用於預防利什曼病的新型手段的製作方法
2023-10-26 21:53:42 6
專利名稱：用於預防利什曼病的新型手段的製作方法
技術領域：
本發明涉及在動物和人中預防利什曼病的新型手段。
本發明特別旨在編碼利什曼蟲(Leishmania)中的毒力或致病力因子的核酸分子，及其用於產生這些因子以製造抗利什曼病的疫苗組合物的用途。
利什曼病是六種主要的寄生蟲病之一，並被世界衛生組織(O.M.S.)以此理由視作優先考慮的事情。利什曼蟲在載體昆蟲(白蛉)的消化管內以細胞外前鞭毛體的形式存在，而在哺乳動物宿主中以細胞內無鞭毛體的形式存在。有幾種分子，包括脂磷酸聚糖(lypophosphoglycane，LPG)或稱為gp63的金屬蛋白酶，似乎在寄生蟲的感染能力和致病力方面起著重要的作用。更近些年來，一個稱為前鞭毛體表面抗原(PSA)的糖蛋白家族引起了人們新的關注。PSA的特徵是存在富含亮氨酸的重複基元，其能夠參與蛋白質/蛋白質類型的相互作用，PSA可在小鼠中提供Th1型細胞介導的保護性免疫性。在生物體中，例如在細菌或植物中，PSA顯示出牽涉諸如細胞粘附、對病原體的抗性和信號轉導之類的功能。
但是，在利什曼蟲中還既沒有描述過也沒有建議過任何生物作用。
由於所擁有的技術，發明人能夠研究這一作用，該技術使得能夠使用完全規定成分的培養基，即其中的成分都是確定的培養基，在無血清(asérique)和無菌的條件下培養利什曼蟲的前鞭毛體和無鞭毛體，這也是以IRD的名義申請的1993年5月13日的專利FR 93 05 779的目標(ex.ORSTOM)。掌握這種方法使得能夠獲得沒有直到那時從培養基中帶來的汙染物的寄生形式，和極純的形式的抗原決定簇。
在該申請人的所述FR專利中，已經描述了在亞馬遜利什曼蟲(L.amazoniensis)培養物的上清液中分離和鑑定38kDa和45kDa的排出/分泌的PSA(排出/分泌型抗原，或縮寫為AES)。
目前，發明人已經分離和克隆了編碼這種蛋白質的cDNA，並通過調整附加的基因轉換策略評價了其在寄生蟲生物學中的作用。這些工作已經允許證明該PSA作為毒力和/或致病力因子而牽涉其中，和產生使得能夠過表達編碼該PSA的利什曼蟲基因的構建體，這使得能夠開發出用於獲得抗利什曼病的疫苗組合物的手段。
因此，本發明的目標是提供能夠編碼利什曼蟲的前鞭毛體形式和無鞭毛體形式的PSA的核酸序列，所述PSA構成了毒力和/或致病力的因子。
十分特別地，本發明旨在提供過表達所述PSA的載體，以及經遺傳修飾的寄生蟲。
此外，本發明還旨在所獲得的PSA培養基上清液，以及分離並純化的PSA，和利用它們的特性來生產抗利什曼病的疫苗組合物。
本發明的核酸序列相應於能夠編碼利什曼蟲的前鞭毛體形式或無鞭毛體形式的PSA的分離的核酸，所述核酸相應於序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQID NO11中之一，並編碼分別為序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的PSA。
更具體地，本發明的核酸序列是屬於符合圖2所圖示特徵的家族並且尤其含有一個SalI限制位點和兩個HindIII限制位點並在第一個HindIII位點下遊具有終止密碼子的cDNA克隆的序列。
本發明特別旨在，在SalI和HindIII這兩個位點之間或者在SalI位點的任一側具有EcoRV和/或PstI限制位點的所述家族的cDNA克隆。
本發明還旨在分離的免疫原性蛋白質，其特徵在於，所述蛋白質呈現出由如上所定義的核酸所編碼的序列。特別地，本發明旨在相應於序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10或SEQ ID NO12的蛋白質。
這些蛋白質屬於稱為前鞭毛體表面抗原(縮寫為PSA)的家族，並具有圖3A和3B所圖示的特徵性區域。這些蛋白質可在翻譯後進行如下修飾N-糖基化、磷酸化和GPI的錨定。這些蛋白質在羧基末端的位置上具有疏水性信號肽。
