利用fca基因rna結構域轉基因改良作物經濟性狀的方法
2023-10-12 00:16:54 2
專利名稱：利用fca基因rna結構域轉基因改良作物經濟性狀的方法
技術領域：
本發明屬轉基因技術領域，具體涉及一種利用控制開花基因(FCA)的RNA結構域轉基因改良作物經濟性狀的方法。
背景技術：
目前國內外利用轉基因改良作物經濟性狀的技術與方法，主要是根據已知的功能基因與表型性狀的關係，採用組成型表達載體或組織專一性表達載體將目的基因導入目標植物，以期獲得作物特定經濟性狀或抗逆性性狀的改良。這一方法利用的基因都是來自天然的具有完整結構的基因序列或具有完整編碼順序的cDNA。採用天然基因的某一結構成分改良作物的經濟性狀目前尚無報導，對其所具有的潛力也未進行探討和評價。
本發明嘗試採用功能基因的某一結構域的編碼順序，利用轉基因方法將其克隆到表達載體，然後導入農作物細胞，以期獲得重要經濟性狀發生改良的轉基因再生植株。希望通過這一方法擴大功能基因轉基因的利用範圍，達到常規轉基因方法難以產生的在生產上可以利用的效果。
參考文獻(1)王關林，方宏筠植物基因工程的目的基因，in植物基因工程原理與技術，pp1-20，科學出版社，1998.
(2)Macknight，R.，Bancroft，I.，Page，T.，et al.(1997)FCA，a gene controlling floweringtime in Arabidopsis，encodes a protein containing RNA-binding domains.Cell.89737-745。
(3)Macknight，R.，Duroux，M.，Laurie，R.，et al.(2002)Functional significance of thealternative transcript processing of the Arabidopsis floral promoter FCA.Plant Cell.14877-888。
發明內容
本發明的目的在於提出一種利用基因片段或功能域轉化改良作物經濟性狀的轉基因方法。
本發明提出的改良作物經濟性狀的轉基因方法，是將全長基因所編碼的蛋白質中一個或幾個完整結構域的編碼順序進行克隆，並將其插入到植物轉基因表達載體的調控順序下遊，用於轉化目標植物。其中，基因片段轉化的程序與一般常用的方法相同，可以採用農桿菌介導轉化或基因槍微彈轟擊法轉化宿主細胞，在構建表達載體時需要保證結構域的翻譯讀框的正確，使其編碼的多肽鏈與天然的相對應的胺基酸順序相同。
本方法與經典的轉基因改良作物經濟性狀的不同之處在於，利用功能基因的某一結構域轉化目標植物，在組成型啟動子的控制下，基因功能域的表達也可以幹擾細胞內其它基因的表達模式，引起宏觀性狀的改變，可產生全長基因轉化所不能產生的大量表型變化，包括重要的經濟性狀。
本發明在對FCA基因功能的研究中，已證實該基因的突變和過表達僅與雙子葉擬南芥(Arabidopsis)的開花時期有關，尚無關於FCA三個結構域(RRM1，RRM2和WW)的獨立功能的報導。本發明實驗證實，FCA的RRM2功能域在獨立表達時具有除延遲開花以外的功能，可對植物形態發生特別是對籽粒形成與發育產生重要影響。RRM2所表現出來的這種功能可以用來改良農作物或經濟作物的許多重要經濟性狀。由於在雙子葉和單子葉植物中均存在FCA基因，並且該基因在雙子葉和單子葉植物中具有很高的保守性。因此這一方法對雙子葉和單子葉作物均有效果，即可以改良其它雙子葉和單子葉作物的經濟性狀，如增加果實重量，提高穀類作物如小麥，玉米，高粱，大麥的籽粒千粒重，提高棉花的纖維長度等，也可用於改變花卉的葉型和花朵形狀，提高觀賞價值，以及改變植物纖維的品質和產量。
本發明選擇水稻等的FCA進行了研究。發明人曾從水稻分化愈傷組織和未分化愈傷組織差減雜交庫(SSH)中分離到一個與雙子植物擬南芥控制開花的基因FCA(flowering controlactivator)同源的cDNA片段，然後根據搜尋到的水稻基因組順序進行基因註解。根據註解的全長cDNA設計PCR引物，從秈稻珍汕97三葉期幼苗葉組織mRNA提取物中分離與克隆到全長的cDNA，將其命名為rFCA(水稻開花控制基因)。
RT-PCR分析發現rFCA在水稻葉片組織中存在4種可變剪接cDNA序列，分別命名為rFCA-1、rFCA-2、rFCA-3和rFCA-4。rFCA的四個不同的可變剪接cDNA序列已在GenBank登錄，登錄號分別為AY274928，AY311343，AY311344，AY331574，並將它們依次命名為rFCA-1，rFCA-2，rFCA-3，和rFCA-4。
