一種BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法
2023-07-06 05:38:11
專利名稱：一種BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法
技術領域：
本發明提供一種BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，具體地說，是以BALB/c小鼠膝關節為軟骨細胞來源的細胞培養方法，屬生物技術領域。
背景技術：
修復關節軟骨的損傷是臨床的一大難道，目前運用生物材料學及細胞工程學的生物組織工程技術為軟骨的生物性修復提供了一種選擇，現有技術僅有兔的膝關節軟骨細胞的製作和培養方法一種，該方法選用的材料為DMEM培養基，II型膠原酶，新生小牛血清。具體兔膝關節軟骨細胞的分離步驟為膝關節軟骨取自4隻新生日本大耳白兔，無菌條件下切取雙側膝關節，用磷酸鹽緩衝液(PBS)衝洗並剝離軟骨，反覆剪切至1mm3大小，首先進行2.5g/L胰蛋白酶消化30min，離心棄消化液，加入2g/LII型膠原酶，37℃震蕩消化1～2h。顯微鏡下控制消化時間，及時收集細胞，接種於DMEM培養基，內含10％小牛血清。目前為止沒有其它動物膝關節軟骨細胞培養方法的報導。
發明內容
為了解決上述問題，本發明的技術方案是提供一種BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法。
本發明提供一種BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，它是由以下步驟組成a、從BALB/c小鼠膝關節表面取軟骨組織片；b、將a步驟所得的組織塊與消化液混合消化振蕩，得振蕩液；c、將b步驟振蕩液過濾、離心，分離出軟骨細胞團置於培養液中，製成細胞懸液，備用；d、將c步驟所得的細胞懸液過濾後，調節細胞密度至1×105個/ml，用該細胞懸液接種於36.7～36.9℃，4.9～5.1％v/v CO2，飽和溼度的CO2培養箱中培養，得培養細胞；e、將d步驟所得的培養細胞脫蛋白、消化後製成接種細胞，分瓶接種於培養液中培養，即得BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞。
其中步驟b、c、e所述的消化用消化液為0.15～0.18％w/w(重量百分比)II型膠原酶溶液；步驟c、e所述的培養液為含12～18％w/w新生小牛血清DMEM培養液(組織培養液Dulbecco’s Modified EagleMedium)。
b步驟所述的組織塊與消化液混合的體積比值為1∶20～30，所述的消化振蕩為分階段消化，即所有組織塊每消化1h就過濾、離心1次，振蕩消化的條件為36.7-36.9℃水浴中輕微振蕩，消化2.5～4小時，振蕩頻率為20-30次/min。
步驟c所述的離心採用高速冷凍離心機800～1200r/min離心13～17min。步驟e所述的脫蛋白為0.15～0.2％w/w胰蛋白酶溶液，消化液為0.15～0.18％w/wII型膠原酶溶液，36-37℃下消化。
本發明方法得到的小鼠軟骨細胞用於修復關節軟骨損傷，增加軟骨細胞的新的來源。本發明方法用BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞培養，可獲得充足的、分化良好的小鼠軟骨細胞，培養的小鼠軟骨細胞成活率一周後可達80％～90％，其高成活率有利於細胞培養，且成本較低，由於小鼠軟骨細胞的抗原性低，為進一步醫學研究和臨床需求奠定了條件。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
具體實施例方式
實施例1 本發明方法的具體步驟1、主要實驗材料(1)軟骨細胞來源動物材料可用8-16隻雌BALB/c(h-2d)6～8周齡小鼠膝關節軟骨標本。
(2)消化液0.15-0.2％w/wII型膠原酶溶液，(Sigma，U.S.A)，過濾除菌。
(3)培養液可選擇DMEM培養基(Gibco，U.S.A.)培養基。一般在培養液中加入12-18％w/w新生小牛血清。
(4)篩網100-200目銅網。
2、操作步驟(1)取材及分離細胞1)用手術刀片從BALB/c小鼠的膝關節表面削下軟骨組織片，收集在磷酸鹽緩衝液PBS中，反覆清洗除去軟骨片表面的血液以及可能誤帶的滑膜組織。新鮮軟骨呈乳白中帶淺藍色、半透明狀，略具彈性。
2)將軟骨片充分剪成1～2mm3以下的組織塊，用PBS清洗3～5次，按組織塊與消化液的體積比例為1∶20～30的量加入消化液，置於在36.7～36.9℃水浴中輕微振蕩20～30次/min，振蕩消化採用分階段消化法，消化時間2.5-4h，即每消化1h就過濾、離心1次，採用高速冷凍離心機(Heraeus)800～1200r/min離心13-17min，收集細胞，將分離後的軟骨細胞立即放入含12～18％w/w小牛血清DMEM培養液中保存起來製成細胞懸液，用100～200目銅網過濾，收集含軟骨細胞濾液。
(2)培養過程1)計數細胞，根據需要增加含12-18％w/w小牛血清DMEM培養液調節細胞密度至1×105個/ml的密度接種，置於36.7～36.9℃，4.9～5.1％v/vCO2，飽和溼度的CO2培養箱中培養，每3d換1次培養液。