通過將如上所述的序列定向克隆在表達載體中，發明人獲得了允許這些序列以有義位置進行表達的構建體。
因此，本發明旨在核酸構建體，其特徵在於，所述核酸構建體具有能夠編碼利什曼蟲的前鞭毛體形式或無鞭毛體形式的免疫原性蛋白質的、處於有義位置的、分離的核酸，這些蛋白質相應於序列SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12中之一。
本發明特別旨在這樣的核酸構建體，其具有屬於符合圖2所圖示特徵的家族並且尤其含有一個SalI限制位點和兩個HindIII限制位點並在第一個HindIII位點下遊具有終止密碼子的cDNA克隆的序列。
在SalI和HindIII這兩個位點之間或者在SalI位點的任一側具有EcoRV和/或PstI限制位點的cDNA克隆是特別優選的。
特別有利的構建體具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO11的序列作為核酸序列，這些序列分別編碼序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的蛋白質。
優選的構建體在快速增殖的質粒如pTex中含有所述的核酸序列。
本發明還旨在用這樣的構建體轉染的利什曼蟲株系，不論是前鞭毛體形式或者是無鞭毛體形式。
考慮到所期望的疫苗應用，優選的經轉染的株系是杜氏利什曼蟲(L.infantum)的株系。
有利地，PSA在寄生蟲中以組成性的方式大量地產生。
本發明還旨在轉染利什曼蟲屬的寄生蟲的方法，其特徵在於，將具有標記的前面定義的載體引入利什曼蟲屬的寄生蟲中，通過所述的標記而挑選出經轉染的寄生蟲，將這些挑選出的寄生蟲在成分完全確定的無菌和無血清的培養基中進行培養，和回收培養物的上清液，該上清液含有濃度為利什曼蟲母株系所產生的濃度的10-20倍的免疫原性蛋白質。
將載體引入寄生蟲中例如通過電穿孔來實現。
將這些核酸插入寄生蟲中使得能夠增加寄生蟲的感染能力它們在受感染的巨噬細胞中存活並在那裡增殖的能力是未被這樣的核酸轉染的寄生蟲的直至5倍。
所述的PSA在寄生蟲培養基的上清液中大量地產生。因此，本發明還旨在所述經遺傳修飾的寄生蟲的培養基的上清液，以及從該上清液中分離並純化的PSA。
因此，本發明提供了用於滿足支配大量的構成利什曼蟲中毒力/致病力因子的蛋白質這種工業需求的、具有很大價值的手段。
由於其免疫原性能力，因而這些蛋白質使得能夠在根據常規技術免疫動物之後獲得多克隆抗體，和製造單克隆抗體。因而，免疫小鼠使得能夠獲得抗IgG2A抗體，和免疫犬使得能夠獲得IgG2抗體。
因此，本發明還旨在這樣的抗體，和利用它們的特性用於以工業上可輸出的規模製造在人或動物中抗利什曼病的疫苗組合物。
這些抗體的診斷應用同樣也是本發明的一部分。
本發明的其他特徵和優點將在下面的實施例中給出，在這些實施例中將參考
圖1-8，它們分別如下-圖1，根據本發明的cDNA克隆的核苷酸序列3′端的比對；-圖2，在免疫學篩選之後獲得的cDNA克隆的核苷酸序列的概括性示意圖，所述免疫學篩選使用亞馬遜利什曼蟲的前鞭毛體形式或無鞭毛體形式的表達文庫的抗AES單克隆抗體。限制性內切酶酶切位點在每個序列上標出；-圖3A，在從克隆A3B的cDNA推斷出的蛋白質序列之上存在的、特徵在於其特殊的胺基酸組成的不同蛋白質區域的定位，和圖3B，從編碼PSA的克隆A3B的cDNA推斷出的蛋白質序列的示意性描繪；-圖4，在前鞭毛體(P)和無鞭毛體(A)形式中通過RT-PCR的轉錄物的分析；-圖5，通過使用抗-PSA抗體的Western-blotting所分析的蛋白質產生水平；-圖6，過表達亞馬遜利什曼蟲的PSA對於寄生蟲的感染能力的影響；-圖7，分別相應於亞馬遜利什曼蟲前鞭毛體和無鞭毛體的克隆A3B、2C1、1A1、2G1、W2和杜氏利什曼蟲前鞭毛體的克隆IJ11的核苷酸序列SEQ ID NO1-5和11，以及相應的所編碼的胺基酸序列SEQID NO6-10和12；和-圖8，在犬類動物巨噬細胞的體外感染過程中測定的寄生指數，該體外感染過程使用野生型株系和所挑選出的在不同孵育時間的杜氏利什曼蟲前鞭毛體的克隆。
