一種產胞外多糖的菠蘿泛菌及其多糖的提取和應用的製作方法

2023-10-26 16:16:42

專利名稱：一種產胞外多糖的菠蘿泛菌及其多糖的提取和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於產胞外多糖的微生物技術領域，涉及一種產胞外多糖的菠蘿泛菌及其多糖的提取和應用。
背景技術：
多糖的抗氧化作用已經成為最為活躍的研究課題之一。通常植物和藻類來源的多糖較為普遍，但近些年來，微生物來源的多糖(胞外多糖)引起廣泛關注，尤其是細菌和真菌來源的胞外多糖，因其易於分離純化而且產量高等優點在工業生產中頗受青睞。胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)是細菌細胞外含糖結構的總稱,包括革蘭氏陰性細菌胞膜外的多糖成分和革蘭氏陽性菌得肽聚糖，是細菌在特定環境調節下產生的高分子物質。作為細菌的次生代謝產物，胞外多糖對細菌的作用主要有:使細菌群集抵抗吞噬；保護細菌不和抗體結合；形成群集內細菌交替性生長；幫助細菌群體向周圍獲得足夠營養。作為與人類生活緊密相關的一類生物高分子，近年的研究發現細菌胞外多糖還具有抗氧化、抗輻射、免疫調節、降血糖、降血脂，以及抗腫瘤、抗肝炎病毒等特殊的生物學活性。近年來，微生物多糖抗氧化活性的研究報導很多，其在體外可以清除自由基，還具有抗脂質過氧化的能力；在體內則可以提高抗氧化酶的活性，也表現出抗脂質過氧化的能力。與其他外源性抗氧化劑相比，抗氧化多糖具有低毒、安全來源廣等特點。作為外源性抗氧化劑，多糖在生物體內發揮作用更為複雜，它可直接參與淬滅自由基的途徑外，還可能與通過調節機體內內源性抗氧化劑的活性相關。另外多糖可以作為一種天然的生物抗氧化劑進行復配，增強對人體健康的保護作用
發明內容
本發明解決的問題在於提供一種產胞外多糖的菠蘿泛菌及其多糖的提取和應用，該菠蘿泛菌是一種新的微生物，其分泌的胞外多糖具有抗氧化活性。本發明是通過以下技術方案來實現:—種產胞外多糖的菠蘿泛菌,其分類命名為Pantoea ananatis G-14,保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC M2010107。所述的產胞外多糖的菠蘿泛菌在生長過程中向胞外分泌多糖。所述的多糖具有抗氧化活性。基於Pantoea ananatis G-14發酵培養提取胞外多糖的方法,包括以下步驟:I)將P.ananatis G-14單菌落接種在LB液體培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養8 IOh ;然後轉接至發酵培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養48 65h ；所述的發酵培養基是在LB液體培養基中添加質量分數I 5%的單糖或雙糖作為附加碳源；2)培養完成後，離心，收集培養液上清；3)將培養液上清濃縮後，加入其體積2 5倍的體積分數80 95%的乙醇溶液，充分混勻，O 10°C下靜置12 24h後，收集靜置後的沉澱，得到粗多糖；4)分離去除粗多糖中的蛋白後，在截留分子量為8000 14000的透析袋中以滅菌純水緩衝液透析24h以上，每12小時更換I次緩衝液；將透析袋中的多糖溶液低溫冷凍乾燥獲得胞外多糖乾粉。所述的步驟I)是將P.ananatis G-14單菌落接種在LB液體培養基中，於25 30°C下，100 300rpm攪拌，通氣培養8 IOh ;然後以I 5%的接種量轉接至發酵培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養48 65h ；所述的發酵培養基是在LB液體培養基中添加質量分數I 5%的葡萄糖作為附加碳源。所述的步驟2)的離心為8000 12000rpm,3 lOmin, 4°C離心收集培養液上清。