β-葡糖苷酶激活劑用於檢測和/或鑑定難辨梭菌的用途的製作方法

2023-10-26 09:22:42 1

專利名稱：β-葡糖苷酶激活劑用於檢測和/或鑑定難辨梭菌的用途的製作方法
^-葡糖苷酶激活劑用於檢測和/或鑑定難辨梭菌的用途本發明涉及檢測和/或鑑定難辨梭菌(Clostridium difficile)的方法。其還涉及對難辨梭菌具有特異性的包含3葡糖苷酶激活劑的反應培養基。難辨梭菌(C.difficile)是革蘭氏陽性芽孢桿菌，其是完全厭氧的且形成孢子。難辨梭菌是嚴重程度不定的腸疾病的病因:中度或爆發性腹瀉、假膜性結腸炎或中毒性巨結腸，這些病症自身可以成為膿毒症的原因。難辨梭菌通過經口攝入對胃酸耐受且在腸中萌發的孢子來傳染。結腸的共生菌落的失衡能使難辨梭菌增殖，這產生成為結腸炎病因的毒素。在許多情況下，共生菌落的失衡歸因於服用抗生素。難辨梭菌可以被認為是無害的環境微生物，其在某些條件下變成機會致病菌。難辨梭菌的無症狀消化系統攜帶者在成年人群中估計為3%，但在抗生素治療或在高流行性單位停留之後達到個體的15%至25%。通常觀察到高攜帶水平，從住院患者的20%至40%高達至幼兒的50%至70%。能夠早期且迅速的診斷是預防嚴重併發症和有效醫療護理的關鍵要素。診斷基於對毒素的尋找並基於培養。毒素直接從糞便的分離是難辨梭菌的產毒菌株存在的優異標記。參考方法在於通過細胞培養來尋找致細胞病變作用(在英語中，CTA表示細胞毒活性)。該方法非常靈敏，但未被標準化，並且需要專門的技術人員和幾天的響應時間。已經開發了 ELISA型免疫酶試驗，其檢測單獨的毒素A或者毒素A和B。獲得結果的時間降低了。然而，推薦將用於檢測毒素的免疫學技術與細菌培養組合以分離難辨梭菌菌株。可在由本申請人銷售的難辨梭菌瓊脂上採用該培養，然後通過生物化學方法(例如API 20A試條(gallery)或快速ID32A試條)來鑑定難辨梭菌菌落。然而，通過試條鑑定必須使要鑑定的細菌的純培養物在合適的生長培養基上，以獲得足夠的生物質(3至4McFarland)，這在最好的情況下耗時48小時(從採樣開始24至72小時的分離培養(這僅給出了假定的檢測)，然後24至72小時的培養以產生足夠的生物質)。然後，對於ID32A試條，在孵育4小時後進行試條的讀數，對於20A試條，在孵育24至48小時之後進行試條的讀數。最終，可以使用分子生物技術進行診斷。然而，這些技術並非目前常用的。通過本申請人為了改善在細菌培養物中直接鑑定難辨梭菌而進行的工作，本申請人證明，￠-葡糖苷酶酶底物的使用可以容易且快速地鑑定難辨梭菌。所述￠-葡糖苷酶底物的使用在申請W02009/092982中描述為減少獲得難辨梭菌鑑定結果所用的時間。早期且迅速地鑑定在樣品中可能存在的難辨梭菌仍是主要目的，並且本申請人已經通過更特別地尋求加快酶活性的顯示來繼續從事其工作。因此，本申請人已經出乎預料地證明，包含￠-葡糖苷酶底物和通式Ar-P-D-吡喃葡糖苷的￠-葡糖苷酶激活劑的反應培養基使難辨梭菌在樣品中被迅速鑑定，換言之，這樣的培養基使至少一些難辨梭菌菌株的酶活性被更早地檢測，在所述通式中，Ar-對應於芳環或多個毗連的芳環。Ar-P-D-葡糖苷化合物的使用使3-葡糖苷酶被激活並且能觀察到難辨梭菌菌落的明顯更強的著色。有利地，所述Ar- ^ -D-葡糖苷化合物具有遠優於其他P -D-葡糖苷衍生物(例如纖維二糖(4-0-^-D-吡喃葡萄糖基-D-葡萄 糖)或甲基-D-葡萄糖)的難辨梭菌P -葡糖苷酶激活能力。