其中，rFCA-1的cDNA長度為2517bp，編碼738個胺基酸。它與擬南芥FCA-gamma具有很高的同源性。圖3表示的是rFCA-1基因結構及其蛋白質結構域，它具有與擬南芥FCA同樣的保守區段，它在胺基酸殘基122-207和214-302是RRM(RNA結合區)，分別記為RRM1和RRM2；胺基酸殘基610-642是WW-domain。通常情況下，RNA結合區周圍具有一些富含某些特殊胺基酸的區域，如Proline、Glycine、Glutamine、Serine等，這些區域有助於蛋白與目標RNA的互作。
本發明選擇水稻rFCA-1基因全長cDNA中覆蓋RRM2結構域的編碼順序，採用PCR方法將其擴增，然後按正確的翻譯讀框插入到植物轉基因表達載體pBI/520的EcoRI和BamHI位點之間。RRM2為RNA結合域，涉及到基因的轉錄後調控。在植物的不同種屬中，RRM2順序有很高的保守性，同一些基本的生物學過程的調控有關。由於插入的RRM2結構域處於組成型啟動子Act-1下遊，可在轉化細胞中過量表達，可幹擾或促進轉化植株的生長與發育。本發明採用的受體植株為粳稻品系中花11，這是國內水稻轉基因研究普遍使用的材料。經RRM2結構域轉化再生的中花11，經DNA分子檢測確定為陽性植株後，將其移載到田間。轉化的T0代植株成株後表現出莖杆粗硬，葉片厚實，顏色深綠，小穗(籽粒)增大等明顯的性狀改變。轉基因T1代的二葉期幼苗出現小苗粗壯，葉片增寬等特徵。
本發明中，所選用的rFCA-1基因的RRM2結構域長330bp，其DNA序列見SEQ.ID.NO3，其預期RRM2結構域翻譯產物為102個胺基酸多肽，其序列見SEQ.ID.NO4。
採用組成型啟動子和組織專一性啟動子控制水稻rFCA的RRM2區段的表達，可以達到有針對性提高產量的目的。
水稻rFCA結構域RRM與雙子葉植物擬南芥FCA結構域的對比見下表所示。顯示兩者之間存在很高的相似性。
Sequence 0擬南芥FCA結構域RRM1和RRM2Sequence 0水稻rFCA結構域RRM1(124-184 a.a)和RRM2(220-280 a.a)Sequence 0 121 182Sequence 1 123 184Sequence 0 183 244Sequence 1 185 246Sequence 0 245 306Sequence 1 247 307水稻rFCA結構域RRM編碼順序轉基因再生株和對照植株在相同培養和栽培條件下均可正常結實.轉基因植株的抽穗期較對照晚5-7天。在轉基因再生株和對照植株籽粒灌漿成熟後分別收集種子，在自然乾燥後稱重。RRM轉基因植株種子千粒重為38克，對照為22克，增重73％。轉基因T0代和對照種子的實物照片見圖1所示。
水稻rFCA結構域RRM編碼順序轉基因再生株和對照植株除了種子大小不同之外，株型和葉型及葉片質地也存在很大差異，主要表現在(1)葉片變寬縮短增厚；(2)葉色變為深綠色；(3)植株的莖杆變粗；(4)轉化株有效穗提高，無效分櫱減少。
對比見圖3所示。
圖1為本發明的轉基因To代和對照種子的實物照片。
圖2為RRM2轉基因再生植株(圖左)和對照中花11(圖右)株型照片比較。
圖3為rFCA結構域組圖示。
圖4為rFCA的RRM2結構域轉基因表達載體的物理圖。圖中除RRM2順序外，其它順序均與原載體pBI/520相同。其中載體名稱，pB1/520；ActI-5』，植物肌動蛋白基因啟動子順序；rFCA-RRM，水稻rFCA基因RRM結構域編碼順序；Pin2-3』，3』結尾順序；35S-5』，花揶菜病毒CMV啟動子；Bar，抗除草劑基因；Nos-3』，3』結尾順序。
具體實施例方式
下面以水稻為例，進一步描述本發明。
水稻rFCA基因RRM2結構域轉基因的方法與程序1、選擇rFCA全長cDNA中覆蓋RRM2結構域的區段SEQ.NO3，合成含有與表達載體多克隆位點EcoRI/BamHI匹配的接頭及RRM2兩側序列的引物，採用PCR方法將其擴增，並連接到表達載體pBI/520中(表達載體pBI/520由澳大利亞CAMBIA(Center of theApplication of Molecular Biology to International Agiculture)中心提供)。獲得rFCA-RRM表達載體pB1/520/rFCA-RRM。其物理圖譜見圖4所示。Act1為水稻肌動蛋白啟動子，控制基因組成型表達。Pin2-3為基因轉錄終止區，含轉錄終止信號。35S為來自花椰菜病毒的啟動子，Bar為抗除草劑基因。Nos為來自農桿菌Ti質粒的轉錄終止信號。XhoI、HindIII、EcoRI、BamHI、XbaI、PstI為限制性內切酶位點。rFCA-RRM2為插入的轉基因編碼順序，其兩側位點為EcoRI和BamHI。