1-亞馬遜利什曼蟲(縮寫為Lma)前鞭毛體和無鞭毛體形式的AES的主要免疫原的分子表徵這種表徵通過使用抗AES的主要免疫原的單克隆抗體來篩選亞馬遜利什曼蟲前鞭毛體形式和無鞭毛體形式的cDNA表達文庫而得以實施。
-cDNA文庫的特徵產生了分別相應於亞馬遜利什曼蟲前鞭毛體形式和無鞭毛體形式的兩個cDNA表達文庫。這些文庫的特徵在表I中給出。混合指數期和穩定期的寄生蟲，以便能夠獲得可能在寄生蟲體外培養的不同階段期間表達的不同轉錄物。然後，每個文庫5×104個噬菌體用稀釋至1/500的單克隆抗體F5通過免疫學方法進行篩選。獲得這種抗體是上述FR專利中的實施例的目標。
表I
J4+J7＝在處於生長的指數期中的第4天以及在處於生長的穩定期中的第7天收穫的寄生蟲。
-被單克隆抗體F5識別的克隆的分離和測序前鞭毛體文庫的13個克隆和無鞭毛體文庫的11個克隆顯示為陽性。所有這些克隆通過第二次和第三次篩選進行分離。
將全部分離的克隆的質粒DNA在經過不同的酶切消化之後進行分析，並留下經EcoRI/XhoI消化具有較大插入物的cDNA以便去除在5′端截得太短的cDNA。如在表II中所示，前鞭毛體cDNA文庫的克隆1A1、1B1、2B3、2C1、2D1和2E1以及無鞭毛體文庫的克隆A3B、V4A、V5、W2和W3具有較大的插入物。
通過測定事先選擇的兩個限制性內切酶酶切位點(HindIII和SalI)存在與否而進行的這些克隆的分析表明，它們具有高的核苷酸序列同源性。
通過HindIII/SalI雙酶切，展現出三類不同的克隆，其HindIII/SalI片段的大小分別為小於400bp(克隆2G1)、500bp(2C1和A3B型的克隆)或600bp(1A1或W2型的克隆)。因此，根據其DNA的特殊特徵(插入物的大小和某些限制性內切酶酶切位點的位置)而選擇出的五種類型的克隆在表II中以斜體字顯示。
表IILma前鞭毛體的cDNA文庫
Lma無鞭毛體的cDNA文庫
O＝是，位點存在；N＝否，位點不存在；/＝實現的；？＝未獲得結果。
表II還給出了關於克隆表達重組蛋白的能力的結果。IPTG用作誘導劑。在抗前鞭毛體形式和/或無鞭毛體形式的AES的抗體存在下，樣品通過SDS-PAGE和免疫印跡進行分析，其中所述抗體在存在大腸桿菌(E.coli)裂解物時被預先吸附。獲得了等價的結果。對於目的克隆，標出了不同重組蛋白的表達，這些蛋白質的表觀分子量從42.5kDa(克隆2C1)變化至43kDa(克隆A3B)或45kDa(1A1和W2)。
文件「序列表」中報告了下列克隆的測序結果-前鞭毛體文庫的下述三個類型的克隆.1A1型克隆(SEQ ID NO3)，其表達分子量更大的序列SEQ IDNO8的蛋白質。1B1和2B3型克隆具有和該克隆同樣的類型；.克隆2C1(SEQ ID NO2)，其表達分子量小於克隆1A1的呈現出序列SEQ ID NO7的重組蛋白；.克隆2G1(SEQ ID NO4)，其有著具有小HindIII/SalI片段的特點，其表達分子量小於克隆1A1的呈現出序列SEQ ID NO9的重組蛋白。
-無鞭毛體文庫的下述兩個克隆.A3B型克隆(SEQ ID NO1)，其表達大約43kDa的、具有序列SEQ ID NO6的、並具有500bp的HindIII/SalI片段的重組蛋白，克隆V5看起來是相同的。克隆V2D和V4A被認為是同一類型的截短的克隆；.克隆W2(SEQ ID NO5)，其表達45kDa的、具有序列SEQ IDNO10的、並具有600bp的HindIII/SalI片段的重組蛋白。
.五個cDNA序列的研究在圖1中顯示了所獲得的五個cDNA序列的比對，其中這些克隆之間的差異只在於存在有5′端截短的序列和/或5′一側的大約72個核苷酸的序列插入。因此，這些克隆呈現出一個(克隆2C1和A3B)或三個(克隆1A1和W2)插入。除了這些插入區域之外，這些克隆具有99％的序列同源性，從而可認為屬於一個cDNA家族。只有克隆A3B具有起始密碼子ATG，其他的克隆在5′端被截短。然而，A3B cDNA不具有編碼「剪接前導序列」的39nt的序列，該序列存在於利什曼蟲的所有mRNA的5′端。