已知的是，通式Ar- ^ -D-葡糖苷的化合物能用作P -葡糖苷酶底物，在所述通式中，Ar表示至少一種同素環的或雜環的芳環。該用途報導於申請W02009/092982(如上)中。同樣,HiIdebrand和Schroth報導了熊果苷或氫醌P -D-卩比喃葡糖苷作為碳源以0.5%重量/體積(換言之，5g/l)的濃度與葡萄糖組合用於反應培養基中。由色譜方法測定的熊果苷在氫醌中的水解是丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的P -葡糖苷酶活性的標記(Hildebrand 和 Schroth, Applied Microbiology, 1964; 12 (6):487-491)。這阻礙了本領域技術人員將Ar- ^ -D-葡糖苷化合物作為P -葡糖苷酶激活劑用於反應培養基中以檢測或鑑定難辨梭菌，因為他們會發現其自身與旨在顯示靶微生物的酶活性的底物競爭。最後，現有技術報導了口服給予的熊果苷被排洩和代謝在尿中，並且由於其利尿和抗菌性質可以加以使用(Schindler等人，2002; J.Clin.Pharmacol.; 42 (8): 920-927; Siegers 等人,2003, Phytomedicine; 10 (Suppl4): 58-60)。這樣的用途也阻礙了將熊果苷用於反應培養基中以檢測細菌。在詳細描述本發明之前，給出下列定義以更好地理解本發明。它們不以任何方式進行限制。反應培養基應理解為包含微生物的代謝表達和/或生長所必須的所有成分的培養基。所述反應培養基可以是固體的、半固體的或液體的。固體培養基應理解為凝膠化的培養基。瓊脂是微生物學中常見的用於培養微生物的凝膠劑，但可以使用明膠、瓊脂糖或者其他天然或人造的凝膠劑。許多製劑是可商購的，例如Columbia瓊脂、Trypcase-大豆瓊月旨、MacConkey 瓊脂、Sabouraud 瓊脂，或更一般來說例如在 Handbook of MicrobiologicalMedia(CRC Press)中描述的那些。本發明的反應培養基必須允許難辨梭菌生長。所述反應培養基可以包含一種或多種組合的成分，例如胺基酸、蛋白腖、碳水化合物、核苷酸、礦物質、維生素等。所述培養基還可以包含著色劑。作為指示，可以例舉依文思藍、中性紅、羊血、馬血、諸如氧化鈦的遮光劑、硝基苯胺、孔雀石綠、亮綠、一種或多種代謝指示劑、一種或多種代謝調節劑等作為著色劑。所述反應培養基可以為顯示培養基、或者培養顯示培養基。在第一種情況下，微生物的培養在接種之前進行，在第二種情況下，檢測和/或鑑定培養基還構成了培養培養基。本領域技術人員還可使用鴦鴦平板(b1-biote),其可以容易地比較兩種包含不同底物或不同選擇性混合物的培養基，並且在其上已沉積了相同的生物樣品。所述反應培養基可以包含難辨梭菌菌株的一種或多種生長激活劑。生長激活劑應理解為刺激微生物生長的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉血液、血清和蛋黃。非限制性地提及，0.1%至10%的濃度特別適於本發明。所述反應培養基可以包含一種或多種還原劑。還原劑應理解為通過中和在培養基中存在的溶解的氧來促進厭氧細菌生長的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉半胖氨酸、丙酮酸鹽、去氧酶(I』 Oxyrase)、亞硫酸鈉、二硫酸鹽、組氨酸和硫化亞鐵。非限制性地提及，0.05g/l至50g/l、優選0.lg/1至2g/l的濃度特別適於本發明。

所述反應培養基可以包含一種或多種難辨梭菌孢子萌發誘導劑。孢子萌發誘導劑應理解為促進難辨梭菌從孢子狀態到植物狀態的一種化合物或一組化合物。特別地，可以例舉牛磺膽酸鈉。非限制性地提及，0.lg/1至10g/l、優選lg/1至5g/l的濃度特別適於本發明。
