，直接得到基因型純合的個體，減少了嵌合體的產生機率，縮短育種周期。
技術實現要素：
本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的高效方法。
為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的高效方法，包括以下步驟：
1）轉化受體的建立：
採集單核靠邊期的胡麻花葯，通過花葯培養誘導胚性愈傷組織，作為農桿菌侵染的受體，花葯培養誘導胚性愈傷組織的方法為：取胡麻花蕾，置於4～6℃低溫預處理3～7天，首先進行消毒，然後剝開花蕾，剝離花葯接種於含YI固液培養基的三角瓶中，30℃黑暗條件下培養1天後，移至25℃光照條件下，培養20～25天，誘導胚性愈傷組織作為農桿菌侵染的受體；
2）農桿菌工程菌液的製備及侵染：
將含有外源基因的農桿菌C58c1單菌落接種於YEP液體培養基中，28℃、260 rpm 振蕩培養18小時；然後以1:100 的比例用YEP液體培養基進行擴大培養；待菌液的濃度達到OD600＝0.5～0.6 後，4℃、5000 rpm 離心5分鐘收集菌體，將菌體重懸於1/2 MS液體培養基至OD600＝0.5～0.6，將步驟1）得到的花葯愈傷組織浸泡於上述製備的菌液中浸染15～30min；
3）受體與農桿菌共培養：
將步驟2）中經過農桿菌侵染後的受體用無菌濾紙吸乾表面多餘的菌液，然後平鋪於共培養基上，25℃黑暗培養3～5天，以在培養基上看見農桿菌單個菌斑為止結束共培養；
4）轉基因愈傷組織的誘導培養：
將步驟3）中共培養結束後的轉化愈傷組織轉接到選擇誘導培養基， 25℃、光照強度100μEm-2s-1 16h與20℃、黑暗8h交替培養，每隔15d繼代一次或轉接至分化培養基。
進一步的，上述的一種獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的高效方法，所述步驟1）中，所述YI固液培養基的組成由 MS + 6-BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5 %瓊脂的固體培養基（PH=5.8）30毫升與不含瓊脂、其他成份相同的液體培養基（PH=5.8）5ml組成固液培養基。。
進一步的，上述的一種獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的高效方法，所述步驟2）中，農桿菌C58c1菌株含有pCAMBIA3301表達載體，有35S:GUS基因和bar植物選擇標記基因。
進一步的，上述的一種獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的高效方法，所述步驟3）中，所述共培養基的組成為MS + 6-BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5%瓊脂，PH=5.8。
進一步的，上述的一種獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的高效方法，所述步驟4）中，所述選擇誘導培養基的組成為MS + 6-BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5 % 瓊脂+ 草銨膦（PPT）10 mg/L + 羧苄青黴素 250～500 mg/L，PH=5.8；分化培養基組成為MS + 6-BA 0.1～1.0 mg/L + 2 %蔗糖 + 0.5 % 瓊脂+ 草銨膦（PPT）10 mg/L + 羧苄青黴素 250～500 mg/L，PH=5.8。
本發明的第二個目的是提供了採用上述的方法獲得的胡麻轉基因單倍體愈傷組織在功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、胡麻基因工程、細胞工程、代謝工程以及遺傳轉化體系相關研究中的應用。
本發明公開了一種以小孢子來源的胚性愈傷組織為受體的農桿菌介導的遺傳轉化方法，通過本方法可以高效獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織。該方法具有以下特點：一、轉化率很高。由於小孢子來源的胚性細胞接受外源DNA能力很強，是理想的基因轉化的感受態細胞，而且這些細胞繁殖量大，同步性好，因此具有很高的轉化率；二、小孢子來源的胚性細胞為受體獲得的轉化細胞為單細胞起源，遺傳背景一致，轉化獲得的轉基因植株嵌合體少，加倍後直接可作為純系使用。
本發明的有益效果為：本發明建立了一種高效獲得胡麻轉基因單倍體愈傷組織的方法，發明實例中選用隴亞雜3號品種為例，對受體的製備、農桿菌侵染濃度、侵染時間和共培養時間、以及草銨膦選擇壓力都進行了系統研究，從而建立了一個簡單、高效地獲得胡麻轉基因愈傷組織的轉化體系。該體系適用於我國主栽胡麻優良品種，對雜交品種的效果更好。該體系與以往以下胚軸為受體的轉化體系相比具有轉化率高、轉化受體背景一致，在功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、胡麻基因工程、細胞工程、代謝工程以及遺傳轉化體系的建立等相關領域有廣泛的應用價值。
附圖說明
圖1為單核靠邊期的胡麻花葯。
圖2為胡麻花葯培養獲得的胚性愈傷組織。
圖3為胡麻花葯愈傷組織與根癌農桿菌共培養。
圖4為轉化愈傷組織的草銨膦抗性篩選。
圖5為轉化愈傷組織的GUS染色結果（左：對照；右：轉化愈傷組織）。
具體實施方式
實施例1：
