白蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒及檢測方法

2023-10-26 21:25:12

專利名稱：白蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種白 蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒及檢測方法，應用於現場疾病控制或者流行病學檢測。
背景技術：
內臟利什曼病廣泛分布於亞洲、非洲、歐洲和拉丁美洲熱帶及亞熱帶地區，但以中 國、印度和地中海沿岸國家為主。我國流星雨敢賭、四川、山西、陝西、新疆和內蒙古等17省 (市、區)。根據不同的地理環境、傳染源和傳播媒介將內臟利什曼病分為3型，山丘型，平 原型和自然疫源型。利什曼原蟲不僅種類繁多，且其宿主和媒介亦具多樣性和交叉性，因此正確鑑定 利什曼原蟲對選擇恰當的治療措施、制定合適的控制策略均至關重要。利什曼原蟲蟲種復 雜，且新種時有發現。分子方法的不斷湧現及應用為解決這一問題提供了契機，但由於各種 方法自身的特點及所分析的靶序列的差異，其分析結果往往不一致，甚至矛盾。如何形成一 種「金標準」的分子分析或鑑定方法，並與外在特徵相統一是亟待解決的問題。rRNA是常 用的靶基因。rRNA是生物細胞中最為保守的結構基因，在進化過程中，不同種屬真核生物 rDNA序列特徵保持相對穩定，常顯示出高度的保守性和廣泛的異種同源性，其序列不同位 置上的變化速度不同而具有良好的時鐘性質，某些序列具有種株特異性，已成為進行病原 體種株鑑定和診斷的靶基因，並應用於系統分類及構建進化樹。長期以來，在現場工作中，白蛉的分類鑑定和感染診斷主要依靠鏡下鑑定，由於白 蛉個體微小、種間形態近似以及種下多型的現象，想用解剖鏡鑑別需要較高的解剖技能，以 及研究者多年的經驗，因此常受到標本狀態、環境條件和研究者主觀經驗的影響較大。同 時，黑熱病媒介監測和流行病學調查中，面臨的往往是大量的白蛉，費時費力。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種白蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒。本發明所要解決的另一技術問題是克服傳統白蛉體內利什曼原蟲檢測方法的不 足，提供一種簡單快速、靈敏特異、對技術人員要求不高的分子檢測白蛉體內利什曼原蟲的 方法。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一方面，提供一種白蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒，包括下列組成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反應液包括雙蒸滅菌水、2XMaster PCR mix和引物；所述引物含有兩對 引物，引物1的序列為上遊:5，-CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3，，其序列如SEQ ID NO 1 所示；下遊:5，-CCA CCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3，，其序列如 SEQ ID NO 2 所示； 引物 2 的序列為上遊5'-CCT GGT TAG TTT CTTTTC CTC CGC T-3，，其序列如 SEQ ID NO: 3 所示；下遊5，-CGC AGC TAA CTGTGT GAA ATC-3，，其序列如 SEQ ID NO :4 所示。其中，引物1能特異性擴增利什曼原蟲；引物2能特異性擴增白蛉屬。在本發明的另一方面，提供一種白蛉體內利什曼原蟲的檢測方法，包含如下步 驟(1)白蛉的抽提；(2)設計併合成如權利要求1所述的引物1 (上遊SEQ ID NO :1，下遊SEQID NO 2)和引物 2 (上遊 SEQ ID NO :3，下遊 SEQ ID NO 4)；(3)將步驟(1)抽提得到的白蛉抽提液作為DNA模板進行複合PCR方法檢測；檢 測複合PCR反應體系為DNA模板，2 XMaster PCR mix，步驟⑵合成的引物1和引物2，雙 蒸滅菌水；(4)步驟⑵所得的PCR產物4°C保存，進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。步驟⑵中，所述複合PCR反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30seC、55°C退 火30sec、72°C延伸30sec共35個循環，72°C再延伸lOmin。本發明的有益效果在於目前的各種PCR衍生技術中，多重PCR技術可同時實現檢 測與假陰性控制。本發明在PCR反應體系中除特異性擴增利什曼原蟲的引物外，還加入一 對特異性擴增白蛉屬的引物，作為內參，採用該兩對引物進行PCR反應可以避免假陰性情 況的發生。本發明所用的複合式PCR方法，在鑑定人員缺乏長期現場經驗的情況下，能夠及 時快速的進行陽性白蛉的篩選，一次性確定陽性白蛉，是對傳統白蛉檢測的一種有益的補 充和確認的方法。為現場快速檢測白蛉體內的利什曼原蟲提供了一種新的檢測手段。本發 明從分子水平上進行鑑別和診斷，結果更客觀，靈敏度更高。同時可以在後續的工作中應用 本發明方法同時進行蛉種和蟲種的鑑別。