所述反應培養基可以包含一種或多種選擇性藥劑。選擇性藥劑應理解為能阻止或減緩除靶微生物之外的微生物生長的任何化合物。非限制性地提及，5mg/l至5g/l的濃度特別適於本發明。可以例舉抗生素和抗真菌劑作為選擇性藥劑。抗生素應理解為能阻止或減緩細菌生長的任何化合物。特別地，它們屬於頭孢菌素、氨基糖苷、多肽、磺醯胺和喹諾酮。作為指示，特別可以例舉抗生素頭孢噻肟、頭孢他唆、頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢泊肟、氨曲南、慶大黴素、甲氧苄啶、妥布黴素、拉氧頭孢、磷黴素、D-環絲氨酸、多粘菌素、多粘菌素-E和諸如萘啶酸的喹諾酮。抗真菌劑應理解為能阻止或減緩酵母或黴菌生長的任何化合物。作為指示，可以特別例舉兩性黴素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和環己醯亞胺。通常，所述反應培養基還可包含可以通過能被直接或間接檢測到的信號來檢測靶微生物的酶活性或代謝活性的底物。對於直接檢測，該底物可與用作螢光或發色標記的部分連接。對於間接檢測，本發明的反應培養基還可包含PH指示劑，其對由底物消耗而導致的PH變化敏感並顯示靶微生物的生長。所述pH指示劑可以是發色團或螢光團。可以例舉中性紅、苯胺藍和溴甲酚藍作為發色團的實例。所述螢光團包括例如4-甲基傘形酮、羥基香豆素衍生物或試滷靈衍生物。能鑑定難辨梭菌的3 -葡糖苷酶底物應理解為在適合的生長條件下導致難辨梭菌著色的底物。特別地，可以提及2-羥基苯基-￠-葡糖苷(鄰苯二酚-￠-葡糖苷)；品紅_匍糖昔(5_漠_6_氣_3_ D引噪氧基_匍糖昔)；DHF_0 -匍糖昔(二輕基黃酮-葡糖苷);七葉苷(七葉亭-葡糖苷)(Esculetine-beta glucoside) ;CHE_3-葡糖苷(3，4-環己烯並七葉亭-葡糖苷)(3, 4Cyclohexenoesculetine-beta glucoside)；8-羥基喹啉-0 -葡糖苷；X-0 -葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-P -葡糖苷)；玫瑰紅-3 -葡糖苷(Rose-beta glucoside) (6_氯_3_卩引哚氧基-旦_葡糖苷);6_溴_3_ 口引哚氧基 葡糖苷；藍色-￠ -葡糖苷(Blue-beta glucoside) (5_溴_3_吲哚氧基_ 3 _葡糖苷);6~氟-3- 1 丨哚氧基--匍糖苷；菌素-P -匍糖苷；對硝基苯基_ P _匍糖苷；4甲基傘形麗-3 _ 葡糖昔(4Methylumbelliferyl_beta glucoside)、對蔡酌■苯甲醇葡糖苷、吲哚氧基-N-甲基-P -葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-P -葡糖苷、萘基-￠-葡糖苷；氨基苯基-￠-葡糖苷；二氯氨基苯基-￠-葡糖苷、AldolTM-P-葡糖苷(B10SYNTH, Lukas M.Wick, Alexander Bayer, Christophe ffeymuth, GiinterSchabert, Vanessa Pfister, Aysel Aslan, Urs P.Spitz, 「Novel Chromogenic EnzymeSubstrates」 , ASM General Meeting, 2009, Philadelphia, 1-091/285)。所述反應培養基還可以包含酶激活劑。酶激活劑應理解為用於激活酶消化過程(換言之，用於降低顯示酶活性所用的孵育時間和/或增加所述酶活性)的化合物。本發明的￠-葡糖苷酶激活劑具有通式Ar-P-D-葡糖苷，其中Ar-表示芳環。我們通過芳環表示不飽和化合物，即，具有雙鍵並包含一個或多個毗連的同原子的環或雜原子的環，每個環具有5至7個頂點。以非限制性的方式，可以提及熊果苷(氫醌-D-葡糖苷)、4_甲基傘形酮-P -D-葡糖苷、4-氨基苯基-0 -葡糖苷、水楊苷(2-(羥基甲基)苯基-P -D-葡糖苷)和七葉苷(6，7- 二羥基香豆素-P -葡糖苷)。這些化合物中的一些為^ -葡糖苷酶底物。