所述的步驟3)為:將培養液上清減壓濃縮至原體積的1/5 1/10，然後加入其體積2 5倍的體積分數80 95%、4°C預冷的乙醇溶液，充分混勻，O 4°C下放置12 24h後使胞外多糖充分沉澱；8000 12000rpm,3 lOmin,4°C離心收集沉澱,得到粗多糖。所述的步驟4)為:粗多糖採用Sevage法除蛋白後，離心取上清，在截留分子量為8000 14000的透析袋中在滅菌純水中透析48小時，每12小時更換I次緩衝液；將透析袋中的多糖溶液在使用冷凍乾燥機中冷凍乾燥，冷凝溫度<-50°C，真空度<20Pa，冷凍時間為18· 24h，獲得胞外多糖乾粉。Pantoea ananatis G-14發酵培養分泌的胞外多糖在製備抗氧化劑的應用。所述的抗氧化劑為:清除羥自由基的抗氧化劑、清除超氧陰離子自由基的抗氧化劑、脂質過氧化抑制齊U、清除DPPH自由基的抗氧化劑中的一種或幾種。Pantoea ananatis G-14發酵培養分泌的胞外多糖在製備促進腸道損失修復、促進腸道益生菌繁殖和/或抑制腸道病原菌繁殖的藥物的製備。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:本發明提供了一種新的能夠產生胞外多糖的微生物，該微生物屬於菠蘿泛菌P.ananatis，其分類命名為P.ananatis G-14，在LB+1%葡萄糖的固體培養基上的菌苔呈黃色、光滑、溼潤、飽滿，其16s rRNA序列NCBI登錄號為JN974457。本發明提供的P.ananatis G_14在生長過程中向胞外分泌多糖，在培養基上培養後，經過濃縮、沉澱、除蛋白、透析後得到P.ananatis G_14胞外多糖提純產物，產量為380mg/L，其中的糖蛋白濃度為0.7%。Pantoea ananatis G-14發酵培養分泌的胞外多糖具體抗氧化活性:a)清除羥自由基(.0H)羥基自由基(.0H)被公認是生物系統中最具活性的活性氧化物，能導致生物體內DNA，蛋白質和脂質氧化等的不可逆損傷。羥自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標。P.ananatis G-14胞外多糖對輕基自由基有一定的清除作用，當粗提多糖為5mg/ml時，其清除能力達到同濃度Vc的40%。b)清除超氧陰離子自由基(.02_)在生物氧化中形成的超氧陰離子自由基，性質活潑，可以通過細胞膜的陰離子通道，直接與多種大分子物質結合而使其失去活性。多糖分子上的還原性半縮醛羥基，與超氧陰離子自由基發生氧化還原反應。粗提多糖對超氧陰離子自由基具有一定的清除效果，在5mg/ml時，清除能力僅為15.8%。c)還原能力P.ananatis G-14胞外多糖具有一定的還原能力，且還原能力隨多糖濃度的增加而增加，還原能力與多糖濃度之間存在的顯著的量效關係。d)脂質過氧化抑制作用脂質過氧化是指不飽和脂肪酸、脂質的氧化，該過程可直接幹擾和破壞膜的生物功能，許多導致羥自由基增多的因素(酒精、植物毒素蛋白、氟中毒等)、紫外輻射都會誘導脂質過氧化，進而誘發一系列疾病。以卵黃脂蛋白為反應底物的模型LPO體系實驗結果顯示,P.ananatis G-14胞外多糖具有較高的脂質過氧化抑制作用，從0.15mg/ml到0.6mg/ml時，脂質過氧化抑制作用隨多糖的濃度增加而顯著增加，當多糖濃度高於1.25mg/ml時，抑制作用趨於平穩，在5mg/ml時，抑制作用可達35.8%。e)清除DPPH自由基*DPPH (1，1-二苯基-2-苦基肼自由基)是一種很穩定的以氮原子為中心的自由基，通過檢測多糖對*DPPH的清除能力，可以說明多糖抗氧化能力的大小。隨著多糖濃度的增加，其對.DPPH的清除能力也逐漸在增強，在2.5mg/ml時，清除率達28%，在5mg/ml時，清除率達46%。P.ananatis G-14胞外多糖具有類益生元效果:
未經P.ananatis G_14胞外多糖灌胃的痢疾志賀氏菌感染大鼠的腸壁出現水腫、充血等典型炎症的組織病理學特徵，黏膜上皮有不同程度破壞；經P.ananatis G_14胞外多糖灌胃的痢疾志賀氏菌感染大鼠的腸壁較之平滑，黏膜上皮的破壞獲得了一定程度的修復。表明P.ananatis G-14胞外多糖具有促進腸道損失修復的作用，同時其可能調節腸道微生物區系平衡，促進腸道益生菌，抑制病原菌和大腸桿菌的繁殖，可促進動物健康，表現出類似於益生元的作用。保藏說明本發明所述的P.ananatis G-14進行了下述保藏:保藏時間:2012年4月11日，保藏地點:中國.武漢.武漢大學，中國典型培養物保藏中心，CCTCC ;保藏號為 CCTCC M2012107 ;分類命名 Pantoea ananatis G-14。


圖1為CCTCC M2010107在顯微鏡下的鏡檢結果圖(100 X 100)；圖2為CCTCC M2010107在固體培養基上的產胞外多糖；圖3為16s rRNA序列比對構建的系統進化樹(NJ進化樹)；圖4為CCTCC M2010107分泌胞外多糖體外對羥自由基的清除作用；圖5為CCTCC M2010107分泌胞外多糖體外對超氧陰離子自由基的清除作用；圖6為CCTCC M2010107分泌胞外多糖體外的還原能力檢測結果圖；圖7為CCTCC M2010107分泌胞外多糖的脂質過氧化抑制作用；圖8為CCTCC M2010107分泌胞外多糖體外對DPPH自由基的清除作用；
圖9-1 9-2為CCTCC M2010107分泌胞外多糖處理的痢疾志賀氏菌慢性感染大鼠的腸道組織病理學變化；其中圖9-1為痢疾志賀氏菌慢性感染大鼠；圖9-2為G-14胞外多糖幹預的慢性感染大鼠。
具體實施例方式下面結合Pantoea ananatis G-14的分離、培養、多糖的提取和作用的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。UCCTCC M2010107 (Pantoea ananatis G-14)的分離有報導稱部分菠蘿泛菌P.ananatis具有抑菌性質(包括真菌和細菌);有些菌株具有冰核細菌特性，可作為生物添加劑用於食品冷凍過程中；部分菌株則被被認為是一種植物病原菌，可引起洋蔥、稻穀等腐爛病變。目前的研究並沒有關於菠蘿泛菌P.ananatis的胞外多糖抗氧化活性的研究報導。CCTCC M2010107 的分離為:分離來源:2011年4月從西安華潤萬家超市採集切片水果樣品，無菌狀態下勻漿，秤稱取0.5g樣品，加滅菌的0.1%蛋白腖溶液試管中充分混勻，室溫靜置5min，取上清Iml與25ml滅菌的溶化的牛肉膏-蛋白腖固體培養基混勻，傾倒平板，37°C培養48h。

從上述培養基中篩選得到了一株菠蘿泛菌P.ananatis，發現該菌在牛肉膏-蛋白腖固體培養基上生長迅速，菌落光滑、溼潤，接觸時有粘性，在LB液體試管培養基中培養時，48小時以後出現細胞凝集現象。分離所用培養基:牛肉膏-蛋白腖固體培養基(0.3%牛肉膏、1%蛋白腖、0.5%氯化鈉、1.5%瓊脂,高壓蒸汽滅菌，121°C,20min)該菌在P.ananatis培養基上生長時,在顯微鏡下的鏡檢結果如圖1所不,放大倍數 100X100。P.ananatis培養基:TSB培養基(1.5%胰蛋白腖，0.5%大豆蛋白腖，0.5%氯化鈉，固體培養基加1.5%瓊脂)該菌株在LB+1%葡萄糖的固體培養基上的菌苔呈黃色、光滑、溼潤、飽滿，具體如圖2所示。在發現該菌的向培養基中分泌胞外多糖後，篩選出了適合其的產胞外多糖發酵的培養基:LB培養基(1%蛋白腖、0.5%酵母粉、1%氯化鈉)+1-5%葡萄糖；其培養條件為:產胞外多糖發酵條件為30°C，恆溫震蕩搖床200rpm，通氣培養48_65h。2、CCTCC M2010107 分離株的鑑定提取CCTCC M2010107的總DNA，並以其為模板，擴增1.5kbl6S rRNA序列，16SrRNAPCR引物為:16S-F:5』AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3』，16S-R:5 『GGT ACC T TG TTA CGA CTT3』 。