圖1是實施例1的白蛉和利什曼原蟲實驗室混合樣本與野外標本對照的1. 5%瓊 脂糖凝膠電泳圖，圖1中，M為DNA分子量標準；1為利什曼原蟲PCR結果；2為野外標本抽 提DNA的PCR結果；3為實驗室白蛉和利什曼原蟲混合樣本PCR結果；4為陰性對照。
具體實施例方式以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1白蛉的抽提(採用QIAGEN DNA抽提試劑盒，產品型號為69504購自 QIAGEN國內代理商上海市萊楓科技有限公司)1.採集野外白蛉解剖鏡下驗證利什曼原蟲陽性、前鞭毛體感染，帶回實驗室；2.取一隻白蛉放入1. 5mlEP管(離心管)中，加入ATL (組織裂解液，購自QIAGEN 公司)180ul (微升)，充分研磨，加入20ul蛋白酶K (購自QIAGEN公司)，水浴55°C 2小時；3.在EP管中加入200ul AL (裂解液，購自QIAGEN公司，水浴70°C 10分鐘；4.在EP管中加入200ul無水乙醇，充分混勻，將混合液移至過濾柱中，離心 8000rpmXlmin ；5.棄收集管和液體，在過濾柱中加入500ul已加入無水乙醇25ml的WAl (洗滌液 1，購自 QIAGEN 公司)，離心 8000rpmXlmin ；
6.棄收集管和液體，在過濾柱中加入500ul已加入無水乙醇30ml的WA2 (洗滌液 2，購自 QIAGEN 公司)，離心 14000rpmX 3min ；7.換新的收集管，空轉過濾柱，14000rpmX Imin ；8.加入200ul AE (洗脫液，購自QIAGEN)，把過濾柱放到新的EP管中，靜置1分鐘 後，離心 8000rpmXlmin ；9.得到DNA模板，4°C保存備用。實施例2、引物設計根據國際基因庫中已公布的利什曼原蟲保守序列的動基體DNA小環，動基體DNA 具有利什曼原蟲屬的高度保守性，同時，它還具有高度異質性特點，不但在種間高度差異， 而且在同種不同地理株間也存在差異，設計兩對特異性引物引物1的序列為上遊:5，-CTTTTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3，，其序列如 SEQ ID NO 1 所示；下遊5，-CCACCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3，，其序列如 SEQ ID NO 2 所示；片段長度140bp左右測序結果CCACCTGGCCTATTTTACACCAACCCCCAGTTTTCCGCCTCGGAGCCCATTTTGGCATTTTTGGCCGAT TTTGAACGGGATTCTGCACCCATTTTTCCGATTTTGCAAAACGCCCCTACCCGCGGGACCAGAAAAGA經過廣泛研究證實，核糖體基因(ribosome DNA, rDNA)是分子鑑別和分子系統學 研究的較理想的分子指標，根據基因資料庫中白蛉序列為基礎，其中白蛉核糖體DNA第2內 轉錄間隔區(rDNA-ITS2)序列為重要的分子特徵序列，以此為基礎設計引物。引物2的序列為上遊5，-CCTGGT TAG TTT CTT TTC CTC CGC T-3，，其序列如 SEQ ID NO :3 所 示；下遊5，-CGCAGC TAA CTG TGT GAA ATC-3，，其序列如 SEQ ID NO 4 所示。片段長度約為500bp測序結果TCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTAATATGCTTAAATTCAGGGGGTAGTCACGCATGAGTTGA GGTCGCTTTTTTAAAAATATACATTTTTTCTTTAGACACATTCTTTATTATGAATAATCTCTTATAGTAATAATACT GGAATGTAACAAAAATCTCACATAAGTGATTTATGCAATGATTATGATGTTACACTCACATAATGTAATATTACATT TTTCAATGAGTACATTCAAATGCGTCAAAAAAAATTTTAAGAGCATGAAAGTACAAAGGACTTACATAGCTCCAATG TTTTTACTACCCCCCAACAATTAGGGTGTAGTAAAAACAATTTGTTCTGCTTATTATTTACGACACTCAACCATACG TGGTCCATGCAGTTTAAAAACATAAGTTAAAAACATTAGCATGGACCGCAATGTGCGTTCAAAATGTCGATGTTCAT GTGTCCTGCAGTTCACACGATTTCACACAGTTAGCTGCGA上述引物由英濰捷基上海貿易有限公司合成，測序由上海鼎安生物科技有限公司 完成。實施例3複合PCR方法檢測檢測複合PCR反應體系為在0.9ml的PCR管中依次加入以下試劑DNA模板 Ι.Ομ 1 (由實施例1製得)，2XMaster PCR Mix 12. 5 μ 1 (萊楓生物科技有限公司提供)，實 施例2合成好的引物1上遊(SEQ ID NO 1)10 μ Μ、引物1下遊(SEQ ID NO :2) 10 μ Μ、引物2上遊(SEQ ID NO :3) 10 μ M、引物 2 下遊(SEQID NO :4) 10 μ M 各 0. 5ul，最後加 ddH20(雙蒸 滅菌水)補足25. 0μ 1反應體系。反應條件為，94°C預變性5min，94°C變性30seC、55°C退 火30sec、72°C延伸30sec共35個循環，72°C再延伸lOmin。PCR產物4°C保存，進行1. 5% 瓊脂糖凝膠(含5 μ g/ml EB (溴化乙錠))電泳。 實驗結果如圖1所示的第2條帶，測序均為目的條帶。圖1中，M為DNA分子量標 準；1為利什曼原蟲PCR結果；2為野外標本抽提DNA的PCR結果；3為實驗室白蛉和利什曼 原蟲混合樣本PCR結果；4為陰性對照。可見，圖1驗證了此實驗的可行性，過去媒介白蛉 的流行病學調查只能依靠現場解剖，對解剖標本的前處理也很繁瑣，本實驗可一次處理大 量樣本(96孔板PCR儀可一次性處理96隻白蛉)，採集標本後不用特殊處理，可直接抽提， 且對實驗人員沒有很高的要求，所以更利於普及，總耗時4個小時左右。白蛉活動範圍小， 飛行能力弱，隨著以藥物殺滅白蛉為防治的主要措施的實施，結合環境治理和個人防護達 到了較好的防治目的。所以目前現場的白蛉的前鞭毛體感染率很低，可以結合本實驗考慮 混合樣本抽提(10隻白蛉為一個樣本)，可以使現場操作更快捷。序列表
中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所
白蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒及檢測方法
NP-10-14384
4
1
22
DNA
人工序列