對於本發明，它們被認為是激活劑，因為它們可以降低檢測用作底物的化合物的水解所必需的孵育時間，或者它們可以增進這種水解。因此，令人驚訝地，本發明的酶底物和激活劑的組合可以具有比分別使用這些化合物時更早和/或更強的酶活性檢測。可以明顯地證明化合物對具有延遲的和/或微弱的￠-葡糖苷酶活性的某些難辨梭菌菌株的激活能力，如果所述化合物和所述底物的組合與僅以至少等於組合的底物和激活劑的摩爾濃度總和的摩爾濃度使用激活劑的底物時相比能使檢測更早和/或更強的話。生物樣品旨在表示從用於分析的實體分離的一小部分或少量。其可以為得自生物流體樣本的臨床樣品，或得自任何類型的食物的食物樣品。因此，該樣品可以為液體的或固體的。以非限制性的方式，可以提及全血、血清、血漿、尿或糞便樣品、鼻、喉、皮膚、傷口或腦脊液的臨床樣品；來自水、諸如牛奶或果汁的飲料、酸乳、肉、蛋、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚等的食物樣品；源自動物飼料的食物樣品，例如特別是來自骨粉的樣品。該樣本可以原樣使用，或可以在分析之前根據本領域技術人員已知的方法進行富集、提取、濃縮或純化型的配製。在接觸所述樣品之後，使所述反應培養基在合適溫度(通常為20° C至50° C、優選為30° C至40° C)下孵育。優選地，所述孵育根據本領域技術人員已知的技術在厭氧生活中(換言之，在不存在氧氣的情況下)進行。因此，本發明涉及反應培養基，其包含至少一種P -葡糖苷酶底物和濃度低於5g/I的不同於所述底物的通式A r-P-D-葡糖苷的化合物，其中Ar-表示芳香化合物。所述化合物Ar-0 -D-葡糖苷的濃度優選為0.3g/l至1.5g/l。所述通式Ar- ^ -D-葡糖苷的化合物優選選自熊果苷或氫醌-P -葡糖苷、4-甲基傘形酮-P -葡糖苷、4-氨基苯基-P -葡糖苷、水楊苷或2-(羥基甲基)苯基-P -D-葡糖苷、七葉苷或6，7- 二羥基香豆素-P -葡糖苷。所述化合物Ar- ^ -D-葡糖苷優選為熊果苷。根據本發明的一個優選實施方案，所述￠-葡糖苷酶底物選自茜素-￠-葡糖苷、品紅-P -葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-P -葡糖苷)、DHF- ^ -葡糖苷、3HF- P -葡糖苷和CHE- P -葡糖苷(3，4-環己烯並七葉亭-P -葡糖苷)和B10SYNTH公司的ALDOL P -葡糖苷(Wick 等人.2009.ASM General meeting - Philadelphia (PA, USA))。所述 3 -葡糖苷酶底物的濃度為25mg/l至1000mg/l,優選為50mg/l至400mg/l。根據本發明，所述酶激活劑為水解產物與所述酶底物的水解產物不同的酶底物。根據本發明的一個優選實施方案，所述酶激活劑是其產物在所述反應培養基中不能由肉眼檢測到的酶底物，而前述酶底物的水解產物則可以。根據本發明的另一優選實施方案，所述反應培養基還包含難辨梭菌孢子萌發激活齊U，所述激活劑優選為牛磺膽酸鈉，濃度為0.lg/1至10.0g/l，優選為1.0g/1至5.0g/1。本發明涉及檢測和/或鑑定難辨梭菌的方法，其包括下列步驟:a)使可能包含難辨梭菌的樣品與包含至少一種P -葡糖苷酶底物和不同於所述底物的通式Ar-P-D-葡糖苷的化合物的反應培養基接觸，其中Ar-表示芳香化合物；b)孵育，以及c)檢測所述P -葡糖苷酶底物的水解，所述水解指示難辨梭菌的存在。根據一個優選的實施方案，本發明的方法在步驟a)中採用諸如上文定義的培養基。