克隆A3B和2C1的cDNA具有幾乎完全的同源性，因而被認為是同一的，克隆2C1的cDNA相當於克隆A3B的cDNA在5′端被截短後的那一部分。
能代表這一家族的克隆A3B在兩個方向上進行了完整的測序。
在圖2中報告了對於每個克隆的限制性內切酶酶切位點。
序列SEQ ID NO1-5分別相應於A3B、2C1、1A1、2G1和W2的cDNA的序列。
-推斷出的不同蛋白質序列的分析通過選擇相應於由質粒pB-SK上的起始密碼子位置所暗示的讀碼框的讀碼框，將不同的cDNA序列翻譯成蛋白質序列，其中所述讀碼框的轉錄在經受IPTG誘導的基因lacZ的啟動子的控制之下。
蛋白質A3B具有圖3A和3B所圖示的區域。在氨基末端，鑑定出了一個能夠被切割的疏水性肽，其在文獻中被描述成分泌途徑的信號肽。然後是富含亮氨酸的重複結構域，克隆A3B有6個重複。在該結構域末端的十個左右的胺基酸中，存在富含脯氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的區域，下面稱為poly P/T/S區域。該區域之後是富含可能牽涉形成二硫鍵的半胱氨酸的區域。最後，該蛋白質序列以疏水性信號肽結束。
克隆A3B和2C1的cDNA具有幾乎完全的同源性，因而被認為是同一的，克隆2C1的cDNA相當於克隆A3B的cDNA在5′端被截短後的那一部分。
能代表這一家族的克隆A3B在兩個方向上進行了完整的測序。
在圖2中，報告了對於每個克隆的限制性內切酶酶切位點，其中Nt＝核苷酸；ATG＝起始密碼子；TAG＝終止密碼子。
在PROSITE資料庫上的分析表明，蛋白質A3B具有位於每個富含亮氨酸的重複結構域的末端的N-糖基化位點，和12個潛在的磷酸化位點。
在伺服器PSORT上的該蛋白質的定位的分析預測具有92％的細胞質定位，這表明該蛋白質是可溶的。該蛋白質可能通過糖基磷脂醯肌醇或GPI錨定在表面上。因此，所述疏水性信號肽可被切割和使得能夠在天冬醯胺(D)水平上進行GPI的錨定。
克隆A3B的蛋白質的分子量與蛋白質1A1和W2相差大約2.9kDa，這與在相應的重組蛋白之間觀察到的2.5kDa的差異是相一致的。這一差異是由於存在可變數目的富含亮氨酸的重複或LRR，每一個也呈現出特殊的胺基酸組成。
本發明的四種類型的PSA的表觀分子量和理論分子量匯集在下面的表III中。
表III
2-經遺傳修飾的寄生蟲的獲得將基因LaPSA 38s定向克隆進表達載體pTex中使得可以獲得能夠以有義位置表達基因PSA的構建體。然後，將有義方向的質粒pTex-LaPSA 38s和空的載體pTex經電穿孔而引入杜氏利什曼蟲野生型株系Mon 1克隆1中，隨後將這些寄生蟲用遺傳黴素(génétycine)進行選擇。
對野生的杜氏利什曼蟲物種的寄生蟲(Sau)進行研究，它們中的一些用空的pTex轉染(pTex)，和一些用含有目的核苷酸序列的pTex轉染(Sens)。
分子表徵通過Southern印跡法進行的總DNA的分析表明，有義的構建體在經轉化的株系中是穩定的並被擴增。結果圖示在圖4中，該圖給出了在兩種形式即前鞭毛體(P)和無鞭毛體(A)中通過RT-PCR對轉錄物進行的分析。圖5給出了通過使用抗-PSA抗體的Western印跡法而測得的蛋白質的產生水平(圖5A組成型蛋白；圖5B排出/分泌的蛋白)。
突變體的表型表徵Ldi WT、Ldi pTex和Ldi Sens之間的生長動力學的比較表明，LaPSA 38s的過表達沒有幹擾寄生蟲的生長。相對於野生株系，對於轉化的株系只觀察到更長的潛伏期。
還研究了對於被人補體裂解的敏感性。最近，已證明亞馬遜利什曼蟲的PSA具有在體外抑制補體作用的特性。「有義的」前鞭毛體對於補體是更敏感的。因此，在寄生蟲表面上的過量的PSA可能導致切割以及導致更大量地形成複合物從而引起增加的裂解。
寄生蟲的感染能力的研究為了研究LaPSA 38s的過表達對於寄生蟲的感染能力的影響，首要的方法是將轉化的株系的前鞭毛體與犬的巨噬細胞接觸，犬是內臟利什曼病的天然的家庭內儲存庫。