misc_feature
引物
1
cttttctggt cccgcgggta gc 22
2
22
DNA
人工序列

misc feature
引物
2
ccacctggcc tattttacac ca 22
3
20
DNA
人工序列misc_feature 引物3cctggttagt ttcttttcct ccgct 20421DNA人工序列misc_feature 引物4cgcagctaac tgtgtgaaat c2權利要求
一種白蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒，其特徵在於，包括下列組成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反應液包括雙蒸滅菌水、2×Master PCR mix和引物；所述引物含有兩對引物，引物1的序列為上遊5』 CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C 3』，其序列如SEQ ID NO1所示；下遊5』 CCA CCT GGC CTA TTT TAC ACC A 3』，其序列如SEQ ID NO2所示；引物2的序列為上遊5』 CCT GGT TAG TTT CTTTTC CTC CGC T 3』，其序列如SEQ ID NO3所示；下遊5』 CGC AGC TAA CTGTGT GAA ATC 3』，其序列如SEQ ID NO4所示。
2.如權利要求1所述的白蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒，其特徵在於，所述引物1特異 性擴增利什曼原蟲，所述引物2特異性擴增白蛉屬。
3.一種白蛉體內利什曼原蟲的檢測方法，其特徵在於，包含如下步驟(1)白蛉的抽提；(2)設計併合成如權利要求1所述的引物1和引物2；(3)將步驟(1)抽提得到的白蛉抽提液作為DNA模板進行複合PCR方法檢測；檢測復 合PCR反應體系為DNA模板，2 XMaster PCR mix，步驟(2)合成的引物1和引物2，雙蒸滅 菌水；(4)步驟(2)所得的PCR產物4°C保存，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權利要求3所述的白蛉體內利什曼原蟲的檢測方法，其特徵在於，步驟(2)中， 所述複合PCR反應條件為94°C預變性5min，94°C變性30sec、55°C退火30sec、72°C延伸 30sec共35個循環，72°C再延伸IOmin0
全文摘要
本發明公開了一種白蛉體內利什曼原蟲檢測試劑盒，包括下列組成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反應液包括雙蒸滅菌水、2×Master PCR mix和兩對引物；引物1的序列為上遊5』-CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3』；下遊5』-CCACCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3』；引物2的序列為上遊5』-CCT GGT TAG TTTCTT TTC CTC CGC T-3』；下遊5』-CGC AGC TAA CTG TGT GAA ATC-3』。此外，本發明還公開了白蛉體內利什曼原蟲的檢測方法。本發明的試劑盒敏感性高、特異性強、檢測方法簡單實用，對技術人員要求不高，為現場快速檢測白蛉體內的利什曼原蟲提供了新的檢測手段。
文檔編號C12Q1/04GK101921862SQ20101026824
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月1日 優先權日2010年9月1日
發明者周曉俊, 周曉農, 張儀, 顧燈安, 馬憲亮 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所