實施例中，使用的MS基本培養基（Murashige and Skoog,1962）的構成和標準配方為（單位：mg/L）：NH4NO3 1650, KNO31900, CaCl2·2H2O 440, MgSO4·7H2O 370, KH2PO4 170, KI 0.83, H3BO3 6.2, MnSO4·4H2O 22.3, ZnSO4·7H2O 8.6, Na2MoO4·2H2O 0.25, CuSO4·5H2O 0.025, CoCl2·6H2O 0.025, FeSO4·7H2O 27.8, Na2-EDTA·2H2O 37.3, 肌醇100, 煙酸0.5, 鹽酸吡哆醇（維生素B6）0.5, 鹽酸硫胺素（維生素B1）0.1, 甘氨酸 2.0。
YEP 固體培養基配方：10 g/L Yeast extract，10 g/L Tryptone，5 g/L NaCl，瓊脂7g/L，PH=7.0 。
YEP 液體培養基配方：10 g/L Yeast extract，10 g/L Tryptone，5 g/L NaCl，PH=7.0。
本實驗所用農桿菌C58c1攜帶的質粒pCAMBIA3301為澳大利亞pCAMBIA公司饋贈，其中含有CaMV35S啟動子驅動的GUS基因。
一、轉化受體的建立：
如圖1、2所示，採集隴亞雜3號（胡麻品種名）小孢子處於單核靠邊期的花蕾，用無菌溼紗布包好，裝入自封袋內放置於4～6℃預處理3～7 d。預處理結束後，用流水衝洗花蕾10～15分鐘，75%乙醇清洗1分鐘，2%次氯酸鈉消毒10分鐘，無菌水衝洗3～5次。剝開花蕾，取花葯接種於含YI培養基的三角瓶中，30℃、暗培養1天後，移至25℃/20℃、16 h / 8 h培養20～30天，誘導胚性愈傷組織，作為農桿菌侵染的受體。
上述YI培養基組成為MS + 6-BA 1.0～2.0 mg/L + 2,4-D 2.0～3.0 mg/L + 硫胺素1.0～10.0 mg/L + 6%蔗糖 + 200 mg/L水解酪蛋白 + 0.5 %瓊脂的固體培養基30毫升，不含瓊脂、其他成份相同的液體培養基5ml， PH=5.8
二、農桿菌菌液製備：
將-70℃保存的帶有pCAMBIA3301質粒的C58c1菌液在冰上融化，用接種環蘸取少量菌液，接種到含有適量抗生素（卡那黴素50 mg/L，利福平50 mg/L ，鏈黴素50 mg/L）的YEP 培養基上，將其置於28℃恆溫培養箱中培養。
待其長出單菌落後，用滅過菌的槍頭挑取單菌落接種到含有10 mL 加有適量抗生素的YEP 液體培養基的三角瓶中，28℃、260 rpm 振蕩培養18 h左右。
吸取上述農桿菌菌液2mL，接種到含有50 mL加有適量抗生素（卡那黴素50mg/L，利福平50 mg/L ，鏈黴素50 mg/L）的YEP 培養基的三角瓶中，28℃、260 rpm 振蕩培養。
待上述農桿菌培養到OD600 為0.5～0.6 時，取菌液於50 mL 離心管中，於5000 rpm，4℃離心5min，去除上清，收集菌體。
用含100μM乙醯丁香酮的 1/2 MS 液體繼代培養基重懸上一步中收集的菌體兩次後，將菌液濃度稀釋至OD600 為0.5 左右。
三、侵染：
將上述稀釋好的菌液搖勻，取培養的小孢子來源的胚性愈傷組織至於50 ml無菌燒杯中，吸取20 mL 稀釋的菌液加入含有愈傷組織的燒杯中，靜置15～30 min。吸出菌液，將侵染過的愈傷組織置於無菌濾紙吸乾菌液，接種於共培養基，25℃暗培養3～5 d，以在培養基上看見農桿菌單個菌斑為止結束共培養，如圖3所示。
上述步驟中共培養基配方為：MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L +2，4-D 2.0～3.0 mg/L +VB1 1.0 mg/L～10.0 mg/L +蔗糖 60 g/L+水解酪蛋白200mg/l+瓊脂5 g/L+ 100 μM乙醯丁香酮。
四、轉基因愈傷組織的誘導：
將上述步驟中共培養結束後的愈傷組織轉接至轉化愈傷組織選擇誘導培養基，25℃/20℃、16 h/8 h條件下培養，每隔15d繼代一次。
上述步驟中轉化愈傷組織選擇誘導培養基配方為：MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L +2,4-D 2.0～3.0 mg/L +VB1 1.0 mg/L～10.0 mg/L +蔗糖 60 g/L+水解酪蛋白200 mg/L+瓊脂5 g/L+草銨膦（PPT） 10 mg/L +羧苄青黴素 250～500 mg/L。
轉化愈傷組織的草銨膦抗性篩選結果如圖4所示。
五、GUS 細胞學檢測：
取上述抗性愈傷組織作為GUS染色材料，浸泡在染液中，於37℃保溫2 h至過夜。
上述步驟中GUS 染液配方：
（1）50mmol/L 磷酸鈉緩衝溶液（pH7.0）：A 液：稱取NaH2PO4·2H2O 3.12g 溶於無菌水，定容至100ml；B 液：稱取NaH2PO4·12H2O 7.17g 溶於無菌水，定容至100ml；取39ml A液與61ml B 液混合；
（2）染色液：7.1ml 50mmol/L 磷酸鈉緩衝溶液，0.2ml 10mmol/L Na2EDTA，0.2ml 5mmol/L K4[Fe（CN）6]，0.2ml K3[Fe（CN）6]，0.05ml 0.05%（v/v）Triton-100，2ml 20% 甲醇，0.25ml 0.5mg/ml X-Gluc。
取上述步驟中經過染色的抗性愈傷組織，肉眼或顯微鏡下觀察，材料中的藍色即為GUS 表達位點如圖5所示，可見，外源基因已被高效轉化。
最後應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。