擴增程序為-MV , 4min, I個循環預變性；94°C變性，30sec，58 °C退火，30sec，72°C延伸，lmin，30 個循環；72°C 7min。PCR 擴增體系為 20μ I PCR 體系中分別加入 IOmM dNTP 1.6 μ 1，IOXTaq 酶 buffer2 μ I，InM PCR 引物各 I μ I，G-14 總 DNA 模板 2_3ng，Taq DNA 聚合酶 0.2 μ I，以 MiniQ 水補足 20 μ I。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證後，用PCR產物回收試劑盒回收，並送測序公司測序。測序結果與NCBI上公布的細菌16S rRNA序列比對，證實該分離株屬於菠蘿泛菌P.ananatis，其16s rRNA序列NCBI登錄號為JN974457。N-J系統進化樹見圖3，確定該菌株是一種新的菠蘿泛菌。3、CCTCC M2010107產胞外多糖發酵、多糖的提取基於Pantoea ananatis G-14發酵培養提取胞外多糖的方法,包括以下步驟:I)將P.ananatis G-14單菌落接種在LB液體培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養8 IOh ;然後轉接至發酵培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養48 65h ；所述的發酵培養基是在LB液體培養基中添加質量分數I 5%的單糖或雙糖作為附加碳源；具體的:是將P.ananatis G-14單菌落接種在LB液體培養基中，於25 30°C下，100 300rpm攪拌，通氣培養8 IOh;然後以I 5%的接種量轉接至發酵培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養48 65h ；所述的發酵培養基是在LB液體培養基中添加質量分數I 5%的葡萄糖作為附加碳源。2)培養完成後，離心，收集培養液上清；具體的:的離心為8000 12000rpm,3 lOmin, 4°C離心收集培養液上清。3)將培養液上清濃縮後，加入其體積2 5倍的體積分數80 95%的乙醇溶液，充分混勻，O 10°C下靜置12 24h後，收集靜置後的沉澱，得到粗多糖；
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具體的:將培養液上清減壓濃縮至原體積的1/5 1/10，然後加入其體積2 3倍的95%乙醇溶液(4°C預冷)，充分混勻，O 4°C下放置12 24h後使胞外多糖充分沉澱；8000 12000rpm,3 lOmin,4°C離心收集沉澱，得到粗多糖。4)分離去除粗多糖中的蛋白後，在截留分子量為8000 14000的透析袋中以滅菌純水為透析液透析24h以上,每12小時更換I次緩衝液；將透析袋中的多糖溶液低溫冷凍乾燥獲得胞外多糖乾粉。具體的:粗多糖採用Sevage法除蛋白後，離心取上清，在截留分子量為8000 14000的透析袋中以滅菌純水為透析液透析48小時，每12小時更換I次緩衝液；將透析袋中的多糖溶液進行低溫冷凍乾燥(使用冷凍乾燥機，冷凝溫度<-50°C，真空度<20Pa，18-24h)獲得胞外多糖乾粉。經過濃縮、沉澱、除蛋白、透析後得到P.ananatis G-14胞外多糖提純產物,產量為380mg/L，其中的糖蛋白濃度為0.7%。4、P.ananatis G_14胞外多糖的體外抗氧化活性測定:4.1清除羥自由基(.0H)在IOml試管中分別加入2ml不同濃度的胞外多糖溶液(稱取凍乾粉，配置為