圖6A和6B給出了分別在與前鞭毛體接觸之後2小時和在與無鞭毛體接觸之後48小時所獲得的結果，在這些圖中，寄生指數相當於，被Sens株系感染的巨噬細胞的百分數×每個巨噬細胞的寄生蟲的數目/被對照株系(pTex)感染的巨噬細胞的百分數×每個巨噬細胞的寄生蟲的數目。
過表達LaPSA 38s的前鞭毛體對於犬類動物的巨噬細胞的感染能力表現出增加至2倍。此外，在吞噬之後，表達轉基因的無鞭毛體在寄生泡中存活並增殖的能力顯著高於被空載體感染的對照(2.5-5倍)。
2-杜氏利什曼蟲前鞭毛體的AES的分子表徵圖7中給出了杜氏利什曼蟲前鞭毛體的克隆IJ11的核苷酸序列(SEQ ID NO11)以及相應的胺基酸序列(SEQ ID NO12)。
在圖8中報告了，在犬類動物的巨噬細胞被杜氏利什曼蟲前鞭毛體形式的野生型株系或所選擇出的不同克隆(MHON/MA/67/ITMAP-263，克隆2)體外感染的過程中，於不同的孵育時間測得的寄生指數。這些結果的檢查表明，30分鐘後寄生蟲附著在巨噬細胞上，2小時後寄生蟲穿透入巨噬細胞，和48小時後無鞭毛體在細胞內生存和增殖。
權利要求
1.核酸構建體，其特徵在於，所述核酸構建體含有處於有義位置的分離的核酸，所述核酸能夠編碼利什曼蟲的前鞭毛體形式或無鞭毛體形式的免疫原性蛋白質，所述核酸相應於序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO11中之一。
2. 權利要求1的構建體，其特徵在於，所述序列含有一個SalI限制位點和兩個HindIII限制位點並在第一個HindIII位點下遊具有終止密碼子。
3.權利要求2的構建體，其特徵在於，所述核酸序列在SalI和HindIII這兩個位點之間或者在SalI位點的任一側具有EcoRV和/或PstI限制位點。
4.權利要求1-3中任一項的構建體，其特徵在於，所述核酸序列以有義位置克隆進質粒如pTex中。
5.權利要求1-4中任一項的構建體，其特徵在於，所述構建體編碼利什曼蟲的前鞭毛體形式或無鞭毛體形式的免疫原性蛋白質，這些蛋白質相應於序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12中之一。
6.分離的免疫原性蛋白質，其特徵在於，所述蛋白質具有選自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ IDNO10或SEQ ID NO12的序列。
7.經遺傳修飾的利什曼蟲株系，其特徵在於，它們相當於用權利要求1-5中任一項的構建體轉染的利什曼蟲的無鞭毛體或前鞭毛體形式。
8.權利要求7的株系，其特徵在於，其是杜氏利什曼蟲的株系。
9.利什曼蟲屬的寄生蟲的轉染方法，其特徵在於，將具有標記的權利要求1-5中任一項的構建體引入利什曼蟲屬的寄生蟲中，通過所述的標記而挑選出經轉染的寄生蟲，將這些挑選出的寄生蟲在成分完全確定的無菌和無血清的培養基中進行培養，和回收培養物的上清液，該上清液含有濃度為利什曼蟲母株系所產生的濃度的10-20倍的免疫原性蛋白質。
全文摘要
本發明涉及核酸構建體，其特徵在於，所述核酸構建體含有處於有義位置的分離的核酸，所述核酸能夠編碼利什曼蟲(Leishmania)的前鞭毛體形式或無鞭毛體形式的免疫原性蛋白質，所述核酸相應於序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO5和SEQ ID NO11中之一，並編碼分別呈現出序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ IDNO12的蛋白質。本發明可應用於編碼排出/分泌型抗原的利什曼蟲基因的過表達。
文檔編號C12N15/30GK1902220SQ200480039453
公開日2007年1月24日 申請日期2004年11月19日 優先權日2003年11月19日
發明者J-L·勒梅斯爾, M·卡瓦萊拉, D·塞雷諾, P·奧爾茨米勒 申請人:發育研究院