2、誘導水稻愈上組織培養基(1)誘導及繼代培養基MS+2mg/L 2，4-D。
(2)高滲培養基MS+2mg/L 2，4-D+46.67g/L山梨醇+46.67g/L甘露醇。
(3)第一輪篩選培養基MS+2mg/L 2，4-D+30mg/L潮黴素。
(4)第二輪篩選培養基MS+2mg/L 2，4-D+50mg/L潮黴素。
(5)分化培養基MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+50mg/L潮黴素。
(6)生根壯苗培養基1/2 MS+0.1mg/L NAA說明(1)以上培養基均含30g/L蔗糖+2.5g/L agar，pH5.8(2)愈傷誘導、繼代、篩選培養條件為26-28℃暗培養，分化、生根壯苗為26-28℃及16小時光周期3、愈傷組織誘導與處理(1)取授粉後12-15天的未成熟種子，在無菌條件下，先用70％乙醇浸洗10min，轉入0.1％升汞浸泡20min，無菌水清洗3次。
(2)在無菌條件下剝離幼胚，接種於愈傷誘導培養基上，26-28℃暗培養約20天後切芽，繼代一次。
(3)在繼代培養基中挑選生長旺盛、淡黃色的愈傷約30-50塊(每塊3mm左右)，置於高滲培養基上中央，排成直徑約2.5cm的圓圈內，培養約4-5h後用於轉化。
4、基因槍轉化(1)基因槍從寧波新芝科技有限公司購置的高壓氣體基因槍，型號GJ-1000。
(2)微粒子彈製備①稱取60mg鎢粉(直徑約1um)，加入到1.5ml滅菌離心管中，再加入1ml無水乙醇，振蕩1min，於10000rpm離心10s，棄上清，重複洗一次後，將金粉懸浮於1ml無菌水中現用或-20℃保存。
②吸取50ul鎢粉懸浮液於1.5ml離心管，依次加入5ug DNA、50ul 2.5M CaCl2、20ul 0.1M亞精胺，振蕩5分鐘，10000rpm離心20s，棄上清，以140ul無水乙醇漂洗兩次，加入60ul無水乙醇，懸浮待用。
(3)轟擊受體材料①將基因槍放於超淨工作檯上，用70％酒精擦淨真空室，並將可裂膜、載粒膜、金屬擋網(均由寧波新芝科技有限公司供貨)於70％酒精中消毒30分鐘，然後用無菌濾紙吸乾或吹淨殘餘酒精。
②打開電源開關，真空泵及氦氣瓶閥。
③將可裂膜裝入固定、旋緊。
④取10ul包被DNA的鎢粉無水乙醇懸浮液，均勻塗布於載粒膜中心，放在超淨臺上吹乾。
⑤將載有微彈的載粒膜及擋網裝入微彈發射裝置，使有顆粒的一面朝下。
⑥將培養皿放在託盤上，使愈傷集中於培養皿中央。
⑦打開氣瓶，調節壓力1100Psi。
⑧抽真空，當真空度達到需要值時，將VAC鍵轉到Hold位置。
⑨轟擊，每皿轟擊2次(第一次轟擊後將培養皿旋轉90度後進行第二次轟擊)，按放氣鍵使真空表讀數回零，取出樣品，轟擊後於高滲培養基上繼續培養12-16h。
5、轉化愈傷組織篩選(1)將打槍後高滲培養基上的愈傷轉入不含篩選劑的誘導培養基上恢復生長5-7天。
(2)將愈傷轉到含30mg/L潮黴素的篩選培養基上，均勻擺放，暗培養14-17天進行第一次抗性篩選。
(3)將抗性愈傷轉入含50mg/L潮黴素的篩選培養基上，暗培養8-12天進行第二次抗性篩選。
6、水稻rFCA基因RRM2結構域轉化植株篩選與檢測(1)轉化試管苗分子檢測①將篩選後存活的愈傷於分化培養基上光照培養30天。
②待分化出小植株後，將小植株轉入生根壯苗培養基，長大後移入溫室。