0.15mg/ml>0.31mg/ml、0.62mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml),2ml6mM FeSO4, 2mlH2O2,混勻室溫靜置反應30min，測定OD51tl值。以相同濃度的Vc溶液代替胞外多糖溶液作為陽性對照組，以無菌ddH20代替胞外多糖溶液作為陰性對照組。外多糖清除羥自由基(％) = (A0-A1) /AtlX 100%，其中Atl為空白對照組的平均吸光值夂為樣品組的平均吸光值羥基自由基(.0H)被公認是生物系統中最具活性的活性氧化物，能導致生物體內DNA，蛋白質和脂質氧化等的不可逆損傷。羥自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標。P.ananatis G-14胞外多糖對輕基自由基有一定的清除作用，當粗提多糖為5mg/ml時，其清除能力達到同濃度Vc的40%，檢測結果如圖4所示，其中黑色代表G-14胞外多糖，灰色代表Vc.。4.2清除超氧陰離子自由基(.02_)在25°C水浴中預熱30min的加有4.5ml0.05M Tris-HCl (pH8.2)的試管中分別加入Iml不同濃度的胞外多糖溶液(稱取凍乾粉，配置為0.15mg/ml、0.31mg/ml、0.62mg/ml、
1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml),以及0.4ml25mM鄰苯三酚溶液，以相同濃度的Vc溶液代替胞外多糖溶液作為陽性對照組，以無菌ddH20代替胞外多糖溶液作為陰性對照組。分別混勻後，置於25°C水浴中反應5min，加入lml8M HCl中止反應，測定OD299值。胞外多糖清除超氧陰離子(％) = (A0-A1) /AtlX 100%，其中Atl為空白對照組的平均吸光值夂為樣品組的平均吸光值在生物氧化中形成的超氧陰離子自由基，性質活潑，可以通過細胞膜的陰離子通道，直接與多種大分子物質結合而使其失去活性。多糖分子上的還原性半縮醛羥基，與超氧陰離子自由基發生氧化還原反應。粗提多糖對超氧陰離子自由基的作用結果如圖5所示，其中黑色代表G-14胞外多糖，灰色代表Vc.;其對超 氧陰離子自由基的清除效果較差，在5mg/ml時，清除能力僅為15.8%。4.3還原能力在IOml試管中分別加入Iml不同濃度的胞外多糖溶液(稱取凍乾粉，配置為
0.15mg/ml、0.31mg/ml、0.62mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml), 2.5ml 憐酸鹽溶液(pH6.6),2.5ml鐵氰化鉀，混勻後置於50°C水浴中反應20min，再加入2.5mll0%三氯乙酸溶液，混勻，3000rpm離心IOmin,取上清2.5ml於新試管中，加入2.5ml無菌ddH20,
0.5ml0.l%FeCl3,室溫放置3min，測定OD7tltl值。以相同濃度的Vc溶液代替胞外多糖溶液作為陽性對照組。檢測結果如圖6所示，實線代表G-14胞外多糖，虛線代表Vc.;P.ananatisG-14胞外多糖具有一定的還原能力，且還原能力隨多糖濃度的增加而增加，還原能力與多糖濃度之間存在的顯著的量效關係。4.4脂質過氧化抑制作用取0.2mll:40 稀釋的卵黃懸液(用 pH7.45,0.1MPBS 配置的)，0.2ml25mMFeS04，100 μ I不同濃度的胞外多糖溶液(稱取凍乾粉，配置為0.15mg/ml、0.31mg/ml、0.62mg/ml、l.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml),以無菌 ddH20 補足 2ml,混勻，置於 37°C水浴中震蕩15min，取出後，樣品管加入0.5ml20%TCA溶液，靜置lOmin，3500rpm離心lOmin，轉移上清，再加入Iml0.8%的硫代巴比妥酸溶液，密閉試管，100°C煮沸15min，自然冷卻。陰性對照管以2mlPBS代替多糖溶液。測定OD532值。胞外多糖對脂質過氧化的抑制作用率(％)= (1-A1Atl)XlO(Fc);其中Atl為空白對照組的平均吸光值夂為樣品組的平均吸光值。