根據另一優選的實施方案，在本發明的方法的步驟b)中採用的孵育是在厭氧生活中進行的。本發明涉及通式Ar-P -D-葡糖苷的化合物作為P _葡糖苷酶激活劑在反應培養基中的用途。優選地，所述化合物的濃度低於5g/l，優選為0.3g/l至1.5g/l。優選地，所述化合物選自:熊果苷或氫醌-3 -D-葡糖苷、4-甲基傘形酮-@ -D-葡糖苷、4-氨基苯基-0 -葡糖苷、水楊苷或2-(羥基甲基)苯基-P -D-葡糖苷、七葉苷或6，7- 二羥基香豆素-葡糖苷。更優選地，所述化合物為熊果苷。優選地，所述反應培養基為用於檢測和/或鑑定難辨梭菌的培養基。以說明的方式給出下列實施例，這些實施例決非限制性的。它們將使本發明能被更好地理解。實施例1:證明熊果苷對葡糖苷酶底物的激活作用1.培養基和微生物在存在或不存在CHE-P-葡糖苷的情況下，在包含不同濃度的熊果苷的培養基上試驗了由本申請人收集的8種難辨梭菌菌株。然後在24小時時進行培養皿的讀數。培養基的組成如下: 所有培養基共用的難辨梭菌ChromID 基質:
權利要求
1.反應培養基，其包含至少一種￠-葡糖苷酶底物和濃度低於5g/l的不同於所述底物的通式Ar- ^ -D-葡糖苷的化合物，其中Ar-表示芳香化合物。
2.權利要求1的反應培養基，其中所述化合物Ar-P-D-葡糖苷的濃度為0.3g/l至1.5g/l o
3.權利要求1或2的反應培養基，其中所述化合物Ar-^ -D-葡糖苷選自氫醌-P -D-吡喃葡糖苷、4-甲基傘形酮-P -葡糖苷、4-氨基苯基-0 -葡糖苷、水楊苷或2-(羥基甲基)苯基-P -D-葡糖苷、七葉苷或6，7- 二羥基香豆素-P -葡糖苷。
4.權利要求1至3中任一權利要求的反應培養基，其中所述化合物Ar-P-D-葡糖苷為Jf旨果昔。
5.權利要求1至4中任一權利要求的反應培養基，其中所述￠-葡糖苷酶底物選自茜素-￠-葡糖苷、品紅-￠-葡糖苷(5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-￠-葡糖苷)、DHF-P-葡糖苷、3HF- ^ -葡糖苷和CHE- ^ -葡糖苷(3，4-環己烯並七葉亭-P -葡糖苷)以及ALDOL P -葡糖苷。
6.權利要求1至5中任一權利要求的反應培養基，其中所述P-葡糖苷酶底物的濃度為 25mg/l 至 1000mg/l,更優選為 50mg/l 至 400mg/l。
7.權利要求1至6中任一權利要求的反應培養基,其還包含難辨梭菌(Clostridiumdifficile)孢子萌發激活劑。
8.權利要求7的反應培養基，其中所述難辨梭菌孢子萌發激活劑為牛磺膽酸鈉。
9.權利要求7或8的反應培養基，其中牛磺膽酸鈉的濃度為0.lg/1至10g/l，優選為lg/1 至 5g/l。
10.檢測和/或鑑定難辨 梭菌的方法，其包括下列步驟: a)使可能包含難辨梭菌的樣品與包含至少一種3-葡糖苷酶底物和不同於所述底物的通式Ar- ^ -D-葡糖苷的化合物的反應培養基接觸，其中Ar-表示芳香化合物； b)孵育； c)檢測所述3-葡糖苷酶底物的水解，所述水解指示難辨梭菌的存在。
11.權利要求10的方法，其中在步驟a)中採用的培養基為權利要求1至9中任一權利要求的培養基。
12.權利要求10或11的方法，其中在步驟b)中採用的孵育是在厭氧生活中進行的。
13.熊果苷作為￠-葡糖苷酶激活劑在反應培養基中的用途。
14.熊果苷作為￠-葡糖苷酶激活劑在難辨梭菌檢測和/或鑑定培養基中的用途。
全文摘要
本發明涉及包含至少一種β-葡糖苷酶底物和不同於所述底物的通式Ar-β-D-葡糖苷的化合物的反應培養基，其中Ar-表示芳香化合物。根據本發明，這樣的培養基可用於檢測和/或鑑定難辨梭菌(C.difficile)的方法中。
文檔編號C12N3/00GK103080299SQ201180041835
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月30日 優先權日2010年9月1日
發明者M·塞利耶, D·哈利米, S·奧倫加 申請人:生物梅裡埃公司