2)細胞長滿瓶壁後，即可傳代。屆時，用PBS清洗培養物，加入0.15～0.2％w/w胰蛋白酶溶液，36～37℃下消化。鏡下觀察可見大部分細胞間基質溶解消失。當細胞變圓時，加入含12～18％w/w小牛血清DMEM培養液，吹打分散細胞。
3)分瓶接種於含12～18％w/w小牛血清DMEM培養液中並培養。
(3)培養結果在倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的軟骨細胞為球形，6h左右開始貼壁生長。原代培養的細胞匯合成片後，呈圓形或橢圓型，可分泌少量細胞外基質。即可獲得充足的、分化良好的BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞。
實施例2用兔膝關節軟骨細胞的培養方法培養BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞與本發明BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法比較用兔的膝關節軟骨細胞的培養方法，培養小鼠的膝關節軟骨細胞，一周後的成活率為0～20％，成活率較低；用本發明的BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法製備的軟骨細胞，可獲得充足的、分化良好的Balb/c小鼠膝關節軟骨細胞，成活率一周可達80％～90％，成活率高。
通過上述具體實施方式
可知，本發明方法獲得充足的、分化良好的小鼠軟骨細胞，培養的小鼠軟骨細胞成活率一周後可達80％～90％，其高成活率有利於細胞培養，且成本較低，由於本明方法所得小鼠軟骨細胞抗原性低，為進一步醫學研究和臨床運用奠定了條件。
權利要求
1.一種BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，其特徵在於它是由以下步驟組成a、從BALB/c小鼠膝關節表面取軟骨組織片；b、將a步驟所得的組織塊與消化液混合消化振蕩，得振蕩液；c、將b步驟振蕩液過濾、離心，分離出軟骨細胞團置於培養液中，製成細胞懸液，備用；d、將c步驟所得的細胞懸液過濾後，調節細胞密度至1×105個/ml，用該細胞懸液接種於36.7～36.9℃，4.9～5.1％v/v CO2，飽和溼度的CO2培養箱中培養，得培養細胞；e、將d步驟所得的培養細胞脫蛋白、消化後製成接種細胞，分瓶接種於培養液中培養，即得BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞。
2.根據權利要求1所述的BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，其特徵在於步驟b、c、e所述的消化用消化液為0.15～0.18％w/wII型膠原酶溶液。
3.根據權利要求1所述的BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，其特徵在於步驟c、e所述的培養液為含12～18％w/w新生小牛血清的DMEM培養液。
4.根據權利要求1所述的BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，其特徵在於b步驟所述的組織塊與消化液混合的體積比值為1∶20～30。
5.根據權利要求1所述的BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，其特徵在於b步驟所述的消化振蕩為分階段消化，即所有組織塊每消化1h就過濾、離心1次，振蕩消化的條件為36.7-36.9℃水浴中輕微振蕩，消化2.5～4小時，振蕩頻率為20-30次/min。
6.根據權利要求1所述的BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，其特徵在於c步驟所述的離心採用高速冷凍離心機800～1200r/min離心13～17min。
7.根據權利要求1所述的BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，其特徵在於步驟e所述的脫蛋白為0.15～0.2％w/w胰蛋白酶溶液，消化液為0.15～0.18％w/wII型膠原酶溶液，36～37℃下消化。
全文摘要
本發明提供了一種BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞的培養方法，具體地說，是以BALB/c小鼠膝關節為軟骨細胞來源的細胞培養方法，本發明方法選用BALB/c小鼠膝關節軟骨細胞，增加軟骨細胞的新的來源，培養的小鼠軟骨細胞成活率一周後可達80％～90％，成活率高，有利於小鼠軟骨細胞培養，且成本較低，為進一步醫學研究和臨床運用奠定了條件。
文檔編號C12N5/06GK1539963SQ20031011077
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月27日 優先權日2003年10月27日
發明者劉健, 劉 健 申請人:劉健, 劉 健