脂質過氧化是指不飽和脂肪酸、脂質的氧化，該過程可直接幹擾和破壞膜的生物功能，許多導致羥自由基增多的因素(酒精、植物毒素蛋白、氟中毒等)、紫外輻射都會誘導脂質過氧化，進而誘發一系列疾病。以卵黃脂蛋白為反應底物的模型LPO體系實驗結果如圖7所示，P.ananatis G-14胞外多糖具有較高的脂質過氧化抑制作用，從0.15mg/ml到0.6mg/ml時,脂質過氧化抑制作用隨多糖的濃度增加而顯著增加，當多糖濃度高於1.25mg/ml時，抑制作用趨於平穩，在5mg/ml時，抑制作用可達35.8%。4.5清除DPPH自由基在IOml試管中分別加入2ml40mg/ml DPPH，和2ml不同濃度的胞外多糖溶液(稱取凍乾粉，配置為 0.15mg/ml、0.31mg/ml、0.62mg/ml、l.25mg/ml、2.5mg/ml、5.0mg/ml),充分混勻，室溫下避光反應30min，測定OD517值。以相同濃度的Vc溶液代替胞外多糖溶液作為陽性對照組，以無菌ddH20代替胞外多糖溶液作為陰性對照組。胞外多糖清除DPPH自由基(％)= (A0-A1)A0X 100% ;其中Atl為空白對照組的平均吸光值夂為樣品組的平均吸光值* DPPH (1，1-二苯基-2-苦基肼自由基)是一種很穩定的以氮原子為中心的自由基，通過檢測多糖對*DPPH的清除能力，可以說明多糖抗氧化能力的大小。隨著多糖濃度的增加，其對.DPPH的清除能力也逐漸在增強，在2.5mg/ml時，清除率達28%，在5mg/ml時，清除率達46%，具體如圖8所示，其中黑色代表G-14胞外多糖，灰色代表Vc.。5, P.ananatis G_14胞外多糖處理對痢疾志賀氏菌感染大鼠的生理活性以感染性痢疾志賀氏菌灌餵SD大鼠，建立大鼠的痢疾桿菌慢性感染模型。將純化的P.ananatis G-14多糖按照10mg/kg體重進行感染模型大鼠灌胃，每天I次,進行4周。以生理鹽水灌胃處理做陰性對照。4天後解剖大鼠，取腸道組織，製備石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察比較處理和對照的腸道組織病變情況。未經P.ananatis G-14胞外多糖灌胃的痢疾志賀氏菌感染大鼠的腸壁出現水腫、充血等典型炎症的組織病理學特徵，黏膜上皮有不同程度破壞；經P.ananatis G_14胞外多糖灌胃的痢疾志賀氏菌感染大鼠的腸壁較之平滑，黏膜上皮的破壞獲得了一定程度的修復，結果如圖9-1、9-2所示(HEX40)，其中圖9_1為痢疾志賀氏菌慢性感染大鼠；圖9-2為G-14胞外多糖幹預的慢性感染大鼠。這表明P.ananatis G_14胞外多糖具有促進腸道損失修復的作用。同時其可能調節腸道微生物區系平衡，促進腸道益生菌，抑制病原菌和大腸桿菌的繁殖，可促進動物健康，表現出類似於益生元的作用。綜上檢測表明:P.ananatis G-14多糖具有明顯的抗氧化活性、抗輻射、增強免疫力、抗腫瘤活性，可用於保健食品、食品添加劑、化妝品、飼料添加劑、獸藥等。進一步,還可對P.ananatis G_14菌株進行分子生物學改造,在原有基礎上進一步提高產多糖能 力，經規模發酵並提取活性多糖，作為抗氧化劑、益生元等，用於保健食品原料、食品添加劑、飼料添加劑、防輻射化妝品、獸藥注射劑、免疫佐劑等。還可開發新型細菌胞外多糖功能產品，也可與其他活性物質(多糖類、多酚類等)協同作用，獲得複合活性添加物。
權利要求
1.一種產胞外多糖的菠蘿泛菌,其特徵在於,其分類命名為Pantoea ananatis G-14,保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCM2010107。
2.如權利要求I所述的產胞外多糖的菠蘿泛菌，其特徵在於，其在生長過程中向胞外分泌多糖。