7、轉化植株的分子檢測分別採用PCR擴增和基因組Southern雜交雜法檢測後選的轉化植株，共獲得兩株含有轉化的rFCA-RRM片段的陽性植株序列表SEQ.ID.NO1，rFCA-1的cDNA全序列如下1 gtgctctcgc aaaaccctag cccacctccc cctccaccca catgcaccgc ggcggcgacc61 gctccaccga cccctcctcc ggccccgcgc ccggttctcg cggcggcggg gacggccgat121 tcggccgcgg cccttctcgc tggtcgtccg gcggtggcgg cggcggtagc ggcagcccac181 cccaccgctt ctcccgtggt gggggtgggg gcggcggcga cggtggcgga ggcggaggtg241 gaggcgggag gttccacccg taccgtggcc cttcggacca ctccggcggc ggaggctaca301 gaagcggcgg cggcggcgag tacggggagc cgggtagcgg gccgagacac cgctacggca361 gtggccgtgg tgaccactca gatcatgata acagaaacaa ctatgttaaa ctttttattg421 ggtcagttcc aaggacagcg actgaggatg atgtacgtcc tttatttgag gagcatggag481 atgttgttga agttgctttg atcaaggata ggaagactgg tgaacagcaa ggttgttgtt541 ttgttaaata tgctacttct gaagaggctg agcgagccat cagagctctt cacaaccagt601 acactttacc tggggcaatg ggccctattc aagtcagata tgctgatggt gaaagggaac661 gccatggggc tattgagcac aagctgtttg tcgcatcact caataagcaa gctactgcga721 aggagattga agagattttt gcgccgtatg gtcatgtgga agatgtctac attatgaaag781 atggcatgag gcagagccga ggttgtggct ttgtcaaatt ctcatcacga gaaccggcgc841 tggcagccat gagtgctctg agtgggaatt atgtaatgag ggggtgcgag caaccattaa901 taattcggtt cgctgatcct aagagaccta gacctggaga atcaaggggt ggtcctgcat
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權利要求
1.一種改良作物經濟性狀的轉基因方法，其特徵在於將全長基因所編碼的蛋白質中一個或幾個結構域順序進行克隆，並將其插入到植物轉基因表達載體的調控順序下遊用於轉化目標作物，以獲得可利用的改良的經濟性狀.
2.根據權利要求1所述的改良作物經濟性狀的轉基因方法，其特徵在於用於轉基因的DNA順序為水稻開花控制基因rFCA表達產物全長cDNA中一個或幾個完整結構域編碼序列。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述開花控制基因rFC4全長cDNA中結構域為rFCA-1全長cDNA的RRM2結構域，其序列為SEQ.NO.3。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於具體步驟如下(1)選擇rFCA全長cDNA中覆蓋RRM2結構域的區段SEQ.NO3，合成含有與表達載體多克隆位點EcoRI/BamHI匹配的接頭及RRM2兩側序列的引物，採用PCR方法將其擴增，並連接到表達載體pBI/520中，獲得rFCA-RRM表達載體pBI/520/rFCA-RRM2；(2)水稻愈傷組織誘導與處理；(3)基因槍轉化；(4)轉化愈傷組織篩選；(5)水稻rFCA基因RRM2結構域轉化植株篩選與分子檢測。
全文摘要
本發明屬於基因技術領域，具體為一種利用控制開花基因FCA的RNA結構域轉基因改良作物經濟性狀的方法。具體是將FCA全長基因所編碼的蛋白質中一個或幾個完整結構域的編碼順序轉化目標植物。本發明將rFCA－1全長基因覆蓋的RRM2結構域區段，採用PCR方法將擴增，合成插入組成型表達載體pB1/520，並轉化粳稻品系中花11。轉基因的To植株及T1子代均表現出涉及株型、葉型、籽粒大小及重量的明顯改變。本發明可廣泛應用於雙子葉和單子葉作物的經濟性狀的改良。
文檔編號C12N15/63GK1614026SQ200410084319
公開日2005年5月11日 申請日期2004年11月18日 優先權日2004年11月18日
發明者楊金水 申請人:復旦大學