3.基於Pantoeaananatis G-14發酵培養提取胞外多糖的方法,其特徵在於,包括以下步驟 1)將P.ananatis G-14單菌落接種在LB液體培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養8 IOh ;然後轉接至發酵培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養48 65h ； 所述的發酵培養基是在LB液體培養基中添加質量分數I 5%的單糖或雙糖作為附加碳源； 2)培養完成後,離心,收集培養液上清； 3)將培養液上清濃縮後，加入其體積2 5倍的體積分數80 95%的乙醇溶液，充分混勻，O 10°C下靜置12 24h後，收集靜置後的沉澱，得到粗多糖； 4)分離去除粗多糖中的蛋白後，在截留分子量為8000 14000的透析袋中以滅菌純水緩衝液透析24h以上，每12小時更換I次緩衝液； 將透析袋中的多糖溶液低溫冷凍乾燥獲得胞外多糖乾粉。
4.如權利要求3所述的基於Pantoeaananatis G-14發酵培養提取胞外多糖的方法，其特徵在於，所述的步驟I)是將P. ananatis G-14單菌落接種在LB液體培養基中，於25 30°C下，100 300rpm攪拌，通氣培養8 IOh ;然後以I 5%的接種量轉接至發酵培養基中，於25 30°C下，攪拌，通氣培養48 65h ； 所述的發酵培養基是在LB液體培養基中添加質量分數I 5%的葡萄糖作為附加碳源。
5.如權利要求3所述的基於Pantoeaananatis G-14發酵培養提取胞外多糖的方法，其特徵在於，所述的步驟2)的離心為8000 12000rpm，3 lOmin，4°C離心收集培養液上清。
6.如權利要求3所述的基於Pantoeaananatis G-14發酵培養提取胞外多糖的方法，其特徵在於，所述的步驟3)為將培養液上清減壓濃縮至原體積的1/5 1/10，然後加入其體積2 5倍的體積分數80 95%、4°C預冷的乙醇溶液，充分混勻，O 4°C下放置12 24h後使胞外多糖充分沉澱； 8000 12000rpm,3 lOmin,4°C離心收集沉澱,得到粗多糖。
7.如權利要求3所述的基於Pantoeaananatis G-14發酵培養提取胞外多糖的方法，其特徵在於，所述的步驟4)為粗多糖採用Sevage法除蛋白後，離心取上清，在截留分子量為8000 14000的透析袋中在滅菌純水中透析48小時，每12小時更換I次緩衝液； 將透析袋中的多糖溶液在使用冷凍乾燥機中冷凍乾燥，冷凝溫度<-50°C，真空度<20Pa，冷凍時間為18 24h，獲得胞外多糖乾粉。
8.Pantoea ananatis G-14發酵培養分泌的胞外多糖在製備抗氧化劑的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述的抗氧化劑為 清除羥自由基的抗氧化劑、清除超氧陰離子自由基的抗氧化劑、脂質過氧化抑制劑、清除DPPH自由基的抗氧化劑中的一種或幾種。
10.Pantoea ananatis G_14發酵培養分泌的胞外多糖在製備促進腸道損失修復、促進腸道益生菌繁殖和/或抑制腸道病原菌繁殖的藥物的製備。
全文摘要
本發明公開了一種產胞外多糖的菠蘿泛菌及其多糖的提取和應用，其分類命名為Pantoea ananatis G-14，保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC M2010107。本發明提供的P.ananatis G-14在生長過程中向胞外分泌多糖，在培養基上培養後，經過濃縮、沉澱、除蛋白、透析後得到P.ananatis G-14胞外多糖提純產物，產量為380mg/L，其中的糖蛋白濃度為0.7%。Pantoea ananatis G-14發酵培養分泌的胞外多糖具體抗氧化活性和類益生元效果。
文檔編號A61K31/715GK103255075SQ20121023575
公開日2013年8月21日 申請日期2012年7月9日 優先權日2012年7月9日
發明者韓蓓, 張瑞娟, 李衛敏, 王培培, 梁歡 申請人:西安交通大學